引用本文： 馬文杰, 陳巍巍, 楊琴, 李全生, 李富宇. 以核磁共振方法測定膽囊結石患者的氨基酸譜及糖代謝譜的初步臨床研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(4): 401-409. doi: 10.7507/1007-9424.201709077 復制
近年來，我國自然人群膽囊結石的發病率呈逐漸升高趨勢，發病率從 5% 上升到 10%[1]。有研究者[2]認為，造成膽囊結石的原因有膽汁化學成分的改變、細菌感染和膽汁淤積；也有研究[3]提示脂質代謝異常與膽囊結石發生的關系密切。但是，既往的研究是以較單一的脂代謝產物為研究對象，不能了解脂質代謝整體與膽囊結石發生的關系，更不能把握機體整個代謝物質的變化與膽囊結石的關系，而代謝組學可以從整體上讓我們了解體內代謝物質的變化與膽囊結石形成的關系[4]。核磁共振（NMR）技術作為代謝組學研究的主要技術之一，主要應用于疾病診斷及發病機制的研究[5-9]，其中以1H-NMR 的應用最為廣泛。本研究運用基于1H-NMR 的代謝組學研究方法，針對無膽囊結石的健康人/肝移植供體和膽囊結石患者，分析他們之間血和膽汁中代謝物質的差別，從而探索與膽囊結石發病相關的代謝變化。
1 資料與方法
1.1 納入和排除標準
1.1.1 膽囊結石組
膽囊結石患者的納入標準：① 年齡在 18 歲以上；② 術前彩超明確診斷為膽囊結石，術中證實為膽囊成型結石；③ 手術方式為腹腔鏡膽囊切除術。排除標準：① 合并其他急慢性疾病；② 術中膽汁污染；③ 合并膽管梗阻，術前總膽紅素（TBIL）水平大于 28 μmol/L。
1.1.2 肝移植供體組
活體肝移植供體組納入標準：① 年齡在 18 歲以上；② 影像學檢查明確診斷無膽囊結石，且術中證實無膽囊成型結石；③ 術中證實膽囊外觀正常，無炎癥及水腫；④ 肝移植供體的手術方式為開腹肝臟切除附加膽囊切除術。排除標準：① 術中存在膽汁污染；② 術前總膽紅素水平大于 28μmol/L。
1.1.3 健康人組
健康人員的納入標準：① 年齡在 18 歲以上；② 體檢彩超檢查明確診斷無膽囊結石。排除標準：合并急、慢性疾病。
1.2 臨床資料
前瞻性收集 2016 年 3 月至 2016 年 12 月期間于四川大學華西醫院接受腹腔鏡膽囊切除術的 19 例膽囊結石患者的血清標本和膽汁標本，因 2 例患者的血清標本收集后自凝，故膽囊結石組最終剩余血清標本 17 例。收集同期于四川大學華西醫院體檢的 10 例健康體檢者的血清標本（健康人組），以及 15 例肝移植供體（肝移植供體組）的膽汁標本。3 組對象的基本特征見表 1，由表 1 可見，3 組對象的性別、年齡、TBIL、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）及門冬氨酸氨基轉移酶（AST）比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究膽囊結石患者的血清及膽汁采集、肝移植供體的膽汁采集及健康人的血清采集均通過四川大學倫理委員會審批，所有研究對象包括膽囊結石患者、肝移植供體及健康人均已簽署知情同意書。
表1
膽囊結石組、肝移植供體組與健康人組的臨床特征比較
1.3 標本采集
膽囊結石組、肝移植供體組及健康人組對象均于入院第 1 天（健康組為體檢當天）清晨空腹、靜脈抽取血液 3～4 mL，置于真空采血管中，3 000 r/min離心 10 min（r=10 cm），取上清液于–80 ℃ 深低溫冰箱中冷凍備用。肝移植供體組及膽囊結石組研究對象在膽囊切除后需保持膽囊的完整性、不泄露膽汁，空針穿刺抽吸 3～4 mL 膽汁，置于玻璃管中，然后 3 000 r/min 離心 10 min（r=10 cm），取上清液于–80 ℃ 深低溫冰箱中冷凍備用。
1.4 代謝組學檢測和分析
本研究的代謝組學分析是委托四川來福瑞科技有限公司完成的。取出凍存血清和膽汁，室溫下解凍，以 13 000 r/min 離心（4 ℃，r=10 cm）10 min 后取 4 00 μL 上清液加入 5 mm 核磁管中，再于核磁管中加入 100 μL 重水（D2O），充分振蕩約 1 min。在 Varian NMR System 600 MHz 譜儀（Varian 公司，美國）上采集1H-NMR 自由感應衰減（free induction decay，FID）信號。采用 MestReNova 9.0 軟件（Mestrelab MestReNova 公司，西班牙）對信號進行手動調相、基線校正和譜峰對齊，并進行分段積分及歸一化處理，同時扣除水峰殘留信號以得到相應圖譜。采用 SIMCA-P+ 11.0 軟件（Umetrics AB 公司，瑞典）將積分數據歸一化并構成數據矩陣，并利用主成分分析法（PCA）對數據矩陣進行統計分析，得到 PCA 得分圖（scores plot）。