引用本文： 宋禮坡, 張建, 谷涌泉, 陳兵, 郭連瑞, 王春梅, 吳英鋒, 羅濤, 崔世軍, 汪忠鎬. 低氧培養增強骨髓源內皮祖細胞的增殖、黏附、遷移和生存能力. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(5): 528-533. doi: 10.7507/1007-9424.201710088 復制
內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一類能增殖并分化為成熟的有功能的內皮細胞的前體細胞。1997年，EPC被成功地從外周血分離并證明其能夠整合進血管新生的“活躍點”[1]，還能夠增強缺血組織的側支血管生長，所以在細胞移植治療缺血性血管疾病的過程中EPC是一個非常合適的候選者，其目前已成為心血管缺血性疾病的重要靶點[2]。但是已知的動脈硬化相關危險因素對EPC產生負性影響，比如糖尿病、高血脂、吸煙等均會使EPC功能受抑制[3-6]，如何提高受損EPC的功能是目前研究熱點。研究干細胞的微環境為我們提供了一個重要的思路，干細胞生存在一個包含多種細胞和分子成分的三維微環境空間里[7]。氧分子是這個微環境中一個非常重要的因子，不僅直接參加細胞的生理代謝，同時也是重要的信號分子，其已被證實多數干細胞（包括EPC）生存在一個相對低氧的微環境里面[8-9]。但當前國內外關于干細胞（包括EPC）的體外研究多采用21%的自然氧濃度培養環境，所提供的培養環境與生物體內微環境顯然不同，必然對干細胞的增殖、分化等產生一定的影響，所以只有提供接近體內生存微環境的培養條件，才能夠得出更加準確可靠的實驗數據，進而提高干細胞移植的臨床療效。本研究設計體外誘導分化、擴增骨髓來源的EPC，在不同氧濃度下進行培養，觀察不同氧濃度對骨髓源EPC增殖、黏附、遷移、生存能力等這些與血管新生相關的生物學特性的影響，為提高干細胞移植治療缺血性心血管疾病的臨床療效提供一定的研究基礎。
1 材料與方法
1.1 骨髓源EPC的獲取、體外誘導、培養及擴增
SD大鼠，25只，雄性，體質量 200～250 g，北京維通利華實驗動物有限公司提供。骨髓源EPC的獲取、體外誘導、培養及擴增具體方法參考文獻[10]。于大鼠腹腔內注射10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）深度麻醉后斷頭處死，放入75%乙醇內浸泡15 min后剪取股骨和脛骨；離斷兩端骨骺，用預冷至4 ℃的 PBS 溶液5～10 mL沖洗骨髓腔直至骨變白及沖洗液清亮。應用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，接種于預先用纖維連接蛋白鋪底的 25 cm2培養瓶內，培養瓶內加入EBM-2完全培養基，置于37 ℃細胞培養箱中培養，48 h后輕輕換液，棄去未貼壁細胞，以后每隔2 d更換培養液。每天于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，觀察7～8 d。
1.2 骨髓源EPC的鑒定
細胞培養至第7～8天時，采用功能鑒定方法，用乙酰化的低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）和異硫氰酸熒光素-荊豆凝集素-Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ）進行雙陽性鑒定。在熒光顯微鏡下觀察細胞，用510 nm激發光激發Dil，用488 nm激發光激發FITC。熒光染色雙陽性細胞被認為是正在分化中的EPC。
1.3 檢測不同氧濃度對EPC增殖、黏附、遷移和生存能力的影響
