引用本文： 侯立朝, 黃亞運, 路越晴, 陽丹才讓, 任利, 周瀛, 王海久, 樊海寧. HIF-1α 基因沉默對人肝癌 SMMC-7721 細胞 VEGF 和 MMP-2 基因表達的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(10): 1206-1212. doi: 10.7507/1007-9424.201704081 復制
原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率和病死率呈上升趨勢[1]。盡管肝癌的臨床研究與治療都取得了長足進步，但預后仍不盡人意，5 年生存率未見明顯提高[2]。腫瘤組織在無限制快速生長過程中，必然會造成局部組織的缺血缺氧。研究[3-6]表明，缺氧是決定惡性腫瘤預后的重要因素之一，缺氧不僅可誘導腫瘤細胞對放療及化療耐受[7]，更重要的是缺氧還促進了腫瘤細胞的生長、浸潤、轉移等惡性生物學行為的發生和發展[8-11]。缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是 Semenza 等[12]于 1992 年首先報道的。研究[13]表明，HIF-1α 在維持腫瘤細胞的能量代謝、新血管形成、細胞增殖等中起重要作用。血管內皮生長因子（VEGF）是 Senger 于 1983 年發現，以前因其具有強大的通透功能而被稱為血管通透因子（VPF）[14-16]。它是目前發現的活性和專屬性最強的血管生成因子，在腫瘤血管生成中起關鍵作用[17]，與腫瘤的發生、侵襲和轉移密切相關。現已發現，正常組織或良性腫瘤組織中， VEGF mRNA 及其蛋白呈陰性或弱陽性表達，而惡性腫瘤組織中則呈強陽性表達，并且 VEGF 及其受體的表達隨腫瘤惡性程度及轉移特性的增加而呈增強趨勢[18-20]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解細胞外基質最重要的酶類，其中以 MMP-2 最為重要，它能降解細胞外基質，從而導致侵襲、轉移和血管生成[21]。目前國內外關于 HIF-1α 與肝癌侵襲和轉移關系的研究仍不多，本實驗以肝癌 SMMC-7721 細胞系為研究對象，利用 RNA 干擾（RNAi）技術沉默 HIF-1α 基因的表達，探討沉默 HIF-1α 基因對下游 VEGF 基因及 MMP-2 基因表達的影響，為臨床的肝癌治療提供科學依據。
1 材料和方法
1.1 主要材料、試劑和設備
表1
RNAi 重組載體的構建及鑒定所需主要材料、試劑和設備
表2
人肝癌 SMMC-7721 細胞重組載體轉染及篩選所需主要試劑和設備
表3
實時定量逆轉錄聚合鏈式反應（RT-PCR）所需主要試劑和設備
1.2 方法
1.2.1 RNAi 重組載體的構建 首先在美國國立生物技術信息中心（NCBI）查到 HIF-1α 基因的序列全長，運用網上設計工具篩選目標序列，設計合成一個最佳目的基因的目標雙鏈 RNA（double stranded RNA，dsRNA）和一個陰性對照基因 dsRNA，分別命名為 HIF-1α-shRNA 及 shRNA-HK。合成的每個 dsRNA 序列的兩條鏈兩端分別有 BamHⅠ和 EcoRⅠ的粘性末端。為在細胞內轉錄出具有生物活性的表達載體，用 BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶切質粒載體 pGenesil-1，然后將 HIF-1α-shRNA 干擾靶序列與質粒序列進行連接，從而將其與 pGenesil-1 載體結合，構建 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體（陰性對照重組載體shRNA-HK-pGenesil-1 以同法構建）。使用 DH5α 菌株制備感受態細菌，將 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體、shRNA-HK-pGenesil-1 重組載體和pGenesil-1 空載體（5 pg～0.5 μg）分別加入 50 μL 感受態細菌中以完成質粒的轉化，然后擴增培養，取小份參照質粒提取試劑盒說明書進行質粒提取。最后分別對構建有 shRNA 表達載體的 pGenesil-1 質粒（包括 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體和陰性對照 shRNA-HK-pGenesil-1 重組載體）進行測序（由 Promega 公司完成），結果構建的每類 shRNA 表達載體中都包含有各自目的 dsRNA 的序列全長，表明 shRNA 表達載體構建成功。