采用 SIMCA-P+ 11.0 軟件對歸一化后的數據進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），通過 PLS-DA 的變量權重值（variable importance in the projection，VIP）找出相對應的差異化學位移（ppm）。再通過 PLS-DA 以發現 NMR 數據和其他變量之間的相關關系，并采用交叉驗證后得到的反映變量 Y 的變異百分比（R2Y）和模型預測值（Q2），對模型的有效性進行評判。然后，對 PLS-DA 模型進行正交矯正處理（OPLS-DA），以最大化地凸顯模型內部不同組別之間的差異，并通過載荷圖進行差異代謝物的篩選和鑒定。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析。3 組研究對象的年齡、TBIL、DBIL、IBIL、ALT 及 AST 以均數±標準差（
±s）表示，統計方法采用單因素方差分析（ANOVA）；3 組研究對象的性別構成比較采用成組χ2檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 健康人及膽囊結石患者血清標本的代謝組學分析結果
2.1.1 健康人及膽囊結石患者的血清標本中1H-NMR 測定結果
通過將 FID 信號導入軟件后得到健康人及膽囊結石患者血清樣本的代表性1H-NMR 圖譜，見圖 1。由圖 1 可見，與健康人比較，膽囊結石患者血清中的纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、組氨酸、次黃嘌呤等成分的1H-NMR 信號峰有所降低，而乙酰乙酸和1, 2-丙二醇的1H-NMR 信號峰有所升高，提示健康人和膽囊結石患者血清中的代謝成分濃度有一定的差異。
圖1
示健康人（a）及膽囊結石患者（b）血清樣本的代表性1H-NMR 圖譜
hypoxanthine：次黃嘌呤；histidine：組氨酸；tyrosine：酪氨酸；α-glucose：α-葡萄糖；β-glucose：β-葡萄糖；lactate：乳酸鹽；lysine：賴氨酸；glutamine：谷氨酰胺；N-acetyl glycoprotein：N-乙酰基糖蛋白；alanine：丙氨酸；valine：纈氨酸；VLDL：極低密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；phenylalanine：苯丙氨酸；acetoacetate：乙酰乙酸；1, 2-propanediol：1, 2-丙二醇
2.1.2 健康人及膽囊結石患者的血清標本中1H-NMR 數據分析
① PCA：PCA 結果見圖 2a，由圖 2a 可見，第1主成分（PC1）與第2主成分（PC2）的 PCA 得分圖，提示健康人和膽囊結石患者的血清標本的主成分積分值在橢圓形散點圖（95% 置信區間）中無明顯交叉，說明健康人和膽囊結石患者的血清樣本代謝物能在 PCA 得分圖上得到一定的區分。② 1H-NMR 圖譜模式識別分析：進一步進行 PLS-DA 分析（圖 2b 和圖 2c）和正交矯正處理（圖 2d–2f）。PLS-DA 分析（圖 2b 和圖 2c）結果顯示：健康組和膽囊結石組的血清標本存在顯著的差異；置換檢驗圖（圖 2d）表明 PLS-DA 模型能較好地解釋 2 組血清成分之間的差異。相比 PLS-DA 分析，健康人組和膽囊結石組的血清樣本能在 OPLS-DA 得分圖（圖 2e–2f）上得到更好的分離，從而表明 2 組血清樣本的內源性代謝物有明顯的區別。本研究進一步觀察 OPLS-DA 分析的載荷圖（圖 2g）可知，第 168、170、171、157、156、167、155、154、153、158、159、160、161、162、73、74、75、663、675、658、676、666、655、679、656、680、662、657、660 等變量是造成健康人組和膽囊結石組差異的主要變量。③ 血清差異代謝物的篩選和鑒定：健康人組和膽囊結石組的血清差異代謝物的篩選和鑒定結果見表 2。由表 2 可見，與健康人比較，膽囊結石患者的血清中共有 16 種差異代謝物，其中膽囊結石組患者的纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙酮酸、肌酸酐、膽堿、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、組氨酸以及次黃嘌呤的濃度較健康人組明顯降低（P<0.05），而膽囊結石組患者的乳酸鹽、乙酰乙酸以及 1, 2-丙二醇的濃度較健康人組明顯升高（P<0.05）。
圖2
示健康人和膽囊結石患者血清標本的代謝組學分析圖