將上面鑒定的EPC計數分組并分別置入不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中繼續培養和觀察。于不同氧濃度下培養至第3天和第7天時嚴格按照細胞增殖實驗試劑盒（Molecular Probes Inc.，美國）、細胞黏附實驗試劑盒（Molecular Probes Inc.，美國）、細胞遷移實驗試劑盒（Platypus Technologies，美國）、細胞凋亡和死亡實驗試劑盒（Molecular Probes Inc.，美國）的操作說明對EPC增殖、黏附、遷移和生存（抗凋亡和抗死亡）能力進行測定，結果分別用吸光度值、黏附細胞百分比、遷移細胞數量以及生存細胞百分比表示。① 吸光度值計算：每個氧濃度環境下在培養板上設置 6 個培養孔，每個孔測量 3 次，然后取 6 個培養孔的平均值進行統計分析。② 黏附細胞百分比計算：每個氧濃度環境下，將等量 EPC 置入培養板的培養孔中，立即隨機取 10 個高倍鏡視野進行計數，取平均值作為分母，然后過 3 h后，PBS液沖洗，再取 10 個高倍鏡視野進行黏附的細胞計數，取平均值作為分子，最后計算公式為：黏附細胞百分比=黏附細胞數/總細胞數×100%。③ 遷移細胞數量計算：每個氧濃度環境下在試劑盒提供的培養板上設置 6 個培養孔，每個培養孔計數遷移的細胞數 3 次，然后取 6 個培養孔的平均值進行統計分析。④ 生存細胞百分比計算：每個氧濃度環境下，隨機取 10 個視野，生存細胞百分比=生存細胞數/（生存細胞數+死亡細胞數+凋亡細胞數）×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計分析軟件對數據進行分析。連續變量統計指標用均數±標準差（
±s）表示，對各組資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，若滿足正態分布和方差齊性，則各組之間相互比較采用方差分析方法（LSD 檢驗）；二分類變量統計指標表達為百分比，統計檢驗方法采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 骨髓源EPC體外誘導、培養及擴增結果
新分離的大鼠骨髓單個核細胞呈圓形，大小不一。細胞培養至第 3 天時，可見細胞開始貼壁，由圓形逐漸伸展開，呈長梭形、三角形、紡錘形或不規則形，并呈集落樣生長（圖1a），此后細胞進入對數生長期，生長旺盛。培養至第 7～8 天時，細胞逐漸成鋪路卵石樣單層排列，約80%鋪滿（圖1b）。
圖1
示培養至不同時相時細胞生長情況（倒置相差顯微鏡 ×100）
a：第3天時細胞呈長梭形、三角形（綠箭示細胞集落）；b：第7天時細胞呈鋪路卵石樣單層排列，約80%鋪滿
2.2 骨髓源EPC的鑒定結果
細胞在培養至第7～8天時，用Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙陽性鑒定結果（圖2）顯示，熒光染色雙陽性細胞約占細胞總數的98%以上。
圖2
Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙陽性鑒定EPC結果（熒光顯微鏡 ×200）
a：Dil-Ac-LDL 攝取實驗；b：FITC-UEA-Ⅰ結合實驗；c：雙熒光染色陽性細胞
2.3 不同氧濃度對EPC增殖能力的影響
EPC在不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中培養至第3天時，在1%和5%氧濃度下的吸光度值明顯高于在21%氧濃度下的（P<0.001、P<0.001），在5%氧濃度下的吸光度值明顯高于在1%氧濃度下的（P<0.001）；培養至第7天時，在1%和5%氧濃度下的吸光度值均明顯高于在21%氧濃度下的（P<0.001、P<0.001），在1%和5%氧濃度下的吸光度值比較差異無統計學意義（P=0.174）。見表1。
表1
不同氧濃度對EPC增殖能力（吸光度值）的影響（
）
2.4 不同氧濃度對EPC黏附能力的影響
EPC在不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中培養至第3天時，在1%和5%氧濃度下的黏附能力均明顯強于在21%氧濃度下的（P<0.001、P<0.001），但在1%和5%氧濃度下的黏附能力比較差異無統計學意義（P=0.655）。培養至第7天時，在1%和5%氧濃度下的黏附能力均明顯強于在21%氧濃度下的（P<0.001、P<0.001），在1%氧濃度下的黏附能力明顯強于在5%氧濃度下的（P=0.017）。見表2。
