引用本文： 張琪, 楊光華, 劉少鵬, 張國志, 王長友. ADAM17-shRNA 通過 Akt/GSK3β 信號通路促進 HT29 結腸癌細胞的凋亡. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(5): 534-539. doi: 10.7507/1007-9424.201710044 復制
結腸癌是一種預后較差且發病率逐年上升的惡性腫瘤，分別位列男性和女性惡性腫瘤的第 3 位和第 2 位[1-2]。沉默解聚素-金屬蛋白酶 17（ADAM17）又稱腫瘤壞死因子 α 轉換酶（TACE）[3]。研究表明，ADAM17 蛋白可以通過發揮水解剪切酶類的作用，在腫瘤的發生和發展方面發揮重要作用[4]，且對腫瘤患者的生存預后有一定的提示作用[5]，但具體機制尚不清楚。腫瘤細胞的無限增殖意味著抗凋亡的發生。因此，本研究通過抑制 HT29 結腸癌細胞中 ADAM17 蛋白的表達，探討其對腫瘤細胞增殖和凋亡的抑制作用及其可能的機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
HT29 人結腸癌細胞株購自中國科學院干細胞庫，保存于華北理工大學醫學研究中心。重組慢病毒 ADAM17-hsa-1658 購于上海吉瑪公司。主要試劑：DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）及胰酶（美國 Gibco 公司）；TRIzol 試劑盒、Go ScriptTM逆轉錄試劑盒及實時熒光定量 PCR（real-time PCR）試劑盒（美國 Invitrogen 公司）；ADAM17 蛋白抗體（美國 abcam 公司）；其他蛋白抗體，包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase3）、磷酸化蛋白激酶 B（P-Akt）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（P-GSK3β）、糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）和 Annexin-V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（美國 Sigma 公司）；HR 標記的山羊抗兔 IgG 二抗、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑盒及 DAB 顯影液（上海碧云天生物技術研究所）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟化物（PMSF）及十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。主要設備：iMark 酶標儀、DYC-Mini1 電泳儀及 DYC-ZY2 濕轉系統（上海 BIO-RAD 公司）；FACS Calibuar 流式細胞儀（美國 BD 公司）；QuantStudioTM 12K Flex 實時熒光定量 PCR 儀（美國 Applied BiosystemsTM公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
HT29 人結腸癌細胞用含 10% FBS 的 DMEM 培養基，在 5% CO2、37.0 ℃ 條件下的孵育箱中培養，每 2 天傳代 1 次。
1.2.2 重組慢病毒載體的構建
ADAM17 小干擾 RNA（ADAM17-shRNA）和無意義序列小干擾 RNA（即陰性對照 shRNA）由上海吉瑪公司合成，ADAM17-shRNA 的序列為 5′-GCATCATGT-ATCTGAACAACG-3′，無意義 shRNA 的序列為 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。慢病毒和 shRNA 的連接由上海吉瑪公司代為完成。
1.2.3 細胞分組
將細胞分為 3 組：干擾組、陰性對照組和空白對照組。干擾組細胞轉染ADAM17 重組慢病毒載體，陰性對照組細胞轉染陰性對照重組慢病毒載體，空白對照組加入等量的 PBS 溶液。轉染根據試劑盒說明書進行，根據預實驗將感染復數（MOI）值設定為 100。轉染 48 h 后在熒光顯微鏡下觀察，根據熒光強度和數量判斷轉染效果。轉染成功后 24 h 進行指標檢測。
1.2.4 Anneixin-V-FITC/PI 染色法檢測細胞凋亡率
取對數生長期細胞，制備成單細胞懸液，按每孔約 1×105個細胞接種于 6 孔板中，加入 2 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培養基，在 37 ℃、5% CO2 條件下培養 48 h 后，以胰酶消化，離心 5 min（1 000 r/min，r=9.5 cm），棄上清。以 PBS 液重懸細胞，離心 5 min（1 000 r/min，r=9.5 cm），棄上清。加入 185 μL Annexin V-FITC 結合液重懸細胞后，再加入 5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI 染色液混勻。室溫避光孵育 10 min，1 h 內進行流式細胞儀檢測分析，以右象限凋亡細胞的含量合計為凋亡細胞數。實驗重復 3 次，取均值。