a：PCA 得分圖；b：PLS-DA 二維得分圖；c：PLS-DA 三維得分圖；d：PLS-DA 分析的置換檢驗圖，
表2
健康人組和膽囊結石組血清比較的主要差異代謝物及相關系數值
2.2 肝移植供體及膽囊結石患者膽汁標本的代謝組學分析結果
2.2.1 肝移植供體及膽囊結石患者的膽汁標本的 1H-NMR 測定結果
肝移植供體及膽囊結石患者的膽汁樣本的代表性1H-NMR 圖譜見圖 3。通過將 FID 信號導入軟件后得到1H-NMR 圖譜后（圖 3）發現，與肝移植供體比較，膽囊結石患者膽汁中的甘氨酸結合的膽汁酸（glycine conjugated bile acids）、甘氨酸結合的去氧膽汁酸、甘氨酸結合的鵝去氧膽汁酸、牛磺酸結合的膽汁酸（taurine conjugated bile acids）、牛磺酸結合的去氧膽汁酸以及牛磺酸結合的鵝去氧膽汁酸的1H-NMR 信號峰均明顯降低。此外，膽囊結石患者的磷脂酰膽堿（phosphatidyl- choline，PC）和膽堿成分的信號強度也較肝移植供體有所降低。
圖3
示肝移植供體（a）及膽囊結石患者（b）膽汁的代表性1H-NMR 圖譜
taurine conjugated bile acids：牛磺酸結合的膽汁酸；glycine conjugated bile acids：甘氨酸結合的膽汁酸；cholesterol：膽固醇；PC：磷脂酰膽堿；glycerol：甘油；lipids：脂類；choline：膽堿；bile acids：膽汁酸；total bile acids；總膽汁酸；CA：甘氨酸/牛磺酸結合的膽酸；CDCA：甘氨酸/牛磺酸結合的鵝去氧膽酸；DCA：甘氨酸/牛磺酸結合的去氧膽酸
2.2.2 肝移植供體及膽囊結石患者膽汁標本的1H-NMR 數據分析
① PCA：PCA 結果見圖 4a，由圖 4a 可見第1主成分（PC1）與第2主成分（PC2）的 PCA 得分圖，提示肝移植供體組和膽囊結石組的膽汁標本的主成分積分值在橢圓形散點圖（95% 置信區間）中得到較好地分離，僅有個別樣品重疊，說明肝移植供體和膽囊結石患者的膽汁成分能在 PCA 得分圖上得到一定程度的區分。② 1H-NMR 圖譜模式識別分析：進一步進行 PLS-DA 分析（圖 4b 和圖 4c）和正交矯正處理（圖 4d–4f）。結果顯示：肝移植供體和膽囊結石患者的膽汁標本間存在著顯著的差異（圖 4b–4c），交叉驗證實驗（圖 4d）說明 PLS-DA 模型能較好地解釋 2 組膽汁成分之間的差異。與 PLS-DA 分析比較，OPLS-DA 的分離效果得到了明顯地改善，這表明肝移植供體組和膽囊結石組的膽汁標本的內源性代謝物有顯著的差異（圖 4e–4f）。筆者進一步觀察了 OPLS-DA 分析的載荷圖，具體見圖 4g。由圖 4g 可知，第 159、156、155、157、160、84、158、82、154、161、665、85、166、167、79、165、74、75、658、153、86、73、109 等變量是造成肝移植供體組和膽囊結石組存在差異的主要變量。③ 膽汁差異代謝物的篩選和鑒定：肝移植供體組和膽囊結石組的膽汁差異代謝物的篩選和鑒定結果見表 3。由表 3 可見，與肝移植供體比較，膽囊結石患者的膽汁中存在 5 種差異代謝物，其中膽囊結石組患者的牛磺酸結合的膽汁酸、甘氨酸結合的膽汁酸、膽堿以及 PC 的濃度均較肝移植供體組明顯降低（P<0.05），而膽囊結石組患者膽汁中的膽固醇濃度較肝移植供體組明顯升高（P<0.05）。
圖4
示肝移植供體和膽囊結石患者膽汁標本的代謝組學分析圖
a：PCA 得分圖；b：PLS-DA 二維得分圖；c：PLS-DA 三維得分圖；d：OPLS-DA 分析的置換檢驗圖：
表3
肝移植供體和膽囊結石患者的主要差異代謝物及相關系數值
3 討論
膽囊結石的成因復雜，許多學者[1, 2-6, 10]也做了大量的相關研究。有學者[2, 4]在致石基因與遺傳因素對膽囊結石影響的研究中，通過對近交系的小鼠進行研究，發現了著名的 Lith-1 基因與膽囊結石連鎖。在膽囊動力學紊亂與膽囊結石形成關系的研究中，學者[10-11]發現，膽囊運動減弱是膽囊結石發生的重要因素之一，而膽囊收縮素受體的缺乏可能是膽囊運動功能受損的重要原因之一。此外，細菌感染可能也是導致膽囊結石的一個重要因素，細菌感染可導致膽囊運動減弱和膽汁淤積，并改變膽汁的成分和理化性質，最終導致膽囊結石形成[2, 10, 12]。脂代謝紊亂也可以誘發膽囊結石[2-3, 12-13]，但是除了脂代謝以外，其他代謝如糖代謝和氨基酸代謝在膽囊結石的形成中是否也起到了重要的作用，以及體內代謝物質的整體變化與膽囊結石形成的關系尚鮮見報道。
3.1 膽囊結石患者存在血清糖代謝及氨基酸代謝異常