表2
不同氧濃度對EPC黏附能力（黏附細胞百分比）的影響（%）
2.5 不同氧濃度對EPC遷移能力的影響
EPC在不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中培養至第3天和第7天時，在1%和5%氧濃度下的遷移能力均明顯強于在21%氧濃度下的（第3天：P<0.001、P<0.001；第7天：P<0.001、P<0.001），在1%氧濃度下的遷移能力明顯強于在5%氧濃度下的（第3天：P<0.001；第7天：P<0.001）。見表3。
表3
不同氧濃度對EPC遷移能力（細胞數目）的影響（×103，
）
2.6 不同氧濃度對EPC生存能力的影響
EPC在不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中培養至第3天和第7天時，在1%和5%氧濃度下的生存能力明顯強于21%氧濃度下的（第3天：P<0.001、P=0.010；第7天：P<0.001、P<0.001），且在1%氧濃度下的生存能力均明顯強于在5%氧濃度下（第3天：P=0.020；第7天：P=0.002）。見表4。
表4
不同氧濃度對EPC生存能力（生存細胞百分比）的影響（%）
3 討論
EPC是一類能增殖并分化為成熟的有功能血管內皮細胞的前體細胞，具有向缺血組織歸巢的特性，而且本身就能夠在缺血組織中發揮促進血管新生的作用。
EPC促血管新生機制與胚胎發育中血管新生相似，通過自身的增殖、分化而形成新生血管，即出生后的血管發生；EPC本身也可在缺血部位分泌血管內皮生長因子、基質細胞衍生因子-1α、胰島素樣生長因子Ⅰ等生長因子，通過旁分泌方式作用于內皮細胞和其他細胞來促進血管生成過程[11]。從1997年Asahara等[1]成功地從外周循環血中分離出EPC并證明其參與血管新生，隨后大量的動物試驗顯示了EPC在再生醫學治療領域中的巨大潛力，如EPC在冠心病和其他缺血性疾病的血管修復過程中扮演著重要的功能[12-17]，并開始將EPC應用于臨床治療下肢缺血、糖尿病足、冠心病等缺血性疾病并取得了一定的初步療效，且顯示了其治療的有效性和安全性，如Kawamoto等[18]在2009年進行的多中心臨床研究中證實，EPCs可用于治療下肢慢性嚴重缺血患者，接受治療的患者下肢血運得到了顯著的改善；Tanaka等[19]在2014年用自體外周血EPC治療難治性糖尿病足和缺血，也顯示出良好的治療效果，接受EPC移植治療后的患者下肢疼痛得到顯著的改善，足部潰瘍面積縮小，且無痛行走距離增加，這種良好的療效可至少保持2年。以上研究結果提示，在應用干細胞移植治療缺血性心血管疾病領域，EPC是一個非常合適的候選者。
首都醫科大學宣武醫院在國內較早開展應用骨髓源或者外周血干細胞移植治療“無治療選擇”的慢性嚴重下肢缺血患者[20-22]，至今已有10余年的臨床經驗，累計達350余例患者，結果顯示，自體干細胞移植能夠在一定程度上改善慢性重度下肢缺血狀況，部分患者的肢體潰瘍達到愈合或者面積縮小，避免了截肢或者降低了截肢平面。雖然有部分病例顯示出良好的短期結果，但遠期療效并不理想，部分患者仍然避免不了截肢的命運。所以，研究各種方法來增強EPC促血管新生功能是提高其臨床療效的有效途徑。
研究干細胞的微環境為我們提供了一個重要的思路。已有國外學者[8]證實無論干細胞存儲的環境或其增殖分化的外周組織環境中氧濃度均較自然界大氣氧濃度（21%）低，在胚胎發育過程中，胚胎干細胞在受精卵著床以及整個胚胎的發育中一直處于低氧環境中；其他研究[9]證實，不同成體干細胞也生存在一個低氧環境，如間充質干細胞生存氧濃度環境為2%～8%，造血干細胞為1%～6%，神經干細胞為1%～8%，所以當前體外研究大多所采用的21%氧濃度（自然界大氣氧濃度）培養環境對于長期生存在較低氧濃度微環境的干細胞來說并非最適合環境。因此，在干細胞（包括EPC）移植前，對其培養環境中的氧濃度進行調整或者進行適當的干預，有可能進一步優化它們的治療潛能。