1.2.2 不同 G418 溶液濃度對 SMMC-7721 細胞生長的影響[22] 為了預先確定轉染后細胞進行篩選時所需的 G418 溶液濃度，將正常 SMMC-7721 細胞按 1×105 個/mL 的濃度傳代于 24 孔培養板中，待細胞長至鋪滿瓶底 70%～80% 時換液，加入 0.5 mL 新鮮培養基。各孔中分別加入終濃度為 100、200、300、400、500、600、700 及 800 μg/mL 的 G418 溶液。當培養液變黃時，更換培養液，藥物濃度不變。選擇能夠使細胞在培養 5～6 d 期間全部死亡的藥物濃度為篩選濃度。本試驗最終選擇 500 μg/mL 濃度。
1.2.3 重組載體轉染人肝癌 SMMC-7721 細胞及轉染細胞的篩選 將對數生長期的 SMMC-7721 細胞按 1×105 個/mL 濃度接種于 24 孔培養板中：沉默組、陰性對照組和空白對照組各 3 個復孔。待細胞長至鋪滿孔底 90%～95% 時，進行轉染操作。轉染組和陰性對照組：參照脂質體 2000 轉染試劑說明書，將 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體和 shRNA-HK-pGenesil-1 重組載體分別轉染轉染組和陰性對照組細胞，空白對照組細胞轉染 pGenesil-1 空載體，轉染按說明書要求操作。最后將混合液加入 24 孔培養板中，在 37 ℃、5% CO2 培養箱中孵育 6 h 后更換含血清的 DMEM 培養基，繼續培養至細胞鋪滿瓶底 70%～80% 時，加入濃度為 500 μg/mL 的 G418 溶液進行篩選[22]。定期更換培養液，在正常細胞死亡后（6 d 左右），繼續對轉染細胞進行篩選至第 12～14 天。當鏡下可見存活細胞克隆后，更換新鮮培養液（不含 G418 溶液），待細胞長至鋪滿瓶底 80% 左右時，用 0.25% 胰蛋白酶消化液消化傳代（傳代培養以擴增備用）。每個月對細胞進行 G418 篩選 1 次（方法同前），以避免細胞抗性丟失。
1.2.4 人肝癌 SMMC-7721 細胞的常氧和低氧培養在 25 cm2 培養瓶中接種相同數量（約 1×106 個細胞）的 3 組細胞（n=6），在 20% O2+5% CO2+75% N2 的 37 ℃ 常氧培養箱中培養 1 d 后，轉入 5% O2+5% CO2+90% N2 的 37 ℃ 低氧培養箱中分別培養 6、12 及 24 h，之后采用 RT-PCR 法檢測 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 的表達水平。
1.2.5 RT-PCR 法檢測轉染后 SMMC-7721 細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 的表達 采用美國 Invitrogen 公司的 Trizol RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA 并檢測其純度（參照動物 RNAout 提取試劑說明書進行），反轉錄成 cDNA。反轉錄條件：總 RNA 1 μg，Oligo（dT）18 primer1 μL，DEPC 水 10 μL，混勻，70 ℃ 孵育 5 min；立即置冰上，加入 5×反應緩沖液 4 μL，RNA 酶抑制劑 1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，混勻，37 ℃ 孵育 5 min；加入 M-MulV 反轉錄酶 1 μL，溶液體積總體至 20 μL，42 ℃ 孵育 60 min；72 ℃ 孵育 10 min 后立即冰浴。取反轉錄所得溶液 5 μL 行 PCR。PCR 反應體系：反轉錄產物 cDNA 0.5 μL，目的基因上游引物 0.1 μL（表 4），目的基因下游引物0.1 μL，β-actin 上游引物 0.05 μL，β-actin 下游引物0.05 μL，即用型 PCR 試劑 7.5 μL，加三蒸水補足15 μL。PCR 反應條件：94 ℃ 預變性 4 min，94 ℃ 變性 1 min，60 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，共重復 35 個循環；最后 72 ℃ 延伸 7 min。吸取 10 μL 產物行 1.25% 瓊脂糖凝膠電泳。凝膠分析系統測定各條帶積分光密度值（以灰度表示）。以目的基因條帶和 β-actin 產物條帶灰度值的比值來反映目的基因的表達程度。
表4
各引物序列及擴增產物長度
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，多樣本均數間兩兩比較采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 的電泳結果
常氧組、缺氧 6 h 組、缺氧 12 h 組及缺氧24 h 組總 RNA 的平均光密度（OD）比值即 OD260/OD280 分別為 1.95、1.97、1.98 和 1.98，表明所提取 RNA 的完整性和純度好，可用于 RT-PCR 實驗。3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 表達的電泳結果見圖 1。由于電泳圖只能粗略查看表達情況，筆者進一步進行了半定量分析。
