引用本文： 朱棟良, 尹小平, 王芳元. 異鼠李素對胃癌細胞增殖及凋亡的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(3): 350-353. doi: 10.7507/1007-9424.201709058 復制
近年來，雖然全球范圍內胃癌的發病率呈下降趨勢，但其死亡率仍居惡性腫瘤相關死亡的第 2 位[1-2]。目前以手術為主的綜合治療仍是胃癌最為有效的治療方法，然而在國內由于胃癌早期診斷率較低，進展期胃癌術后患者的 5 年生存率仍不足 50%[3]。近年來，以赫賽丁、阿帕替尼等為代表的靶向藥物被用于治療復發或轉移的晚期胃癌患者，能夠一定程度上緩解胃癌的疾病進展，但赫賽丁僅能夠用于人類表皮生長因子受體 2（HER2）陽性的患者，限制了其臨床應用，絕大多數靶向藥物較高的藥品價格也增加了患者的經濟負擔[4-7]。為此，臨床亟待開發新的更有效的藥物。黃酮類化合物作為廣泛存在于植物果實莖葉中的化學成分，具有一定的抗炎抗氧化作用，異鼠李素化學名為 3,5,7-三羥基-2-（4-羥基-3-甲氧基苯基）苯并吡喃-4-酮，是從植物中提取的黃酮類似物，近年來發現其對皮膚癌及肺癌細胞的增殖具有一定的抑制作用[8-9]，但其在胃癌中的作用尚無明確報道。本研究擬以胃癌細胞 MKN28 作為研究對象，探索異鼠李素對胃癌細胞增殖及凋亡的作用，并初步探討其可能的機制。
1 材料與方法
1.1 細胞及主要試劑
人胃癌細胞系 MKN28 購自中科院上海細胞庫，異鼠李素購自美國 ChromaDex 公司，以 DMSO 配制成 20 mmol/L 的儲存液備用。CCK8 檢測試劑盒、BrdU/PI 雙摻入檢測試劑盒以及 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡試劑盒購自南京凱基生物有限公司。Bax、p21、p53、Bcl-2、Mcl-1 及內參 GAPDH 抗體均購自上海優寧維生物有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
人 MKN28 胃癌細胞培養于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中，置于 37 ℃、5% CO2 溫箱內常規傳代培養。
1.2.2 用 CCK8 法檢測細胞活性
收集不同濃度（0、5、10、20、40、80 及 160 μmol/L）異鼠李素處理 24 h 后的 MKN28 胃癌細胞 1×106個/mL，按照 CCK-8 試劑盒說明書，每孔加入 10% 的 CCK8 溶液，繼續孵育 4 h 后，利用酶標儀在 450 nm 處測定其吸光度，每組設 5 個復孔，實驗重復 3 次，取均值，以細胞存活百分比作為結果并繪制曲線。
1.2.3 BrdU/PI 雙摻入法測定細胞 DNA 合成及細胞周期
收集不同濃度（0、5、10、20、40 及 80 μmol/L）異鼠李素處理 24 h 后的 MKN28 胃癌細胞 1×106個/mL，摻入 BrdU（10 μmol/L）30 min，PBS 漂洗，75% 冰乙醇固定過夜后，2 mol/L 鹽酸破膜打孔 40 min，0.1 mol/L 四氫硼砂中和，并依此孵育 BrdU 一抗、FITC 標記二抗及 PI 后行流式細胞儀檢測，實驗重復 3 次，取均值。
1.2.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI 法測定細胞凋亡
收集不同濃度（0、5、10、20、40 及 80 μmol/L）異鼠李素處理 24 h 后的 MKN28 胃癌細胞，以 PBS 快速洗滌 2 次，離心棄去上清，加入準備好的 1×Annexin Ⅴ Binding Solution 制備細胞終濃度為 1×106個/mL 的細胞懸液，取上述細胞懸液 100 μL，加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 結合物，室溫避光孵育 30 min，再加入 5 μL 的 PI Solution，室溫避光孵育 10 min。行流式細胞儀檢測，實驗重復 3 次，取均值。
1.2.5 免疫印跡（Western blot）實驗