膽囊結石的形成可能與糖代謝紊亂有關。在本研究中，丙酮酸代謝被發現是高度影響膽囊結石形成的代謝途徑（| r | =0.482）。丙酮酸是人類新陳代謝的關鍵代謝物，其通過檸檬酸或草酰乙酸進入檸檬酸循環，參與不同的生物合成途徑[14]。丙酮酸可通過脫羧生成乙酰輔酶 A，從而進入膽固醇合成途徑。本研究結果表明，膽囊結石患者血清中的丙酮酸較健康人明顯降低，即丙酮酸大量脫羧生成乙酰輔酶 A 從而合成膽固醇，而血清高膽固醇濃度導致膽汁過飽和，從而使膽汁中的膽固醇沉淀為晶體并導致起始膽囊結石形成。此外，乳酸鹽也是糖代謝的重要參與者。在慢性膽囊炎患者中，膽囊上皮細胞中乳酸鹽水平的升高可能與 Warburg 效應有關，即在氧含量充足的情況下，糖酵解仍然增加[15]，而這種效應常于腫瘤細胞中觀察到，這提示其可能是膽囊慢性炎癥向癌癥進展的標志物之一。本研究結果表明，膽囊結石患者的血清乳酸鹽濃度較健康人升高，這與一項關于兔膽囊結石代謝組學特征的研究[16]相一致。該研究發現，與正常對照組比較，兔膽囊結石組的血漿乳酸水平明顯升高。
氨基酸代謝異常可能也在膽囊結石形成中發揮作用。本研究結果表明，與健康組人相比較，膽囊結石組的血清谷氨酸、谷氨酰胺及組氨酸含量明顯降低。谷氨酰胺參與體內能量代謝和物質合成。在炎性病癥中，谷氨酰胺通過為生物合成提供碳源和氮源來維持細胞的存活和生長。谷氨酰胺的抗氧化能力也有助于減輕炎癥，同時也可維持細胞的穩態。而在膽囊結石患者中，血清谷氨酰胺水平明顯降低，表明機體抗膽囊結石所致的慢性炎癥的能力減弱，從而導致膽囊炎癥的進行性進展，而膽道炎癥業已被證實與膽系結石的形成有關[17]。同時谷氨酰胺具有調節腸道免疫功能和保護腸黏膜的作用，其含量降低可導致細菌移位、內毒素血癥和膽汁葡萄糖醛酸酶活性改變，促使膽囊內結石的形成[18]。目前已知組氨酸具有抗炎特性，其可以降低活性氧的含量[19-21]。組氨酸可以通過劑量依賴性的方式抑制氧化應激和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在轉錄水平誘導白介素 8（IL-8）分泌，并且消除 TNF-α誘導的核因子κB（NF-κB）依賴性的 IL-8 啟動子的激活[22-23]。膽囊結石患者血清中增加的膽汁酸則會產生一些促進膽囊結石生成的活性氧成分[15]。組氨酸的缺乏導致 γ-球蛋白聚集和炎癥反應，此外，外源性組氨酸會阻止 γ-球蛋白的聚集以及繼發的炎癥反應[24]。而本研究結果表明，膽囊結石患者血清中的組氨酸水平明顯不足。據報道[20]，慢性炎性腎臟疾病患者血清中的組氨酸濃度亦降低。纈氨酸作為支鏈氨基酸，主要參與能量代謝，而這類支鏈氨基酸代謝有利于細胞的長期能量供應，因此血清中纈氨酸的異常降低進一步證實膽囊結石患者的氨基酸代謝存在異常，能量代謝受損。
機體氨基酸代謝紊亂使得機體對抗膽囊結石及其所致的炎癥反應能力降低[25]。本研究發現，膽囊結石組血清中的膽堿濃度降低。膽堿是磷脂合成的重要底物，磷脂可通過調控多藥耐藥基因 2（MDR2）mRNA 的表達，減少膽道內脂質膽汁的分泌，防止膽囊結石生成，所以膽堿水平降低可能導致膽囊結石形成[26-27]。膽囊結石組患者血清中的纈氨酸、谷氨酸、組氨酸等氨基酸，以及 β-葡萄糖和 α-葡萄糖的濃度降低，提示膽囊結石患者不僅有脂代謝紊亂，而且還可能有糖代謝紊亂和氨基酸代謝紊亂，而賴氨酸、酪氨酸及葡萄糖濃度改變與膽囊結石的關系及其致病機制則需進一步探討。
3.2 膽囊結石患者膽汁中存在膽汁酸代謝異常
膽汁是一種消化液，它含有多種成分，其最主要的脂類物質是膽汁酸、磷酸卵磷脂和膽固醇，其他還包括鈉、鉀、鈣、磷酸鹽和碳酸鹽，以及少量的蛋白質等成分[28-29]。本研究發現了肝移植供體和膽囊結石患者膽汁的差異代謝物，與肝移植供體組比較，膽囊結石組患者膽汁中的牛磺酸結合的膽汁酸和甘氨酸結合的膽汁酸兩種結合型膽汁酸的濃度均明顯降低，而膽汁中的膽汁酸幾乎都以結合型存在，結合型膽汁酸明顯減少后膽固醇溶解能力降低，導致膽汁中膽固醇濃度明顯增加而析出，進而導致膽囊結石形成[12]。但有研究高膽固醇血癥和豚鼠膽囊膽色素結石關系的動物實驗[2]表明，在高血清膽固醇時膽汁中的總膽固醇沒有很大的變化，這與本研究結果不同。此外，本研究結果表明，膽囊結石組膽汁中的 PC 濃度較肝移植供體降低。 PC 濃度降低導致膽囊結石形成的原因可能是，膽汁中有一種由 PC 和膽固醇組成的球泡，它可溶解大多數膽汁內的膽固醇，當 PC 濃度降低后，球泡數量降低，膽固醇不穩定從而析出形成結石[28-29]。
3.3 小結
本研究采用1H-NMR 方法進行代謝組學研究，1H-NMR 法作為一種新的方法，與基因組學、蛋白質組學等相結合后，可幫助我們探索膽囊結石的成因及其致病機制。但由于本研究的樣本量較小，因此需要進一步擴大樣本量，以提高膽囊結石特征代謝產物模型結果的可靠性，進一步研究糖代謝紊亂、氨基酸代謝紊亂與膽囊結石形成的關系及其致病機制。根據本研究結果，可以初步得出，膽囊結石患者和無膽囊結石的健康人的血清代謝物和膽汁代謝物均存在明顯的差異，膽囊結石患者不僅存在脂代謝紊亂，還存在糖代謝紊亂以及氨基酸代謝紊亂。