1.2.5 MTT 法檢測細胞增殖
取對數生長期的 HT29 細胞制備成單細胞懸液，接種于 96 孔板上（每孔接種量為 1×103個細胞），每個時點均設 8 個復孔。分別于培養 24、48 及 72 h 時，每孔加入 MTT 20 μL，于 37 ℃ 培養箱中培養 4 h 后，在避光的情況下用 200 μL 二甲基亞砜（DMSO）替換掉原培養液，再在 37 ℃ 培養箱中反應 15 min 后，使用酶標儀在 570 nm 波長條件下檢測各孔的吸光度值（A值）。因 A 值與孔內存活細胞數呈正比，故用 A 值表示細胞的增殖能力。實驗獨立重復 3 次，取均值。
1.2.6 實時熒光定量 PCR 法檢測 ADAM17 mRNA 的表達
取對數生長期細胞，制備成單細胞懸液，按每孔約 1×106個細胞接種于 6 孔板中。轉染成功后 48 h，以 TRIzol 法提取細胞 RNA。通過 Go ScriptTM逆轉錄試劑盒將 RNA 反轉錄為 cDNA，然后進行 qRT-PCR。引物序列由 Invitrogen 生物公司合成，設計如下。ADAM17 基因：5′-ATCAAACC- TTTCCTGCG-3′（正義鏈），5′-CAAACCCAT- CCTCGTCCA-3′（反義鏈），擴增產物長度為 154 bp；內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）：5′-GAAG- GTGAAGGTCGGAGTC-3′（正義鏈），5′-GAAGA- TGGTGATGGGATTTC-3′（反義鏈），擴增產物長度為 154 bp。PCR 條件：95 ℃ 變性 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；總共 40 個循環。PCR 反應體系為 20 μL 體系，具體見試劑盒說明書。采用 2-△△CT法計算 ADAM17 mRNA 的表達水平。實驗重復 3 次，取均值。
1.2.7 Western blot 法檢測相關蛋白的表達
取對數生長期細胞，制備成單細胞懸液，按每孔約 1×106個細胞接種于 6 孔板中，取 3 組轉染后 48 h 的細胞以 RIPA 裂解液裂解，4 ℃ 離心（12 000 r/min，r=8 cm）15 min 以收集蛋白。以 BCA 法定量總蛋白，加入等體積的 2×蛋白上樣緩沖液后 100℃ 變性5 min，–80 ℃ 保存備用。進行 SDS-PAGE 蛋白電泳，再分別進行轉膜（90 V、90 min）、10% 脫脂奶封閉、一抗孵育過夜（1∶1 000）、二抗（1∶100）37 ℃ 孵育 2 h 及熒光顯色。以 Image J 軟件分析各條帶的灰度值，相關蛋白的表達水平=（所測蛋白條帶的灰度值/內參條帶的灰度值）×100%。實驗重復 3 次，取均值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，統計方法采用單因素方差分析。首先進行方差齊性的檢驗，若方差齊，采用 LSD 法；若方差不齊，則采用近似方差分析的 Brown-Forsythe 法進行校正。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 轉染效果
干擾組轉染 48 h 后在熒光顯微鏡下觀察，可見熒光率達到 90% 以上（圖 1）。
圖1
示干擾組 HT29 細胞轉染 48 h 后的轉染效果（×200）
a：透光顯微鏡圖片；b：熒光顯微鏡圖片；c：合成圖片
2.2 3 組細胞的凋亡率比較
通過 Anneixin-V-FITC/PI 試劑盒檢測細胞凋亡率，結果顯示，沉默 ADAM17 基因后，與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組細胞的凋亡率均較低（P<0.05），但空白對照組和陰性對照組的凋亡率比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 2和圖 3。
圖4
示 3 組細胞的 A 值變化
同時點干擾組與空白對照組和陰性對照組比較，差異均有統計學意義（
圖5
示 3 組細胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表達
a：ADAM17 mRNA 的相對表達水平；b：ADAM17 蛋白表達的電泳圖；c：ADAM17 蛋白的相對表達水平；與空白對照組比較，*
2.3 3 組細胞的細胞增殖能力比較
MTT 結果顯示，在培養 72 h 期間，3 組細胞的 A 值均有所增加。與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組的 A 值增加得較快，但空白對照組和陰性對照組的 A 值增長曲線幾乎重疊、差距很小。在 24、48 及 72 h 時，同時點與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組細胞的 A 值均較高（P<0.05），但同時點空白對照組和陰性對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1 和圖 4。