Hou等[23]報道低氧可以增強心臟組織干細胞的生存和向心肌組織分化能力；Yu等[24]也報道低氧可以刺激間充質干細胞的遷移能力。在本研究中發現，與21%正常氧濃度相比，低氧濃度培養（1%和5%）能夠增強EPC的增殖、黏附、遷移和生存（抗凋亡和死亡）功能，而這些功能是EPC在血管新生過程中幾個非常重要的步驟。作為對組織缺血損傷的反應，干細胞（包括EPCs）會從骨髓向外周循環動員和缺血組織歸巢，進而發揮其促進血管新生的作用，這一過程包括增殖分化、黏附、遷移等一系列步驟[25]，本研究也為進行更加貼近干細胞生存微環境的血管組織工程研究提供了一定的參考，即我們不僅要構造更加適合干細胞生長的三維微環境[7]，也要重視其氧濃度的調整，因為氧濃度的調整可以改變其增殖、黏附、遷移和生存能力，構造更加適合人體應用的血管組織工程并提高其未來的臨床療效。
本研究結果提示，在應用干細胞（包括EPC）移植治療缺血性血管疾病時，移植前進行適當的低氧培養（如置入1%到5%氧濃度環境），可以增強其與促進血管新生相關的增殖、黏附、遷移和生存（抗凋亡和死亡）能力。但是不同的低氧濃度和培養時間對增殖、黏附、遷移以及生存能力的影響仍有差別，比如同樣是低氧濃度，培養至第3天時，EPC在5%氧濃度的增殖能力明顯高于1%氧濃度的增殖能力，而在第7天，兩者的增殖能力卻無明顯差別；對于黏附能力，EPC在1%和5%氧濃度的黏附能力無明顯差別，卻在培養至第7天時，1%氧濃度時的黏附能力明顯強于5%氧濃度；對于遷移和生存能力，不論在第3天還是第7天，EPC在低氧濃度時均比21%正常氧濃度能力強，且氧濃度越低，遷移和生存能力越強（1%氧濃度優于5%氧濃度），這說明氧濃度的變化對干細胞在生長的不同階段以及生物學特性方面產生復雜的影響，在應用低氧培養研究干細胞時應該結合研究的實際需要從氧濃度和培養時間兩個方面進行選擇，優化干細胞研究環境，得出更加有臨床轉化價值的研究結果。
本研究不足之處：由于研究經費所限，我們只設置了1%和5%兩個相對低氧濃度環境，之所以選擇這兩個氧濃度是因為它們更加接近干細胞的生存環境[8-9]，其他氧濃度對EPC功能的影響仍需要進一步的研究來證實；另外，本研究體外低氧培養時間只有1周，更長時間的低氧培養對EPC功能的影響也需要進一步的研究明確，因而最佳的氧濃度和最佳的低氧培養時間仍需要進一步的研究來獲得，從而優化當前臨床應用干細胞（包括EPC）移植的臨床療效。
內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一類能增殖并分化為成熟的有功能的內皮細胞的前體細胞。1997年，EPC被成功地從外周血分離并證明其能夠整合進血管新生的“活躍點”[1]，還能夠增強缺血組織的側支血管生長，所以在細胞移植治療缺血性血管疾病的過程中EPC是一個非常合適的候選者，其目前已成為心血管缺血性疾病的重要靶點[2]。但是已知的動脈硬化相關危險因素對EPC產生負性影響，比如糖尿病、高血脂、吸煙等均會使EPC功能受抑制[3-6]，如何提高受損EPC的功能是目前研究熱點。研究干細胞的微環境為我們提供了一個重要的思路，干細胞生存在一個包含多種細胞和分子成分的三維微環境空間里[7]。氧分子是這個微環境中一個非常重要的因子，不僅直接參加細胞的生理代謝，同時也是重要的信號分子，其已被證實多數干細胞（包括EPC）生存在一個相對低氧的微環境里面[8-9]。但當前國內外關于干細胞（包括EPC）的體外研究多采用21%的自然氧濃度培養環境，所提供的培養環境與生物體內微環境顯然不同，必然對干細胞的增殖、分化等產生一定的影響，所以只有提供接近體內生存微環境的培養條件，才能夠得出更加準確可靠的實驗數據，進而提高干細胞移植的臨床療效。本研究設計體外誘導分化、擴增骨髓來源的EPC，在不同氧濃度下進行培養，觀察不同氧濃度對骨髓源EPC增殖、黏附、遷移、生存能力等這些與血管新生相關的生物學特性的影響，為提高干細胞移植治療缺血性心血管疾病的臨床療效提供一定的研究基礎。
1 材料與方法
1.1 骨髓源EPC的獲取、體外誘導、培養及擴增