圖1
不同培養條件下 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 表達的電泳圖 1：空白對照組；2：陰性對照組；3：沉默組
2.2 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 表達的半定量結果
2.2.1 HIF-1α mRNA 常氧培養條件下 3 組細胞均未表達 HIF-1α mRNA。低氧培養 6、12 及 24 h 后，沉默組細胞中 HIF-1α mRNA 的表達水平低于同時點空白對照組和陰性對照組（P<0.05），但同時點空白對照組和陰性對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與常氧條件對應組別比較，沉默組、陰性對照組和空白對照組各低氧條件組細胞中 HIF-1αmRNA 的表達水平均較高（P<0.05）；低氧條件下，沉默組、陰性對照組和空白對照組細胞中 HIF-1αmRNA 的表達水平均隨低氧培養時間延長呈下降趨勢，同組內 3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 5。
2.2.2 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 常氧條件下，3 組細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。低氧培養 6、12 及 24 h 后，沉默組細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達水平均低于同時點空白對照組和陰性對照組（P<0.05），但同時點空白對照組和陰性對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與常氧條件對應組別比較，沉默組、陰性對照組和空白對照組各低氧條件組細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達水平均較高（P<0.05）；低氧條件下，3 組細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達水平均呈下降趨勢，同組內 3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 5。
表5
不同培養條件下 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 表達的半定量結果（
，n=6）
3 討論
惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病，其生物學特性主要為侵襲和轉移。腫瘤的侵襲和轉移是一個多步驟、多階段及多因素參與的復雜過程，也可被稱為多階梯瀑布過程：① 早期原發癌生長；② 微血管化；③ 細胞從原發灶脫落、粘附并穿過不完整的基底膜和細胞外基質，侵入循環管道并再次穿出血管，到達其他部位臟器形成轉移灶。腫瘤細胞在無序性、失控性生長過程中會造成局部組織處于缺血缺氧狀態，從而誘導腫瘤細胞合成大量 HIF-1α mRNA。HIF-1α mRNA 是目前所發現的正常細胞以及腫瘤細胞適應缺氧的最關鍵的轉錄因子，在低氧條件下，HIF-1α mRNA 降解被阻斷，從而得以在核內蓄積，進而啟動 60 余種下游靶基因，導致細胞產生一系列適應低氧的變化，使細胞在缺氧的環境下存活甚至繼續生長。很多實體腫瘤存在 HIF-1α 分子的高表達，HIF-1α 分子與腫瘤的侵襲、轉移、耐藥等相關。研究[23]表明，人肝癌細胞中存在 HIF-1α 分子的高表達，它介導的腫瘤細胞耐受缺氧信號傳導通路中與腫瘤發生及發展關系密切的基因有：血管生成相關基因、細胞能量代謝相關基因、侵襲和轉移相關基因、增殖和凋亡相關基因等，針對這些基因的功能研究對將來攻克腫瘤有非常重要的意義。
在惡性腫瘤的生長及轉移過程中新生血管起重要作用，而 VEGF 分子是目前發現的最重要的促進腫瘤血管新生的分子，參與多種腫瘤的發生、發展及轉移。VEGF 分子的主要功能是提高微血管的通透性，刺激內皮細胞的分裂、增殖及遷移，改變內皮細胞的基因表達模式，從而誘導血管生成。腫瘤患者體內 VEGF 蛋白主要來源于腫瘤細胞的分泌，腫瘤細胞為了獲取更多的營養，大量分泌 VEGF 蛋白促進血管新生，它是腫瘤發生、發展、侵襲及轉移過程中的一種重要的介質。
MMPs 在腫瘤的侵襲和轉移過程中起著重要作用，它主要以 3 種機制促進腫瘤細胞的侵襲和生長[24]：① 在蛋白酶作用下使得腫瘤細胞周圍由基質分子如膠原、層黏蛋白（LN）、纖維連接蛋白（FN）等構成的物理屏障被破壞；② MMPs 可以重塑細胞間黏附力，以便于腫瘤細胞向周圍生長；③ MMPs 作用于基質成分后，激發其他一些潛在的生物學活動。MMP-2 是 MMPs 家族中重要的成員，MMP-2 是降解Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原等細胞外基質最主要的酶。免疫組化和原位雜交研究[25]證實，腫瘤細胞與間質細胞中均可表達 MMP-2 分子，但以腫瘤組織的表達相對較高。研究[26-27]證明，MMP-2和 VEGF 分子在腫瘤的發生和發展過程中的表達具有一致性，二者間通過相互作用來共同促進腫瘤的浸潤、轉移及血管生成。