表1
3 組細胞不同時點的 A 值（
）
圖3
示 3 組細胞的凋亡率比較
與空白對照組比較，*
2.4 3 組細胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表達
與干擾組比較，陰性對照組和空白對照組細胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表達水平均較高（P<0.01），但陰性對照組和空白對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 5。
圖2
示 3 組細胞凋亡率檢測的流式細胞圖
a：空白對照組；b：陰性對照組；c：干擾組
2.5 3 組細胞中凋亡蛋白 caspase3 蛋白的表達
Western blot 結果顯示，與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組細胞中 caspase3 蛋白的表達水平均較低（P<0.01），但空白對照組和陰性對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 6。
圖6
示 3 組細胞中 caspase3 蛋白的表達
a：蛋白表達的電泳圖；b：蛋白的相對表達水平；與空白對照組比較，*
2.6 3 組細胞中 Akt/GSK3β 通路蛋白的表達
在驗證了細胞發生凋亡以后，筆者繼續檢測了 Akt/GSK3β 通路蛋白的表達，結果顯示，與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組中 P-Akt 蛋白和P-GSK3β 蛋白的表達水平均較高（P<0.01），但空白對照組和陰性對照組的 P-Akt 蛋白和 P-GSK3β 蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）；3 組細胞中 Akt 蛋白和 GSK3β 蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 7。
圖7
示 3 組細胞中 Akt/GSK3β 通路蛋白的表達
a：各蛋白表達的電泳圖；b：各蛋白的相對表達水平；與空白對照組比較，*
3 討論
結腸癌是由遺傳、環境、飲食、習慣、暴露等多種因素協同作用的結果[6]。近年來隨著我國飲食結構的改變，結腸癌在我國的發病率逐年上升[1]。除了傳統的手術切除及同步放化療治療以外，人們現在的目光越來越集中在基于特定基因或功能蛋白的靶向治療上[7]。
既往報道[5, 8-9]指出，ADAM17 蛋白具有水解蛋白、活化配體及釋放生物活性因子的功能，在胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中異常高表達。已有文獻報道[10-11]指出，ADAM17 蛋白在結腸癌組織中呈明顯異常高表達狀態，并與結腸癌的轉移、預后等密切相關。有研究[12-14]報道，ADAM17 蛋白可以通過 Notch、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/Akt 等多條信號通路調控腫瘤細胞的生物學行為。因此，ADAM17 分子在結腸癌的靶向治療上極有潛力。
腫瘤的無限增殖和凋亡激活受阻是腫瘤惡性生物學行為的根本所在，因此誘導細胞凋亡現已成為大多數化療藥物的主要研究靶點。caspase3 是效應凋亡蛋白酶（effector caspases）家族中的最重要的凋亡執行者之一，在細胞凋亡途徑中居中心地位[15]。caspase3 蛋白一旦被激活，通過下游級聯反應，破壞細胞結構和關鍵蛋白質，使細胞凋亡進入不可逆階段[16-17]。在本次實驗中，在沉默了 ADAM17 基因后 caspase3 蛋白的表達被明顯激活，說明沉默 ADAM17 基因能夠激活細胞的凋亡系統。
Akt 信號轉導通路是一個重要的生命信號通路，在細胞的增殖中發揮重要作用，Akt 的持續活化與腫瘤的發生發展密切相關[18-19]。在前期研究[20]中，筆者發現，沉默 ADAM17 基因可以通過表皮生長因子受體（EGFR）/PI3K/Akt 通路影響乳腺癌細胞的生物學行為。Akt/GSK3β 作為下游信號通路，與腫瘤細胞的生長和增殖密切相關[21-22]，P-Akt 減少可以使 GSK3β 磷酸化水平下降，導致 GSK3β 失活減少[23-24]，而 Akt/GSK3β 信號通路一旦受到抑制，便有可能發揮抗腫瘤效應[25]。因此筆者推測，ADAM17 基因可能會通過 Akt/GSK3β 通路發揮作用。在沉默 ADAM17 基因后，筆者發現，GSK3β和Akt 的活化產物——P-GSK3β及P-Akt 的表達水平均明顯降低，因此推測沉默 ADAM17 基因可能通過抑制 Akt/GSK3β 通路的激活，來抑制細胞增殖，調控細胞凋亡。