不同濃度（0、5、10、20、40 及 80 μmol/L）的異鼠李素作用 96 h 后每組各收集 1×106個細胞，裂解獲取細胞總蛋白，各樣品通過 BCA 法檢測蛋白濃度，各蛋白樣品按照上述檢測所得濃度分別取 50 μg 行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 膜轉膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結合，然后依次孵育Ⅰ抗及Ⅱ抗，最后用 ECL 顯色液顯影檢測細胞中 Bax、p21、p53、Bcl-2 及 Mcl-1 蛋白表達情況，以 GAPDH 作為內參。
1.3 統計學方法
用 SPSS 12.0 統計學軟件對數據進行統計分析。實驗數據以均數±標準差（
±s）表示，采用重復測量方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 異鼠李素可抑制 MKN28 胃癌細胞活性
不同濃度的異鼠李素處理 MKN28 胃癌細胞后，細胞活性隨著異鼠李素濃度的增加，細胞活性逐漸降低（P=0.008 7），呈一定的劑量-效應關系，見圖 1。經計算半抑制濃度（IC50）為 62 μmol/L。
圖1
不同濃度異鼠李素對 MKN28 胃癌細胞活性的影響
2.2 異鼠李素可抑制 MKN28 胃癌細胞增殖及細胞周期進程
通過 BrdU/PI 雙摻入法檢測細胞增殖，結果提示，不同濃度異鼠李素處理 MKN28 細胞后，細胞增殖降低，表現為隨著異鼠李素濃度的升高，MKN28 細胞 BrdU 陽性細胞（R2）即處于 DNA 復制的 S 期比例逐漸減少（P=0.027），見圖 2。
圖2
不同濃度異鼠李素對 MKN28 細胞 DNA 合成的影響
2.3 異鼠李素可促進 MKN28 細胞凋亡
通過 ANNEXIN Ⅴ-FITC/PI 法檢測細胞凋亡，結果提示，不同濃度異鼠李素處理 MKN28 細胞后，隨著異鼠李素濃度的升高，MKN28 細胞發生早期凋亡（右上象限）及晚期凋亡（右下象限）的細胞數明顯增加（P=0.019），見圖 3。
圖3
不同濃度異鼠李素對 MKN28 細胞凋亡的影響
2.4 異鼠李素調控 MKN28 細胞中增殖及凋亡相關蛋白表達檢測結果
Western blot 結果提示，隨異鼠李素濃度的升高，MKN28 細胞中 Bax、p21 及 p53 蛋白表達逐漸增強，而 Bcl-2 及 Mcl-1 蛋白表達逐漸減弱，見圖 4。
圖4
不同濃度異鼠李素對 MKN28 細胞中增殖及凋亡相關蛋白表達的影響
3 討論
胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率居于各種惡性腫瘤前列。胃癌在東亞發病率遠高于西方國家，而且國內胃癌的早期診斷率低，術后復發及遠處轉移比率高，治療效果不理想。目前手術切除仍是胃癌最為有效的治療手段，但某些腫瘤術前分期較晚或術后復發轉移使得手術的效果不盡如人意。傳統以氟尿嘧啶、奧沙利鉑、多西他賽等為主的化療緩解率較低，赫賽丁及阿帕替尼等靶向藥物在治療過程中隨著疾病的進展往往出現繼發性耐藥等[2, 3, 10]。這些都使得臨床中胃癌尤其是晚期胃癌的治療效果較差，預后不佳，臨床亟待研究發現新的更為有效的藥物。
近年來隨著腫瘤分子生物學研究的深入，某些中藥提取成分經過純化分離，被證實有一定的抑制腫瘤作用。異鼠李素作為近年來研究的熱點之一，研究證明具有抑制炎癥反應，促進糖脂代謝等多種生物學功能[11-13]。也有研究[14-16]提示，異鼠李素能夠抑制非小細胞肺癌和乳腺癌細胞的增殖，從而發揮抑癌作用。但異鼠李素對胃癌細胞的作用尚不明確。本研究以人胃癌細胞 MKN28 作為研究對象，給予不同濃度的異鼠李素處理，觀察其對 MKN28 增殖及凋亡作用的影響。
本研究發現，異鼠李素可以明顯抑制 MKN28 細胞的活性，而細胞活性包括細胞增殖及細胞死亡兩個方面。細胞周期進程中包括某些檢查點，細胞通過某些細胞周期相關蛋白如 cyclins 及 CDKs 等控制檢查點，從而調控細胞是否能夠進行 DNA 復制，進而影響細胞的增殖，p53 及 p21 能夠與多個 cyclins 及 CDKs 相結合，從而發揮抑制癌癥的作用，本研究發現，隨著異鼠李素濃度的升高，細胞中 p53 及 p21 表達逐漸增強，提示細胞增殖受到明顯抑制。而且 p53 不僅是細胞增殖及細胞周期中的關鍵蛋白，還能夠使不能發生 DNA 損傷修復的細胞進入凋亡途徑。本研究結果顯示，異鼠李素使得促凋亡 Bax 蛋白表達增強，而與之相對應的抑凋亡 Bcl-2 及 Mcl-1 蛋白表達則減弱，提示異鼠李素能夠調控胃癌細胞的增殖及凋亡。