本實驗結果顯示，常氧培養條件下，沉默組、陰性對照組和空白對照組細胞均能表達 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA，且 3 組細胞間 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05)；在低氧培養條件下，缺氧 6 h 時 3 組細胞中 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA 的表達水平均最高，隨著缺氧時間的延長，3 組細胞中 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA 的表達水平逐漸下降。本實驗結果提示，采用 RNAi 技術沉默人肝癌 SMMC-7721 細胞中的 HIF-1α 基因后，在缺氧條件下，其下游基因 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA 的表達水平也降低，提示沉默 HIF-1α 基因可有效抑制缺氧條件下原發性肝癌的浸潤和轉移。從本實驗中也可看出，雖然低氧條件下沉默組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 的表達水平均低于同等條件下的空白對照組和陰性對照組，但仍比常氧條件高，說明沉默 HIF-1α 基因并未完全阻斷腫瘤細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達，可能還有其他機制參與其中，這有待于進一步的研究。此外，筆者還發現了一個有趣的現象，即轉染了 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體的人肝癌 SMMC-7721 細胞不易生長而且很容易污染，其原因還有待在下一步研究中進行探明。
綜上所述，本實驗構建的 shRNA 真核表達載體不僅有效地抑制了 HIF-1α 基因的表達，并且也有效地抑制了其下游基因 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達，證明了 HIF-1α mRNA 是腫瘤缺氧信號傳導通路中的重要因子。靶向抑制 HIF-1α 基因的表達，是抑制腫瘤細胞適應缺氧的關鍵步驟之一，此法有望為研究及治療原發性肝癌提供新的靶點和方法。
原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率和病死率呈上升趨勢[1]。盡管肝癌的臨床研究與治療都取得了長足進步，但預后仍不盡人意，5 年生存率未見明顯提高[2]。腫瘤組織在無限制快速生長過程中，必然會造成局部組織的缺血缺氧。研究[3-6]表明，缺氧是決定惡性腫瘤預后的重要因素之一，缺氧不僅可誘導腫瘤細胞對放療及化療耐受[7]，更重要的是缺氧還促進了腫瘤細胞的生長、浸潤、轉移等惡性生物學行為的發生和發展[8-11]。缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是 Semenza 等[12]于 1992 年首先報道的。研究[13]表明，HIF-1α 在維持腫瘤細胞的能量代謝、新血管形成、細胞增殖等中起重要作用。血管內皮生長因子（VEGF）是 Senger 于 1983 年發現，以前因其具有強大的通透功能而被稱為血管通透因子（VPF）[14-16]。它是目前發現的活性和專屬性最強的血管生成因子，在腫瘤血管生成中起關鍵作用[17]，與腫瘤的發生、侵襲和轉移密切相關。現已發現，正常組織或良性腫瘤組織中， VEGF mRNA 及其蛋白呈陰性或弱陽性表達，而惡性腫瘤組織中則呈強陽性表達，并且 VEGF 及其受體的表達隨腫瘤惡性程度及轉移特性的增加而呈增強趨勢[18-20]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解細胞外基質最重要的酶類，其中以 MMP-2 最為重要，它能降解細胞外基質，從而導致侵襲、轉移和血管生成[21]。目前國內外關于 HIF-1α 與肝癌侵襲和轉移關系的研究仍不多，本實驗以肝癌 SMMC-7721 細胞系為研究對象，利用 RNA 干擾（RNAi）技術沉默 HIF-1α 基因的表達，探討沉默 HIF-1α 基因對下游 VEGF 基因及 MMP-2 基因表達的影響，為臨床的肝癌治療提供科學依據。
1 材料和方法
1.1 主要材料、試劑和設備
表1
RNAi 重組載體的構建及鑒定所需主要材料、試劑和設備
表2