本次實驗結果表明，沉默 ADAM17 基因能夠通過 Akt/GSK3β 信號轉導通路調控 GSK3β 蛋白的活化，進而誘導細胞凋亡，實現對 HT29 結腸癌細胞增殖的調控作用，但 Akt/GSK3β 信號轉導通路可能不是其誘導凋亡、抑制腫瘤細胞生長的唯一信號通路，其對凋亡的影響和具體作用機制需后續實驗進一步探究。
結腸癌是一種預后較差且發病率逐年上升的惡性腫瘤，分別位列男性和女性惡性腫瘤的第 3 位和第 2 位[1-2]。沉默解聚素-金屬蛋白酶 17（ADAM17）又稱腫瘤壞死因子 α 轉換酶（TACE）[3]。研究表明，ADAM17 蛋白可以通過發揮水解剪切酶類的作用，在腫瘤的發生和發展方面發揮重要作用[4]，且對腫瘤患者的生存預后有一定的提示作用[5]，但具體機制尚不清楚。腫瘤細胞的無限增殖意味著抗凋亡的發生。因此，本研究通過抑制 HT29 結腸癌細胞中 ADAM17 蛋白的表達，探討其對腫瘤細胞增殖和凋亡的抑制作用及其可能的機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
HT29 人結腸癌細胞株購自中國科學院干細胞庫，保存于華北理工大學醫學研究中心。重組慢病毒 ADAM17-hsa-1658 購于上海吉瑪公司。主要試劑：DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）及胰酶（美國 Gibco 公司）；TRIzol 試劑盒、Go ScriptTM逆轉錄試劑盒及實時熒光定量 PCR（real-time PCR）試劑盒（美國 Invitrogen 公司）；ADAM17 蛋白抗體（美國 abcam 公司）；其他蛋白抗體，包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase3）、磷酸化蛋白激酶 B（P-Akt）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（P-GSK3β）、糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）和 Annexin-V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（美國 Sigma 公司）；HR 標記的山羊抗兔 IgG 二抗、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑盒及 DAB 顯影液（上海碧云天生物技術研究所）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟化物（PMSF）及十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。主要設備：iMark 酶標儀、DYC-Mini1 電泳儀及 DYC-ZY2 濕轉系統（上海 BIO-RAD 公司）；FACS Calibuar 流式細胞儀（美國 BD 公司）；QuantStudioTM 12K Flex 實時熒光定量 PCR 儀（美國 Applied BiosystemsTM公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
HT29 人結腸癌細胞用含 10% FBS 的 DMEM 培養基，在 5% CO2、37.0 ℃ 條件下的孵育箱中培養，每 2 天傳代 1 次。
1.2.2 重組慢病毒載體的構建
ADAM17 小干擾 RNA（ADAM17-shRNA）和無意義序列小干擾 RNA（即陰性對照 shRNA）由上海吉瑪公司合成，ADAM17-shRNA 的序列為 5′-GCATCATGT-ATCTGAACAACG-3′，無意義 shRNA 的序列為 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。慢病毒和 shRNA 的連接由上海吉瑪公司代為完成。
1.2.3 細胞分組
將細胞分為 3 組：干擾組、陰性對照組和空白對照組。干擾組細胞轉染ADAM17 重組慢病毒載體，陰性對照組細胞轉染陰性對照重組慢病毒載體，空白對照組加入等量的 PBS 溶液。轉染根據試劑盒說明書進行，根據預實驗將感染復數（MOI）值設定為 100。轉染 48 h 后在熒光顯微鏡下觀察，根據熒光強度和數量判斷轉染效果。轉染成功后 24 h 進行指標檢測。
1.2.4 Anneixin-V-FITC/PI 染色法檢測細胞凋亡率
取對數生長期細胞，制備成單細胞懸液，按每孔約 1×105個細胞接種于 6 孔板中，加入 2 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培養基，在 37 ℃、5% CO2 條件下培養 48 h 后，以胰酶消化，離心 5 min（1 000 r/min，r=9.5 cm），棄上清。以 PBS 液重懸細胞，離心 5 min（1 000 r/min，r=9.5 cm），棄上清。加入 185 μL Annexin V-FITC 結合液重懸細胞后，再加入 5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI 染色液混勻。室溫避光孵育 10 min，1 h 內進行流式細胞儀檢測分析，以右象限凋亡細胞的含量合計為凋亡細胞數。實驗重復 3 次，取均值。