近年來，我國自然人群膽囊結石的發病率呈逐漸升高趨勢，發病率從 5% 上升到 10%[1]。有研究者[2]認為，造成膽囊結石的原因有膽汁化學成分的改變、細菌感染和膽汁淤積；也有研究[3]提示脂質代謝異常與膽囊結石發生的關系密切。但是，既往的研究是以較單一的脂代謝產物為研究對象，不能了解脂質代謝整體與膽囊結石發生的關系，更不能把握機體整個代謝物質的變化與膽囊結石的關系，而代謝組學可以從整體上讓我們了解體內代謝物質的變化與膽囊結石形成的關系[4]。核磁共振（NMR）技術作為代謝組學研究的主要技術之一，主要應用于疾病診斷及發病機制的研究[5-9]，其中以1H-NMR 的應用最為廣泛。本研究運用基于1H-NMR 的代謝組學研究方法，針對無膽囊結石的健康人/肝移植供體和膽囊結石患者，分析他們之間血和膽汁中代謝物質的差別，從而探索與膽囊結石發病相關的代謝變化。
1 資料與方法
1.1 納入和排除標準
1.1.1 膽囊結石組
膽囊結石患者的納入標準：① 年齡在 18 歲以上；② 術前彩超明確診斷為膽囊結石，術中證實為膽囊成型結石；③ 手術方式為腹腔鏡膽囊切除術。排除標準：① 合并其他急慢性疾病；② 術中膽汁污染；③ 合并膽管梗阻，術前總膽紅素（TBIL）水平大于 28 μmol/L。
1.1.2 肝移植供體組
活體肝移植供體組納入標準：① 年齡在 18 歲以上；② 影像學檢查明確診斷無膽囊結石，且術中證實無膽囊成型結石；③ 術中證實膽囊外觀正常，無炎癥及水腫；④ 肝移植供體的手術方式為開腹肝臟切除附加膽囊切除術。排除標準：① 術中存在膽汁污染；② 術前總膽紅素水平大于 28μmol/L。
1.1.3 健康人組
健康人員的納入標準：① 年齡在 18 歲以上；② 體檢彩超檢查明確診斷無膽囊結石。排除標準：合并急、慢性疾病。
1.2 臨床資料
前瞻性收集 2016 年 3 月至 2016 年 12 月期間于四川大學華西醫院接受腹腔鏡膽囊切除術的 19 例膽囊結石患者的血清標本和膽汁標本，因 2 例患者的血清標本收集后自凝，故膽囊結石組最終剩余血清標本 17 例。收集同期于四川大學華西醫院體檢的 10 例健康體檢者的血清標本（健康人組），以及 15 例肝移植供體（肝移植供體組）的膽汁標本。3 組對象的基本特征見表 1，由表 1 可見，3 組對象的性別、年齡、TBIL、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）及門冬氨酸氨基轉移酶（AST）比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究膽囊結石患者的血清及膽汁采集、肝移植供體的膽汁采集及健康人的血清采集均通過四川大學倫理委員會審批，所有研究對象包括膽囊結石患者、肝移植供體及健康人均已簽署知情同意書。
表1
膽囊結石組、肝移植供體組與健康人組的臨床特征比較
1.3 標本采集
膽囊結石組、肝移植供體組及健康人組對象均于入院第 1 天（健康組為體檢當天）清晨空腹、靜脈抽取血液 3～4 mL，置于真空采血管中，3 000 r/min離心 10 min（r=10 cm），取上清液于–80 ℃ 深低溫冰箱中冷凍備用。肝移植供體組及膽囊結石組研究對象在膽囊切除后需保持膽囊的完整性、不泄露膽汁，空針穿刺抽吸 3～4 mL 膽汁，置于玻璃管中，然后 3 000 r/min 離心 10 min（r=10 cm），取上清液于–80 ℃ 深低溫冰箱中冷凍備用。
1.4 代謝組學檢測和分析
本研究的代謝組學分析是委托四川來福瑞科技有限公司完成的。取出凍存血清和膽汁，室溫下解凍，以 13 000 r/min 離心（4 ℃，r=10 cm）10 min 后取 4 00 μL 上清液加入 5 mm 核磁管中，再于核磁管中加入 100 μL 重水（D2O），充分振蕩約 1 min。在 Varian NMR System 600 MHz 譜儀（Varian 公司，美國）上采集1H-NMR 自由感應衰減（free induction decay，FID）信號。采用 MestReNova 9.0 軟件（Mestrelab MestReNova 公司，西班牙）對信號進行手動調相、基線校正和譜峰對齊，并進行分段積分及歸一化處理，同時扣除水峰殘留信號以得到相應圖譜。采用 SIMCA-P+ 11.0 軟件（Umetrics AB 公司，瑞典）將積分數據歸一化并構成數據矩陣，并利用主成分分析法（PCA）對數據矩陣進行統計分析，得到 PCA 得分圖（scores plot）。