SD大鼠，25只，雄性，體質量 200～250 g，北京維通利華實驗動物有限公司提供。骨髓源EPC的獲取、體外誘導、培養及擴增具體方法參考文獻[10]。于大鼠腹腔內注射10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）深度麻醉后斷頭處死，放入75%乙醇內浸泡15 min后剪取股骨和脛骨；離斷兩端骨骺，用預冷至4 ℃的 PBS 溶液5～10 mL沖洗骨髓腔直至骨變白及沖洗液清亮。應用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，接種于預先用纖維連接蛋白鋪底的 25 cm2培養瓶內，培養瓶內加入EBM-2完全培養基，置于37 ℃細胞培養箱中培養，48 h后輕輕換液，棄去未貼壁細胞，以后每隔2 d更換培養液。每天于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，觀察7～8 d。
1.2 骨髓源EPC的鑒定
細胞培養至第7～8天時，采用功能鑒定方法，用乙酰化的低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）和異硫氰酸熒光素-荊豆凝集素-Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ）進行雙陽性鑒定。在熒光顯微鏡下觀察細胞，用510 nm激發光激發Dil，用488 nm激發光激發FITC。熒光染色雙陽性細胞被認為是正在分化中的EPC。
1.3 檢測不同氧濃度對EPC增殖、黏附、遷移和生存能力的影響
將上面鑒定的EPC計數分組并分別置入不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中繼續培養和觀察。于不同氧濃度下培養至第3天和第7天時嚴格按照細胞增殖實驗試劑盒（Molecular Probes Inc.，美國）、細胞黏附實驗試劑盒（Molecular Probes Inc.，美國）、細胞遷移實驗試劑盒（Platypus Technologies，美國）、細胞凋亡和死亡實驗試劑盒（Molecular Probes Inc.，美國）的操作說明對EPC增殖、黏附、遷移和生存（抗凋亡和抗死亡）能力進行測定，結果分別用吸光度值、黏附細胞百分比、遷移細胞數量以及生存細胞百分比表示。① 吸光度值計算：每個氧濃度環境下在培養板上設置 6 個培養孔，每個孔測量 3 次，然后取 6 個培養孔的平均值進行統計分析。② 黏附細胞百分比計算：每個氧濃度環境下，將等量 EPC 置入培養板的培養孔中，立即隨機取 10 個高倍鏡視野進行計數，取平均值作為分母，然后過 3 h后，PBS液沖洗，再取 10 個高倍鏡視野進行黏附的細胞計數，取平均值作為分子，最后計算公式為：黏附細胞百分比=黏附細胞數/總細胞數×100%。③ 遷移細胞數量計算：每個氧濃度環境下在試劑盒提供的培養板上設置 6 個培養孔，每個培養孔計數遷移的細胞數 3 次，然后取 6 個培養孔的平均值進行統計分析。④ 生存細胞百分比計算：每個氧濃度環境下，隨機取 10 個視野，生存細胞百分比=生存細胞數/（生存細胞數+死亡細胞數+凋亡細胞數）×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計分析軟件對數據進行分析。連續變量統計指標用均數±標準差（
±s）表示，對各組資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，若滿足正態分布和方差齊性，則各組之間相互比較采用方差分析方法（LSD 檢驗）；二分類變量統計指標表達為百分比，統計檢驗方法采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 骨髓源EPC體外誘導、培養及擴增結果
新分離的大鼠骨髓單個核細胞呈圓形，大小不一。細胞培養至第 3 天時，可見細胞開始貼壁，由圓形逐漸伸展開，呈長梭形、三角形、紡錘形或不規則形，并呈集落樣生長（圖1a），此后細胞進入對數生長期，生長旺盛。培養至第 7～8 天時，細胞逐漸成鋪路卵石樣單層排列，約80%鋪滿（圖1b）。
圖1
示培養至不同時相時細胞生長情況（倒置相差顯微鏡 ×100）