人肝癌 SMMC-7721 細胞重組載體轉染及篩選所需主要試劑和設備
表3
實時定量逆轉錄聚合鏈式反應（RT-PCR）所需主要試劑和設備
1.2 方法
1.2.1 RNAi 重組載體的構建 首先在美國國立生物技術信息中心（NCBI）查到 HIF-1α 基因的序列全長，運用網上設計工具篩選目標序列，設計合成一個最佳目的基因的目標雙鏈 RNA（double stranded RNA，dsRNA）和一個陰性對照基因 dsRNA，分別命名為 HIF-1α-shRNA 及 shRNA-HK。合成的每個 dsRNA 序列的兩條鏈兩端分別有 BamHⅠ和 EcoRⅠ的粘性末端。為在細胞內轉錄出具有生物活性的表達載體，用 BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶切質粒載體 pGenesil-1，然后將 HIF-1α-shRNA 干擾靶序列與質粒序列進行連接，從而將其與 pGenesil-1 載體結合，構建 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體（陰性對照重組載體shRNA-HK-pGenesil-1 以同法構建）。使用 DH5α 菌株制備感受態細菌，將 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體、shRNA-HK-pGenesil-1 重組載體和pGenesil-1 空載體（5 pg～0.5 μg）分別加入 50 μL 感受態細菌中以完成質粒的轉化，然后擴增培養，取小份參照質粒提取試劑盒說明書進行質粒提取。最后分別對構建有 shRNA 表達載體的 pGenesil-1 質粒（包括 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體和陰性對照 shRNA-HK-pGenesil-1 重組載體）進行測序（由 Promega 公司完成），結果構建的每類 shRNA 表達載體中都包含有各自目的 dsRNA 的序列全長，表明 shRNA 表達載體構建成功。
1.2.2 不同 G418 溶液濃度對 SMMC-7721 細胞生長的影響[22] 為了預先確定轉染后細胞進行篩選時所需的 G418 溶液濃度，將正常 SMMC-7721 細胞按 1×105 個/mL 的濃度傳代于 24 孔培養板中，待細胞長至鋪滿瓶底 70%～80% 時換液，加入 0.5 mL 新鮮培養基。各孔中分別加入終濃度為 100、200、300、400、500、600、700 及 800 μg/mL 的 G418 溶液。當培養液變黃時，更換培養液，藥物濃度不變。選擇能夠使細胞在培養 5～6 d 期間全部死亡的藥物濃度為篩選濃度。本試驗最終選擇 500 μg/mL 濃度。
1.2.3 重組載體轉染人肝癌 SMMC-7721 細胞及轉染細胞的篩選 將對數生長期的 SMMC-7721 細胞按 1×105 個/mL 濃度接種于 24 孔培養板中：沉默組、陰性對照組和空白對照組各 3 個復孔。待細胞長至鋪滿孔底 90%～95% 時，進行轉染操作。轉染組和陰性對照組：參照脂質體 2000 轉染試劑說明書，將 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體和 shRNA-HK-pGenesil-1 重組載體分別轉染轉染組和陰性對照組細胞，空白對照組細胞轉染 pGenesil-1 空載體，轉染按說明書要求操作。最后將混合液加入 24 孔培養板中，在 37 ℃、5% CO2 培養箱中孵育 6 h 后更換含血清的 DMEM 培養基，繼續培養至細胞鋪滿瓶底 70%～80% 時，加入濃度為 500 μg/mL 的 G418 溶液進行篩選[22]。定期更換培養液，在正常細胞死亡后（6 d 左右），繼續對轉染細胞進行篩選至第 12～14 天。當鏡下可見存活細胞克隆后，更換新鮮培養液（不含 G418 溶液），待細胞長至鋪滿瓶底 80% 左右時，用 0.25% 胰蛋白酶消化液消化傳代（傳代培養以擴增備用）。每個月對細胞進行 G418 篩選 1 次（方法同前），以避免細胞抗性丟失。
1.2.4 人肝癌 SMMC-7721 細胞的常氧和低氧培養在 25 cm2 培養瓶中接種相同數量（約 1×106 個細胞）的 3 組細胞（n=6），在 20% O2+5% CO2+75% N2 的 37 ℃ 常氧培養箱中培養 1 d 后，轉入 5% O2+5% CO2+90% N2 的 37 ℃ 低氧培養箱中分別培養 6、12 及 24 h，之后采用 RT-PCR 法檢測 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 的表達水平。