采用 SIMCA-P+ 11.0 軟件對歸一化后的數據進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），通過 PLS-DA 的變量權重值（variable importance in the projection，VIP）找出相對應的差異化學位移（ppm）。再通過 PLS-DA 以發現 NMR 數據和其他變量之間的相關關系，并采用交叉驗證后得到的反映變量 Y 的變異百分比（R2Y）和模型預測值（Q2），對模型的有效性進行評判。然后，對 PLS-DA 模型進行正交矯正處理（OPLS-DA），以最大化地凸顯模型內部不同組別之間的差異，并通過載荷圖進行差異代謝物的篩選和鑒定。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析。3 組研究對象的年齡、TBIL、DBIL、IBIL、ALT 及 AST 以均數±標準差（
±s）表示，統計方法采用單因素方差分析（ANOVA）；3 組研究對象的性別構成比較采用成組χ2檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 健康人及膽囊結石患者血清標本的代謝組學分析結果
2.1.1 健康人及膽囊結石患者的血清標本中1H-NMR 測定結果
通過將 FID 信號導入軟件后得到健康人及膽囊結石患者血清樣本的代表性1H-NMR 圖譜，見圖 1。由圖 1 可見，與健康人比較，膽囊結石患者血清中的纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、組氨酸、次黃嘌呤等成分的1H-NMR 信號峰有所降低，而乙酰乙酸和1, 2-丙二醇的1H-NMR 信號峰有所升高，提示健康人和膽囊結石患者血清中的代謝成分濃度有一定的差異。
圖1
示健康人（a）及膽囊結石患者（b）血清樣本的代表性1H-NMR 圖譜
hypoxanthine：次黃嘌呤；histidine：組氨酸；tyrosine：酪氨酸；α-glucose：α-葡萄糖；β-glucose：β-葡萄糖；lactate：乳酸鹽；lysine：賴氨酸；glutamine：谷氨酰胺；N-acetyl glycoprotein：N-乙酰基糖蛋白；alanine：丙氨酸；valine：纈氨酸；VLDL：極低密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；phenylalanine：苯丙氨酸；acetoacetate：乙酰乙酸；1, 2-propanediol：1, 2-丙二醇
2.1.2 健康人及膽囊結石患者的血清標本中1H-NMR 數據分析
① PCA：PCA 結果見圖 2a，由圖 2a 可見，第1主成分（PC1）與第2主成分（PC2）的 PCA 得分圖，提示健康人和膽囊結石患者的血清標本的主成分積分值在橢圓形散點圖（95% 置信區間）中無明顯交叉，說明健康人和膽囊結石患者的血清樣本代謝物能在 PCA 得分圖上得到一定的區分。② 1H-NMR 圖譜模式識別分析：進一步進行 PLS-DA 分析（圖 2b 和圖 2c）和正交矯正處理（圖 2d–2f）。PLS-DA 分析（圖 2b 和圖 2c）結果顯示：健康組和膽囊結石組的血清標本存在顯著的差異；置換檢驗圖（圖 2d）表明 PLS-DA 模型能較好地解釋 2 組血清成分之間的差異。相比 PLS-DA 分析，健康人組和膽囊結石組的血清樣本能在 OPLS-DA 得分圖（圖 2e–2f）上得到更好的分離，從而表明 2 組血清樣本的內源性代謝物有明顯的區別。本研究進一步觀察 OPLS-DA 分析的載荷圖（圖 2g）可知，第 168、170、171、157、156、167、155、154、153、158、159、160、161、162、73、74、75、663、675、658、676、666、655、679、656、680、662、657、660 等變量是造成健康人組和膽囊結石組差異的主要變量。③ 血清差異代謝物的篩選和鑒定：健康人組和膽囊結石組的血清差異代謝物的篩選和鑒定結果見表 2。由表 2 可見，與健康人比較，膽囊結石患者的血清中共有 16 種差異代謝物，其中膽囊結石組患者的纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙酮酸、肌酸酐、膽堿、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、組氨酸以及次黃嘌呤的濃度較健康人組明顯降低（P<0.05），而膽囊結石組患者的乳酸鹽、乙酰乙酸以及 1, 2-丙二醇的濃度較健康人組明顯升高（P<0.05）。
圖2
示健康人和膽囊結石患者血清標本的代謝組學分析圖
a：PCA 得分圖；b：PLS-DA 二維得分圖；c：PLS-DA 三維得分圖；d：PLS-DA 分析的置換檢驗圖，
表2