a：第3天時細胞呈長梭形、三角形（綠箭示細胞集落）；b：第7天時細胞呈鋪路卵石樣單層排列，約80%鋪滿
2.2 骨髓源EPC的鑒定結果
細胞在培養至第7～8天時，用Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙陽性鑒定結果（圖2）顯示，熒光染色雙陽性細胞約占細胞總數的98%以上。
圖2
Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙陽性鑒定EPC結果（熒光顯微鏡 ×200）
a：Dil-Ac-LDL 攝取實驗；b：FITC-UEA-Ⅰ結合實驗；c：雙熒光染色陽性細胞
2.3 不同氧濃度對EPC增殖能力的影響
EPC在不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中培養至第3天時，在1%和5%氧濃度下的吸光度值明顯高于在21%氧濃度下的（P<0.001、P<0.001），在5%氧濃度下的吸光度值明顯高于在1%氧濃度下的（P<0.001）；培養至第7天時，在1%和5%氧濃度下的吸光度值均明顯高于在21%氧濃度下的（P<0.001、P<0.001），在1%和5%氧濃度下的吸光度值比較差異無統計學意義（P=0.174）。見表1。
表1
不同氧濃度對EPC增殖能力（吸光度值）的影響（
）
2.4 不同氧濃度對EPC黏附能力的影響
EPC在不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中培養至第3天時，在1%和5%氧濃度下的黏附能力均明顯強于在21%氧濃度下的（P<0.001、P<0.001），但在1%和5%氧濃度下的黏附能力比較差異無統計學意義（P=0.655）。培養至第7天時，在1%和5%氧濃度下的黏附能力均明顯強于在21%氧濃度下的（P<0.001、P<0.001），在1%氧濃度下的黏附能力明顯強于在5%氧濃度下的（P=0.017）。見表2。
表2
不同氧濃度對EPC黏附能力（黏附細胞百分比）的影響（%）
2.5 不同氧濃度對EPC遷移能力的影響
EPC在不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中培養至第3天和第7天時，在1%和5%氧濃度下的遷移能力均明顯強于在21%氧濃度下的（第3天：P<0.001、P<0.001；第7天：P<0.001、P<0.001），在1%氧濃度下的遷移能力明顯強于在5%氧濃度下的（第3天：P<0.001；第7天：P<0.001）。見表3。
表3
不同氧濃度對EPC遷移能力（細胞數目）的影響（×103，
）
2.6 不同氧濃度對EPC生存能力的影響
EPC在不同氧濃度（1%、5%及21%）的培養箱中培養至第3天和第7天時，在1%和5%氧濃度下的生存能力明顯強于21%氧濃度下的（第3天：P<0.001、P=0.010；第7天：P<0.001、P<0.001），且在1%氧濃度下的生存能力均明顯強于在5%氧濃度下（第3天：P=0.020；第7天：P=0.002）。見表4。
表4
不同氧濃度對EPC生存能力（生存細胞百分比）的影響（%）
3 討論
EPC是一類能增殖并分化為成熟的有功能血管內皮細胞的前體細胞，具有向缺血組織歸巢的特性，而且本身就能夠在缺血組織中發揮促進血管新生的作用。
EPC促血管新生機制與胚胎發育中血管新生相似，通過自身的增殖、分化而形成新生血管，即出生后的血管發生；EPC本身也可在缺血部位分泌血管內皮生長因子、基質細胞衍生因子-1α、胰島素樣生長因子Ⅰ等生長因子，通過旁分泌方式作用于內皮細胞和其他細胞來促進血管生成過程[11]。從1997年Asahara等[1]成功地從外周循環血中分離出EPC并證明其參與血管新生，隨后大量的動物試驗顯示了EPC在再生醫學治療領域中的巨大潛力，如EPC在冠心病和其他缺血性疾病的血管修復過程中扮演著重要的功能[12-17]，并開始將EPC應用于臨床治療下肢缺血、糖尿病足、冠心病等缺血性疾病并取得了一定的初步療效，且顯示了其治療的有效性和安全性，如Kawamoto等[18]在2009年進行的多中心臨床研究中證實，EPCs可用于治療下肢慢性嚴重缺血患者，接受治療的患者下肢血運得到了顯著的改善；Tanaka等[19]在2014年用自體外周血EPC治療難治性糖尿病足和缺血，也顯示出良好的治療效果，接受EPC移植治療后的患者下肢疼痛得到顯著的改善，足部潰瘍面積縮小，且無痛行走距離增加，這種良好的療效可至少保持2年。以上研究結果提示，在應用干細胞移植治療缺血性心血管疾病領域，EPC是一個非常合適的候選者。