1.2.5 RT-PCR 法檢測轉染后 SMMC-7721 細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 的表達 采用美國 Invitrogen 公司的 Trizol RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA 并檢測其純度（參照動物 RNAout 提取試劑說明書進行），反轉錄成 cDNA。反轉錄條件：總 RNA 1 μg，Oligo（dT）18 primer1 μL，DEPC 水 10 μL，混勻，70 ℃ 孵育 5 min；立即置冰上，加入 5×反應緩沖液 4 μL，RNA 酶抑制劑 1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，混勻，37 ℃ 孵育 5 min；加入 M-MulV 反轉錄酶 1 μL，溶液體積總體至 20 μL，42 ℃ 孵育 60 min；72 ℃ 孵育 10 min 后立即冰浴。取反轉錄所得溶液 5 μL 行 PCR。PCR 反應體系：反轉錄產物 cDNA 0.5 μL，目的基因上游引物 0.1 μL（表 4），目的基因下游引物0.1 μL，β-actin 上游引物 0.05 μL，β-actin 下游引物0.05 μL，即用型 PCR 試劑 7.5 μL，加三蒸水補足15 μL。PCR 反應條件：94 ℃ 預變性 4 min，94 ℃ 變性 1 min，60 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，共重復 35 個循環；最后 72 ℃ 延伸 7 min。吸取 10 μL 產物行 1.25% 瓊脂糖凝膠電泳。凝膠分析系統測定各條帶積分光密度值（以灰度表示）。以目的基因條帶和 β-actin 產物條帶灰度值的比值來反映目的基因的表達程度。
表4
各引物序列及擴增產物長度
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，多樣本均數間兩兩比較采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 的電泳結果
常氧組、缺氧 6 h 組、缺氧 12 h 組及缺氧24 h 組總 RNA 的平均光密度（OD）比值即 OD260/OD280 分別為 1.95、1.97、1.98 和 1.98，表明所提取 RNA 的完整性和純度好，可用于 RT-PCR 實驗。3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 表達的電泳結果見圖 1。由于電泳圖只能粗略查看表達情況，筆者進一步進行了半定量分析。
圖1
不同培養條件下 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 表達的電泳圖 1：空白對照組；2：陰性對照組；3：沉默組
2.2 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 表達的半定量結果
2.2.1 HIF-1α mRNA 常氧培養條件下 3 組細胞均未表達 HIF-1α mRNA。低氧培養 6、12 及 24 h 后，沉默組細胞中 HIF-1α mRNA 的表達水平低于同時點空白對照組和陰性對照組（P<0.05），但同時點空白對照組和陰性對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與常氧條件對應組別比較，沉默組、陰性對照組和空白對照組各低氧條件組細胞中 HIF-1αmRNA 的表達水平均較高（P<0.05）；低氧條件下，沉默組、陰性對照組和空白對照組細胞中 HIF-1αmRNA 的表達水平均隨低氧培養時間延長呈下降趨勢，同組內 3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 5。
2.2.2 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 常氧條件下，3 組細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。低氧培養 6、12 及 24 h 后，沉默組細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達水平均低于同時點空白對照組和陰性對照組（P<0.05），但同時點空白對照組和陰性對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與常氧條件對應組別比較，沉默組、陰性對照組和空白對照組各低氧條件組細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達水平均較高（P<0.05）；低氧條件下，3 組細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達水平均呈下降趨勢，同組內 3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 5。
表5
不同培養條件下 3 組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 表達的半定量結果（