1.2.5 MTT 法檢測細胞增殖
取對數生長期的 HT29 細胞制備成單細胞懸液，接種于 96 孔板上（每孔接種量為 1×103個細胞），每個時點均設 8 個復孔。分別于培養 24、48 及 72 h 時，每孔加入 MTT 20 μL，于 37 ℃ 培養箱中培養 4 h 后，在避光的情況下用 200 μL 二甲基亞砜（DMSO）替換掉原培養液，再在 37 ℃ 培養箱中反應 15 min 后，使用酶標儀在 570 nm 波長條件下檢測各孔的吸光度值（A值）。因 A 值與孔內存活細胞數呈正比，故用 A 值表示細胞的增殖能力。實驗獨立重復 3 次，取均值。
1.2.6 實時熒光定量 PCR 法檢測 ADAM17 mRNA 的表達
取對數生長期細胞，制備成單細胞懸液，按每孔約 1×106個細胞接種于 6 孔板中。轉染成功后 48 h，以 TRIzol 法提取細胞 RNA。通過 Go ScriptTM逆轉錄試劑盒將 RNA 反轉錄為 cDNA，然后進行 qRT-PCR。引物序列由 Invitrogen 生物公司合成，設計如下。ADAM17 基因：5′-ATCAAACC- TTTCCTGCG-3′（正義鏈），5′-CAAACCCAT- CCTCGTCCA-3′（反義鏈），擴增產物長度為 154 bp；內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）：5′-GAAG- GTGAAGGTCGGAGTC-3′（正義鏈），5′-GAAGA- TGGTGATGGGATTTC-3′（反義鏈），擴增產物長度為 154 bp。PCR 條件：95 ℃ 變性 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；總共 40 個循環。PCR 反應體系為 20 μL 體系，具體見試劑盒說明書。采用 2-△△CT法計算 ADAM17 mRNA 的表達水平。實驗重復 3 次，取均值。
1.2.7 Western blot 法檢測相關蛋白的表達
取對數生長期細胞，制備成單細胞懸液，按每孔約 1×106個細胞接種于 6 孔板中，取 3 組轉染后 48 h 的細胞以 RIPA 裂解液裂解，4 ℃ 離心（12 000 r/min，r=8 cm）15 min 以收集蛋白。以 BCA 法定量總蛋白，加入等體積的 2×蛋白上樣緩沖液后 100℃ 變性5 min，–80 ℃ 保存備用。進行 SDS-PAGE 蛋白電泳，再分別進行轉膜（90 V、90 min）、10% 脫脂奶封閉、一抗孵育過夜（1∶1 000）、二抗（1∶100）37 ℃ 孵育 2 h 及熒光顯色。以 Image J 軟件分析各條帶的灰度值，相關蛋白的表達水平=（所測蛋白條帶的灰度值/內參條帶的灰度值）×100%。實驗重復 3 次，取均值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，統計方法采用單因素方差分析。首先進行方差齊性的檢驗，若方差齊，采用 LSD 法；若方差不齊，則采用近似方差分析的 Brown-Forsythe 法進行校正。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 轉染效果
干擾組轉染 48 h 后在熒光顯微鏡下觀察，可見熒光率達到 90% 以上（圖 1）。
圖1
示干擾組 HT29 細胞轉染 48 h 后的轉染效果（×200）
a：透光顯微鏡圖片；b：熒光顯微鏡圖片；c：合成圖片
2.2 3 組細胞的凋亡率比較
通過 Anneixin-V-FITC/PI 試劑盒檢測細胞凋亡率，結果顯示，沉默 ADAM17 基因后，與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組細胞的凋亡率均較低（P<0.05），但空白對照組和陰性對照組的凋亡率比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 2和圖 3。
圖4
示 3 組細胞的 A 值變化
同時點干擾組與空白對照組和陰性對照組比較，差異均有統計學意義（
圖5
示 3 組細胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表達
a：ADAM17 mRNA 的相對表達水平；b：ADAM17 蛋白表達的電泳圖；c：ADAM17 蛋白的相對表達水平；與空白對照組比較，*
2.3 3 組細胞的細胞增殖能力比較
MTT 結果顯示，在培養 72 h 期間，3 組細胞的 A 值均有所增加。與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組的 A 值增加得較快，但空白對照組和陰性對照組的 A 值增長曲線幾乎重疊、差距很小。在 24、48 及 72 h 時，同時點與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組細胞的 A 值均較高（P<0.05），但同時點空白對照組和陰性對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1 和圖 4。