首都醫科大學宣武醫院在國內較早開展應用骨髓源或者外周血干細胞移植治療“無治療選擇”的慢性嚴重下肢缺血患者[20-22]，至今已有10余年的臨床經驗，累計達350余例患者，結果顯示，自體干細胞移植能夠在一定程度上改善慢性重度下肢缺血狀況，部分患者的肢體潰瘍達到愈合或者面積縮小，避免了截肢或者降低了截肢平面。雖然有部分病例顯示出良好的短期結果，但遠期療效并不理想，部分患者仍然避免不了截肢的命運。所以，研究各種方法來增強EPC促血管新生功能是提高其臨床療效的有效途徑。
研究干細胞的微環境為我們提供了一個重要的思路。已有國外學者[8]證實無論干細胞存儲的環境或其增殖分化的外周組織環境中氧濃度均較自然界大氣氧濃度（21%）低，在胚胎發育過程中，胚胎干細胞在受精卵著床以及整個胚胎的發育中一直處于低氧環境中；其他研究[9]證實，不同成體干細胞也生存在一個低氧環境，如間充質干細胞生存氧濃度環境為2%～8%，造血干細胞為1%～6%，神經干細胞為1%～8%，所以當前體外研究大多所采用的21%氧濃度（自然界大氣氧濃度）培養環境對于長期生存在較低氧濃度微環境的干細胞來說并非最適合環境。因此，在干細胞（包括EPC）移植前，對其培養環境中的氧濃度進行調整或者進行適當的干預，有可能進一步優化它們的治療潛能。
Hou等[23]報道低氧可以增強心臟組織干細胞的生存和向心肌組織分化能力；Yu等[24]也報道低氧可以刺激間充質干細胞的遷移能力。在本研究中發現，與21%正常氧濃度相比，低氧濃度培養（1%和5%）能夠增強EPC的增殖、黏附、遷移和生存（抗凋亡和死亡）功能，而這些功能是EPC在血管新生過程中幾個非常重要的步驟。作為對組織缺血損傷的反應，干細胞（包括EPCs）會從骨髓向外周循環動員和缺血組織歸巢，進而發揮其促進血管新生的作用，這一過程包括增殖分化、黏附、遷移等一系列步驟[25]，本研究也為進行更加貼近干細胞生存微環境的血管組織工程研究提供了一定的參考，即我們不僅要構造更加適合干細胞生長的三維微環境[7]，也要重視其氧濃度的調整，因為氧濃度的調整可以改變其增殖、黏附、遷移和生存能力，構造更加適合人體應用的血管組織工程并提高其未來的臨床療效。
本研究結果提示，在應用干細胞（包括EPC）移植治療缺血性血管疾病時，移植前進行適當的低氧培養（如置入1%到5%氧濃度環境），可以增強其與促進血管新生相關的增殖、黏附、遷移和生存（抗凋亡和死亡）能力。但是不同的低氧濃度和培養時間對增殖、黏附、遷移以及生存能力的影響仍有差別，比如同樣是低氧濃度，培養至第3天時，EPC在5%氧濃度的增殖能力明顯高于1%氧濃度的增殖能力，而在第7天，兩者的增殖能力卻無明顯差別；對于黏附能力，EPC在1%和5%氧濃度的黏附能力無明顯差別，卻在培養至第7天時，1%氧濃度時的黏附能力明顯強于5%氧濃度；對于遷移和生存能力，不論在第3天還是第7天，EPC在低氧濃度時均比21%正常氧濃度能力強，且氧濃度越低，遷移和生存能力越強（1%氧濃度優于5%氧濃度），這說明氧濃度的變化對干細胞在生長的不同階段以及生物學特性方面產生復雜的影響，在應用低氧培養研究干細胞時應該結合研究的實際需要從氧濃度和培養時間兩個方面進行選擇，優化干細胞研究環境，得出更加有臨床轉化價值的研究結果。
本研究不足之處：由于研究經費所限，我們只設置了1%和5%兩個相對低氧濃度環境，之所以選擇這兩個氧濃度是因為它們更加接近干細胞的生存環境[8-9]，其他氧濃度對EPC功能的影響仍需要進一步的研究來證實；另外，本研究體外低氧培養時間只有1周，更長時間的低氧培養對EPC功能的影響也需要進一步的研究明確，因而最佳的氧濃度和最佳的低氧培養時間仍需要進一步的研究來獲得，從而優化當前臨床應用干細胞（包括EPC）移植的臨床療效。