健康人組和膽囊結石組血清比較的主要差異代謝物及相關系數值
2.2 肝移植供體及膽囊結石患者膽汁標本的代謝組學分析結果
2.2.1 肝移植供體及膽囊結石患者的膽汁標本的 1H-NMR 測定結果
肝移植供體及膽囊結石患者的膽汁樣本的代表性1H-NMR 圖譜見圖 3。通過將 FID 信號導入軟件后得到1H-NMR 圖譜后（圖 3）發現，與肝移植供體比較，膽囊結石患者膽汁中的甘氨酸結合的膽汁酸（glycine conjugated bile acids）、甘氨酸結合的去氧膽汁酸、甘氨酸結合的鵝去氧膽汁酸、牛磺酸結合的膽汁酸（taurine conjugated bile acids）、牛磺酸結合的去氧膽汁酸以及牛磺酸結合的鵝去氧膽汁酸的1H-NMR 信號峰均明顯降低。此外，膽囊結石患者的磷脂酰膽堿（phosphatidyl- choline，PC）和膽堿成分的信號強度也較肝移植供體有所降低。
圖3
示肝移植供體（a）及膽囊結石患者（b）膽汁的代表性1H-NMR 圖譜
taurine conjugated bile acids：牛磺酸結合的膽汁酸；glycine conjugated bile acids：甘氨酸結合的膽汁酸；cholesterol：膽固醇；PC：磷脂酰膽堿；glycerol：甘油；lipids：脂類；choline：膽堿；bile acids：膽汁酸；total bile acids；總膽汁酸；CA：甘氨酸/牛磺酸結合的膽酸；CDCA：甘氨酸/牛磺酸結合的鵝去氧膽酸；DCA：甘氨酸/牛磺酸結合的去氧膽酸
2.2.2 肝移植供體及膽囊結石患者膽汁標本的1H-NMR 數據分析
① PCA：PCA 結果見圖 4a，由圖 4a 可見第1主成分（PC1）與第2主成分（PC2）的 PCA 得分圖，提示肝移植供體組和膽囊結石組的膽汁標本的主成分積分值在橢圓形散點圖（95% 置信區間）中得到較好地分離，僅有個別樣品重疊，說明肝移植供體和膽囊結石患者的膽汁成分能在 PCA 得分圖上得到一定程度的區分。② 1H-NMR 圖譜模式識別分析：進一步進行 PLS-DA 分析（圖 4b 和圖 4c）和正交矯正處理（圖 4d–4f）。結果顯示：肝移植供體和膽囊結石患者的膽汁標本間存在著顯著的差異（圖 4b–4c），交叉驗證實驗（圖 4d）說明 PLS-DA 模型能較好地解釋 2 組膽汁成分之間的差異。與 PLS-DA 分析比較，OPLS-DA 的分離效果得到了明顯地改善，這表明肝移植供體組和膽囊結石組的膽汁標本的內源性代謝物有顯著的差異（圖 4e–4f）。筆者進一步觀察了 OPLS-DA 分析的載荷圖，具體見圖 4g。由圖 4g 可知，第 159、156、155、157、160、84、158、82、154、161、665、85、166、167、79、165、74、75、658、153、86、73、109 等變量是造成肝移植供體組和膽囊結石組存在差異的主要變量。③ 膽汁差異代謝物的篩選和鑒定：肝移植供體組和膽囊結石組的膽汁差異代謝物的篩選和鑒定結果見表 3。由表 3 可見，與肝移植供體比較，膽囊結石患者的膽汁中存在 5 種差異代謝物，其中膽囊結石組患者的牛磺酸結合的膽汁酸、甘氨酸結合的膽汁酸、膽堿以及 PC 的濃度均較肝移植供體組明顯降低（P<0.05），而膽囊結石組患者膽汁中的膽固醇濃度較肝移植供體組明顯升高（P<0.05）。
圖4
示肝移植供體和膽囊結石患者膽汁標本的代謝組學分析圖
a：PCA 得分圖；b：PLS-DA 二維得分圖；c：PLS-DA 三維得分圖；d：OPLS-DA 分析的置換檢驗圖：
表3
肝移植供體和膽囊結石患者的主要差異代謝物及相關系數值
3 討論
膽囊結石的成因復雜，許多學者[1, 2-6, 10]也做了大量的相關研究。有學者[2, 4]在致石基因與遺傳因素對膽囊結石影響的研究中，通過對近交系的小鼠進行研究，發現了著名的 Lith-1 基因與膽囊結石連鎖。在膽囊動力學紊亂與膽囊結石形成關系的研究中，學者[10-11]發現，膽囊運動減弱是膽囊結石發生的重要因素之一，而膽囊收縮素受體的缺乏可能是膽囊運動功能受損的重要原因之一。此外，細菌感染可能也是導致膽囊結石的一個重要因素，細菌感染可導致膽囊運動減弱和膽汁淤積，并改變膽汁的成分和理化性質，最終導致膽囊結石形成[2, 10, 12]。脂代謝紊亂也可以誘發膽囊結石[2-3, 12-13]，但是除了脂代謝以外，其他代謝如糖代謝和氨基酸代謝在膽囊結石的形成中是否也起到了重要的作用，以及體內代謝物質的整體變化與膽囊結石形成的關系尚鮮見報道。
3.1 膽囊結石患者存在血清糖代謝及氨基酸代謝異常