綜上所述，異鼠李素可抑制胃癌 MKN28 細胞增殖，加快細胞凋亡。結果提示，異鼠李素可能會干預胃癌發生發展中某些關鍵蛋白的表達，這為胃癌的臨床治療提供了新的藥物靶點。
近年來，雖然全球范圍內胃癌的發病率呈下降趨勢，但其死亡率仍居惡性腫瘤相關死亡的第 2 位[1-2]。目前以手術為主的綜合治療仍是胃癌最為有效的治療方法，然而在國內由于胃癌早期診斷率較低，進展期胃癌術后患者的 5 年生存率仍不足 50%[3]。近年來，以赫賽丁、阿帕替尼等為代表的靶向藥物被用于治療復發或轉移的晚期胃癌患者，能夠一定程度上緩解胃癌的疾病進展，但赫賽丁僅能夠用于人類表皮生長因子受體 2（HER2）陽性的患者，限制了其臨床應用，絕大多數靶向藥物較高的藥品價格也增加了患者的經濟負擔[4-7]。為此，臨床亟待開發新的更有效的藥物。黃酮類化合物作為廣泛存在于植物果實莖葉中的化學成分，具有一定的抗炎抗氧化作用，異鼠李素化學名為 3,5,7-三羥基-2-（4-羥基-3-甲氧基苯基）苯并吡喃-4-酮，是從植物中提取的黃酮類似物，近年來發現其對皮膚癌及肺癌細胞的增殖具有一定的抑制作用[8-9]，但其在胃癌中的作用尚無明確報道。本研究擬以胃癌細胞 MKN28 作為研究對象，探索異鼠李素對胃癌細胞增殖及凋亡的作用，并初步探討其可能的機制。
1 材料與方法
1.1 細胞及主要試劑
人胃癌細胞系 MKN28 購自中科院上海細胞庫，異鼠李素購自美國 ChromaDex 公司，以 DMSO 配制成 20 mmol/L 的儲存液備用。CCK8 檢測試劑盒、BrdU/PI 雙摻入檢測試劑盒以及 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡試劑盒購自南京凱基生物有限公司。Bax、p21、p53、Bcl-2、Mcl-1 及內參 GAPDH 抗體均購自上海優寧維生物有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
人 MKN28 胃癌細胞培養于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中，置于 37 ℃、5% CO2 溫箱內常規傳代培養。
1.2.2 用 CCK8 法檢測細胞活性
收集不同濃度（0、5、10、20、40、80 及 160 μmol/L）異鼠李素處理 24 h 后的 MKN28 胃癌細胞 1×106個/mL，按照 CCK-8 試劑盒說明書，每孔加入 10% 的 CCK8 溶液，繼續孵育 4 h 后，利用酶標儀在 450 nm 處測定其吸光度，每組設 5 個復孔，實驗重復 3 次，取均值，以細胞存活百分比作為結果并繪制曲線。
1.2.3 BrdU/PI 雙摻入法測定細胞 DNA 合成及細胞周期
收集不同濃度（0、5、10、20、40 及 80 μmol/L）異鼠李素處理 24 h 后的 MKN28 胃癌細胞 1×106個/mL，摻入 BrdU（10 μmol/L）30 min，PBS 漂洗，75% 冰乙醇固定過夜后，2 mol/L 鹽酸破膜打孔 40 min，0.1 mol/L 四氫硼砂中和，并依此孵育 BrdU 一抗、FITC 標記二抗及 PI 后行流式細胞儀檢測，實驗重復 3 次，取均值。
1.2.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI 法測定細胞凋亡
收集不同濃度（0、5、10、20、40 及 80 μmol/L）異鼠李素處理 24 h 后的 MKN28 胃癌細胞，以 PBS 快速洗滌 2 次，離心棄去上清，加入準備好的 1×Annexin Ⅴ Binding Solution 制備細胞終濃度為 1×106個/mL 的細胞懸液，取上述細胞懸液 100 μL，加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 結合物，室溫避光孵育 30 min，再加入 5 μL 的 PI Solution，室溫避光孵育 10 min。行流式細胞儀檢測，實驗重復 3 次，取均值。
1.2.5 免疫印跡（Western blot）實驗
不同濃度（0、5、10、20、40 及 80 μmol/L）的異鼠李素作用 96 h 后每組各收集 1×106個細胞，裂解獲取細胞總蛋白，各樣品通過 BCA 法檢測蛋白濃度，各蛋白樣品按照上述檢測所得濃度分別取 50 μg 行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 膜轉膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結合，然后依次孵育Ⅰ抗及Ⅱ抗，最后用 ECL 顯色液顯影檢測細胞中 Bax、p21、p53、Bcl-2 及 Mcl-1 蛋白表達情況，以 GAPDH 作為內參。