，n=6）
3 討論
惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病，其生物學特性主要為侵襲和轉移。腫瘤的侵襲和轉移是一個多步驟、多階段及多因素參與的復雜過程，也可被稱為多階梯瀑布過程：① 早期原發癌生長；② 微血管化；③ 細胞從原發灶脫落、粘附并穿過不完整的基底膜和細胞外基質，侵入循環管道并再次穿出血管，到達其他部位臟器形成轉移灶。腫瘤細胞在無序性、失控性生長過程中會造成局部組織處于缺血缺氧狀態，從而誘導腫瘤細胞合成大量 HIF-1α mRNA。HIF-1α mRNA 是目前所發現的正常細胞以及腫瘤細胞適應缺氧的最關鍵的轉錄因子，在低氧條件下，HIF-1α mRNA 降解被阻斷，從而得以在核內蓄積，進而啟動 60 余種下游靶基因，導致細胞產生一系列適應低氧的變化，使細胞在缺氧的環境下存活甚至繼續生長。很多實體腫瘤存在 HIF-1α 分子的高表達，HIF-1α 分子與腫瘤的侵襲、轉移、耐藥等相關。研究[23]表明，人肝癌細胞中存在 HIF-1α 分子的高表達，它介導的腫瘤細胞耐受缺氧信號傳導通路中與腫瘤發生及發展關系密切的基因有：血管生成相關基因、細胞能量代謝相關基因、侵襲和轉移相關基因、增殖和凋亡相關基因等，針對這些基因的功能研究對將來攻克腫瘤有非常重要的意義。
在惡性腫瘤的生長及轉移過程中新生血管起重要作用，而 VEGF 分子是目前發現的最重要的促進腫瘤血管新生的分子，參與多種腫瘤的發生、發展及轉移。VEGF 分子的主要功能是提高微血管的通透性，刺激內皮細胞的分裂、增殖及遷移，改變內皮細胞的基因表達模式，從而誘導血管生成。腫瘤患者體內 VEGF 蛋白主要來源于腫瘤細胞的分泌，腫瘤細胞為了獲取更多的營養，大量分泌 VEGF 蛋白促進血管新生，它是腫瘤發生、發展、侵襲及轉移過程中的一種重要的介質。
MMPs 在腫瘤的侵襲和轉移過程中起著重要作用，它主要以 3 種機制促進腫瘤細胞的侵襲和生長[24]：① 在蛋白酶作用下使得腫瘤細胞周圍由基質分子如膠原、層黏蛋白（LN）、纖維連接蛋白（FN）等構成的物理屏障被破壞；② MMPs 可以重塑細胞間黏附力，以便于腫瘤細胞向周圍生長；③ MMPs 作用于基質成分后，激發其他一些潛在的生物學活動。MMP-2 是 MMPs 家族中重要的成員，MMP-2 是降解Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原等細胞外基質最主要的酶。免疫組化和原位雜交研究[25]證實，腫瘤細胞與間質細胞中均可表達 MMP-2 分子，但以腫瘤組織的表達相對較高。研究[26-27]證明，MMP-2和 VEGF 分子在腫瘤的發生和發展過程中的表達具有一致性，二者間通過相互作用來共同促進腫瘤的浸潤、轉移及血管生成。
本實驗結果顯示，常氧培養條件下，沉默組、陰性對照組和空白對照組細胞均能表達 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA，且 3 組細胞間 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05)；在低氧培養條件下，缺氧 6 h 時 3 組細胞中 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA 的表達水平均最高，隨著缺氧時間的延長，3 組細胞中 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA 的表達水平逐漸下降。本實驗結果提示，采用 RNAi 技術沉默人肝癌 SMMC-7721 細胞中的 HIF-1α 基因后，在缺氧條件下，其下游基因 MMP-2 mRNA 和 VEGF mRNA 的表達水平也降低，提示沉默 HIF-1α 基因可有效抑制缺氧條件下原發性肝癌的浸潤和轉移。從本實驗中也可看出，雖然低氧條件下沉默組細胞中 HIF-1α mRNA、VEGF mRNA 及 MMP-2 mRNA 的表達水平均低于同等條件下的空白對照組和陰性對照組，但仍比常氧條件高，說明沉默 HIF-1α 基因并未完全阻斷腫瘤細胞中 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達，可能還有其他機制參與其中，這有待于進一步的研究。此外，筆者還發現了一個有趣的現象，即轉染了 HIF-1α-shRNA-pGenesil-1 重組載體的人肝癌 SMMC-7721 細胞不易生長而且很容易污染，其原因還有待在下一步研究中進行探明。
綜上所述，本實驗構建的 shRNA 真核表達載體不僅有效地抑制了 HIF-1α 基因的表達，并且也有效地抑制了其下游基因 VEGF mRNA 和 MMP-2 mRNA 的表達，證明了 HIF-1α mRNA 是腫瘤缺氧信號傳導通路中的重要因子。靶向抑制 HIF-1α 基因的表達，是抑制腫瘤細胞適應缺氧的關鍵步驟之一，此法有望為研究及治療原發性肝癌提供新的靶點和方法。