膽囊結石的形成可能與糖代謝紊亂有關。在本研究中，丙酮酸代謝被發現是高度影響膽囊結石形成的代謝途徑（| r | =0.482）。丙酮酸是人類新陳代謝的關鍵代謝物，其通過檸檬酸或草酰乙酸進入檸檬酸循環，參與不同的生物合成途徑[14]。丙酮酸可通過脫羧生成乙酰輔酶 A，從而進入膽固醇合成途徑。本研究結果表明，膽囊結石患者血清中的丙酮酸較健康人明顯降低，即丙酮酸大量脫羧生成乙酰輔酶 A 從而合成膽固醇，而血清高膽固醇濃度導致膽汁過飽和，從而使膽汁中的膽固醇沉淀為晶體并導致起始膽囊結石形成。此外，乳酸鹽也是糖代謝的重要參與者。在慢性膽囊炎患者中，膽囊上皮細胞中乳酸鹽水平的升高可能與 Warburg 效應有關，即在氧含量充足的情況下，糖酵解仍然增加[15]，而這種效應常于腫瘤細胞中觀察到，這提示其可能是膽囊慢性炎癥向癌癥進展的標志物之一。本研究結果表明，膽囊結石患者的血清乳酸鹽濃度較健康人升高，這與一項關于兔膽囊結石代謝組學特征的研究[16]相一致。該研究發現，與正常對照組比較，兔膽囊結石組的血漿乳酸水平明顯升高。
氨基酸代謝異常可能也在膽囊結石形成中發揮作用。本研究結果表明，與健康組人相比較，膽囊結石組的血清谷氨酸、谷氨酰胺及組氨酸含量明顯降低。谷氨酰胺參與體內能量代謝和物質合成。在炎性病癥中，谷氨酰胺通過為生物合成提供碳源和氮源來維持細胞的存活和生長。谷氨酰胺的抗氧化能力也有助于減輕炎癥，同時也可維持細胞的穩態。而在膽囊結石患者中，血清谷氨酰胺水平明顯降低，表明機體抗膽囊結石所致的慢性炎癥的能力減弱，從而導致膽囊炎癥的進行性進展，而膽道炎癥業已被證實與膽系結石的形成有關[17]。同時谷氨酰胺具有調節腸道免疫功能和保護腸黏膜的作用，其含量降低可導致細菌移位、內毒素血癥和膽汁葡萄糖醛酸酶活性改變，促使膽囊內結石的形成[18]。目前已知組氨酸具有抗炎特性，其可以降低活性氧的含量[19-21]。組氨酸可以通過劑量依賴性的方式抑制氧化應激和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在轉錄水平誘導白介素 8（IL-8）分泌，并且消除 TNF-α誘導的核因子κB（NF-κB）依賴性的 IL-8 啟動子的激活[22-23]。膽囊結石患者血清中增加的膽汁酸則會產生一些促進膽囊結石生成的活性氧成分[15]。組氨酸的缺乏導致 γ-球蛋白聚集和炎癥反應，此外，外源性組氨酸會阻止 γ-球蛋白的聚集以及繼發的炎癥反應[24]。而本研究結果表明，膽囊結石患者血清中的組氨酸水平明顯不足。據報道[20]，慢性炎性腎臟疾病患者血清中的組氨酸濃度亦降低。纈氨酸作為支鏈氨基酸，主要參與能量代謝，而這類支鏈氨基酸代謝有利于細胞的長期能量供應，因此血清中纈氨酸的異常降低進一步證實膽囊結石患者的氨基酸代謝存在異常，能量代謝受損。
機體氨基酸代謝紊亂使得機體對抗膽囊結石及其所致的炎癥反應能力降低[25]。本研究發現，膽囊結石組血清中的膽堿濃度降低。膽堿是磷脂合成的重要底物，磷脂可通過調控多藥耐藥基因 2（MDR2）mRNA 的表達，減少膽道內脂質膽汁的分泌，防止膽囊結石生成，所以膽堿水平降低可能導致膽囊結石形成[26-27]。膽囊結石組患者血清中的纈氨酸、谷氨酸、組氨酸等氨基酸，以及 β-葡萄糖和 α-葡萄糖的濃度降低，提示膽囊結石患者不僅有脂代謝紊亂，而且還可能有糖代謝紊亂和氨基酸代謝紊亂，而賴氨酸、酪氨酸及葡萄糖濃度改變與膽囊結石的關系及其致病機制則需進一步探討。
3.2 膽囊結石患者膽汁中存在膽汁酸代謝異常
膽汁是一種消化液，它含有多種成分，其最主要的脂類物質是膽汁酸、磷酸卵磷脂和膽固醇，其他還包括鈉、鉀、鈣、磷酸鹽和碳酸鹽，以及少量的蛋白質等成分[28-29]。本研究發現了肝移植供體和膽囊結石患者膽汁的差異代謝物，與肝移植供體組比較，膽囊結石組患者膽汁中的牛磺酸結合的膽汁酸和甘氨酸結合的膽汁酸兩種結合型膽汁酸的濃度均明顯降低，而膽汁中的膽汁酸幾乎都以結合型存在，結合型膽汁酸明顯減少后膽固醇溶解能力降低，導致膽汁中膽固醇濃度明顯增加而析出，進而導致膽囊結石形成[12]。但有研究高膽固醇血癥和豚鼠膽囊膽色素結石關系的動物實驗[2]表明，在高血清膽固醇時膽汁中的總膽固醇沒有很大的變化，這與本研究結果不同。此外，本研究結果表明，膽囊結石組膽汁中的 PC 濃度較肝移植供體降低。 PC 濃度降低導致膽囊結石形成的原因可能是，膽汁中有一種由 PC 和膽固醇組成的球泡，它可溶解大多數膽汁內的膽固醇，當 PC 濃度降低后，球泡數量降低，膽固醇不穩定從而析出形成結石[28-29]。
3.3 小結
本研究采用1H-NMR 方法進行代謝組學研究，1H-NMR 法作為一種新的方法，與基因組學、蛋白質組學等相結合后，可幫助我們探索膽囊結石的成因及其致病機制。但由于本研究的樣本量較小，因此需要進一步擴大樣本量，以提高膽囊結石特征代謝產物模型結果的可靠性，進一步研究糖代謝紊亂、氨基酸代謝紊亂與膽囊結石形成的關系及其致病機制。根據本研究結果，可以初步得出，膽囊結石患者和無膽囊結石的健康人的血清代謝物和膽汁代謝物均存在明顯的差異，膽囊結石患者不僅存在脂代謝紊亂，還存在糖代謝紊亂以及氨基酸代謝紊亂。