表1
3 組細胞不同時點的 A 值（
）
圖3
示 3 組細胞的凋亡率比較
與空白對照組比較，*
2.4 3 組細胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表達
與干擾組比較，陰性對照組和空白對照組細胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表達水平均較高（P<0.01），但陰性對照組和空白對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 5。
圖2
示 3 組細胞凋亡率檢測的流式細胞圖
a：空白對照組；b：陰性對照組；c：干擾組
2.5 3 組細胞中凋亡蛋白 caspase3 蛋白的表達
Western blot 結果顯示，與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組細胞中 caspase3 蛋白的表達水平均較低（P<0.01），但空白對照組和陰性對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 6。
圖6
示 3 組細胞中 caspase3 蛋白的表達
a：蛋白表達的電泳圖；b：蛋白的相對表達水平；與空白對照組比較，*
2.6 3 組細胞中 Akt/GSK3β 通路蛋白的表達
在驗證了細胞發生凋亡以后，筆者繼續檢測了 Akt/GSK3β 通路蛋白的表達，結果顯示，與干擾組比較，空白對照組和陰性對照組中 P-Akt 蛋白和P-GSK3β 蛋白的表達水平均較高（P<0.01），但空白對照組和陰性對照組的 P-Akt 蛋白和 P-GSK3β 蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）；3 組細胞中 Akt 蛋白和 GSK3β 蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 7。
圖7
示 3 組細胞中 Akt/GSK3β 通路蛋白的表達
a：各蛋白表達的電泳圖；b：各蛋白的相對表達水平；與空白對照組比較，*
3 討論
結腸癌是由遺傳、環境、飲食、習慣、暴露等多種因素協同作用的結果[6]。近年來隨著我國飲食結構的改變，結腸癌在我國的發病率逐年上升[1]。除了傳統的手術切除及同步放化療治療以外，人們現在的目光越來越集中在基于特定基因或功能蛋白的靶向治療上[7]。
既往報道[5, 8-9]指出，ADAM17 蛋白具有水解蛋白、活化配體及釋放生物活性因子的功能，在胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中異常高表達。已有文獻報道[10-11]指出，ADAM17 蛋白在結腸癌組織中呈明顯異常高表達狀態，并與結腸癌的轉移、預后等密切相關。有研究[12-14]報道，ADAM17 蛋白可以通過 Notch、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/Akt 等多條信號通路調控腫瘤細胞的生物學行為。因此，ADAM17 分子在結腸癌的靶向治療上極有潛力。
腫瘤的無限增殖和凋亡激活受阻是腫瘤惡性生物學行為的根本所在，因此誘導細胞凋亡現已成為大多數化療藥物的主要研究靶點。caspase3 是效應凋亡蛋白酶（effector caspases）家族中的最重要的凋亡執行者之一，在細胞凋亡途徑中居中心地位[15]。caspase3 蛋白一旦被激活，通過下游級聯反應，破壞細胞結構和關鍵蛋白質，使細胞凋亡進入不可逆階段[16-17]。在本次實驗中，在沉默了 ADAM17 基因后 caspase3 蛋白的表達被明顯激活，說明沉默 ADAM17 基因能夠激活細胞的凋亡系統。
Akt 信號轉導通路是一個重要的生命信號通路，在細胞的增殖中發揮重要作用，Akt 的持續活化與腫瘤的發生發展密切相關[18-19]。在前期研究[20]中，筆者發現，沉默 ADAM17 基因可以通過表皮生長因子受體（EGFR）/PI3K/Akt 通路影響乳腺癌細胞的生物學行為。Akt/GSK3β 作為下游信號通路，與腫瘤細胞的生長和增殖密切相關[21-22]，P-Akt 減少可以使 GSK3β 磷酸化水平下降，導致 GSK3β 失活減少[23-24]，而 Akt/GSK3β 信號通路一旦受到抑制，便有可能發揮抗腫瘤效應[25]。因此筆者推測，ADAM17 基因可能會通過 Akt/GSK3β 通路發揮作用。在沉默 ADAM17 基因后，筆者發現，GSK3β和Akt 的活化產物——P-GSK3β及P-Akt 的表達水平均明顯降低，因此推測沉默 ADAM17 基因可能通過抑制 Akt/GSK3β 通路的激活，來抑制細胞增殖，調控細胞凋亡。
本次實驗結果表明，沉默 ADAM17 基因能夠通過 Akt/GSK3β 信號轉導通路調控 GSK3β 蛋白的活化，進而誘導細胞凋亡，實現對 HT29 結腸癌細胞增殖的調控作用，但 Akt/GSK3β 信號轉導通路可能不是其誘導凋亡、抑制腫瘤細胞生長的唯一信號通路，其對凋亡的影響和具體作用機制需后續實驗進一步探究。