1.3 統計學方法
用 SPSS 12.0 統計學軟件對數據進行統計分析。實驗數據以均數±標準差（
±s）表示，采用重復測量方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 異鼠李素可抑制 MKN28 胃癌細胞活性
不同濃度的異鼠李素處理 MKN28 胃癌細胞后，細胞活性隨著異鼠李素濃度的增加，細胞活性逐漸降低（P=0.008 7），呈一定的劑量-效應關系，見圖 1。經計算半抑制濃度（IC50）為 62 μmol/L。
圖1
不同濃度異鼠李素對 MKN28 胃癌細胞活性的影響
2.2 異鼠李素可抑制 MKN28 胃癌細胞增殖及細胞周期進程
通過 BrdU/PI 雙摻入法檢測細胞增殖，結果提示，不同濃度異鼠李素處理 MKN28 細胞后，細胞增殖降低，表現為隨著異鼠李素濃度的升高，MKN28 細胞 BrdU 陽性細胞（R2）即處于 DNA 復制的 S 期比例逐漸減少（P=0.027），見圖 2。
圖2
不同濃度異鼠李素對 MKN28 細胞 DNA 合成的影響
2.3 異鼠李素可促進 MKN28 細胞凋亡
通過 ANNEXIN Ⅴ-FITC/PI 法檢測細胞凋亡，結果提示，不同濃度異鼠李素處理 MKN28 細胞后，隨著異鼠李素濃度的升高，MKN28 細胞發生早期凋亡（右上象限）及晚期凋亡（右下象限）的細胞數明顯增加（P=0.019），見圖 3。
圖3
不同濃度異鼠李素對 MKN28 細胞凋亡的影響
2.4 異鼠李素調控 MKN28 細胞中增殖及凋亡相關蛋白表達檢測結果
Western blot 結果提示，隨異鼠李素濃度的升高，MKN28 細胞中 Bax、p21 及 p53 蛋白表達逐漸增強，而 Bcl-2 及 Mcl-1 蛋白表達逐漸減弱，見圖 4。
圖4
不同濃度異鼠李素對 MKN28 細胞中增殖及凋亡相關蛋白表達的影響
3 討論
胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率居于各種惡性腫瘤前列。胃癌在東亞發病率遠高于西方國家，而且國內胃癌的早期診斷率低，術后復發及遠處轉移比率高，治療效果不理想。目前手術切除仍是胃癌最為有效的治療手段，但某些腫瘤術前分期較晚或術后復發轉移使得手術的效果不盡如人意。傳統以氟尿嘧啶、奧沙利鉑、多西他賽等為主的化療緩解率較低，赫賽丁及阿帕替尼等靶向藥物在治療過程中隨著疾病的進展往往出現繼發性耐藥等[2, 3, 10]。這些都使得臨床中胃癌尤其是晚期胃癌的治療效果較差，預后不佳，臨床亟待研究發現新的更為有效的藥物。
近年來隨著腫瘤分子生物學研究的深入，某些中藥提取成分經過純化分離，被證實有一定的抑制腫瘤作用。異鼠李素作為近年來研究的熱點之一，研究證明具有抑制炎癥反應，促進糖脂代謝等多種生物學功能[11-13]。也有研究[14-16]提示，異鼠李素能夠抑制非小細胞肺癌和乳腺癌細胞的增殖，從而發揮抑癌作用。但異鼠李素對胃癌細胞的作用尚不明確。本研究以人胃癌細胞 MKN28 作為研究對象，給予不同濃度的異鼠李素處理，觀察其對 MKN28 增殖及凋亡作用的影響。
本研究發現，異鼠李素可以明顯抑制 MKN28 細胞的活性，而細胞活性包括細胞增殖及細胞死亡兩個方面。細胞周期進程中包括某些檢查點，細胞通過某些細胞周期相關蛋白如 cyclins 及 CDKs 等控制檢查點，從而調控細胞是否能夠進行 DNA 復制，進而影響細胞的增殖，p53 及 p21 能夠與多個 cyclins 及 CDKs 相結合，從而發揮抑制癌癥的作用，本研究發現，隨著異鼠李素濃度的升高，細胞中 p53 及 p21 表達逐漸增強，提示細胞增殖受到明顯抑制。而且 p53 不僅是細胞增殖及細胞周期中的關鍵蛋白，還能夠使不能發生 DNA 損傷修復的細胞進入凋亡途徑。本研究結果顯示，異鼠李素使得促凋亡 Bax 蛋白表達增強，而與之相對應的抑凋亡 Bcl-2 及 Mcl-1 蛋白表達則減弱，提示異鼠李素能夠調控胃癌細胞的增殖及凋亡。
綜上所述，異鼠李素可抑制胃癌 MKN28 細胞增殖，加快細胞凋亡。結果提示，異鼠李素可能會干預胃癌發生發展中某些關鍵蛋白的表達，這為胃癌的臨床治療提供了新的藥物靶點。
