引用本文： 杜晨陽, 王振, 宋虎, 李世朋, 張海明, 張建軍. AMPK 通過調控 mTOR/Nix 信號通路參與小鼠肝缺血-再灌注損傷. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(10): 1191-1199. doi: 10.7507/1007-9424.201704050 復制
肝臟缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝臟創傷、肝切除和肝移植中最常見的損傷之一，是影響患者肝臟手術效果和生存預后的重要因素[1-2]。缺血-再灌注（IR）損傷的機制復雜，目前尚不十分清楚[3]。自噬（autophagy）是細胞內重要的降解途徑，可以將胞質內受損或不必要的細胞器靶向運送至溶酶體降解，以維持細胞內環境的穩定[4-5]。線粒體自噬（mitophagy）是一種選擇性自噬，能夠特異性通過溶酶體降解受損的線粒體[6]。研究[7]顯示，調控自噬可能成為減輕 HIRI 的有效措施。Nip3 樣蛋白 X（Nix）是 BH3 家族相關蛋白，能夠誘導細胞自噬和凋亡[8]。Nix 通過調節線粒體自噬參與靶向清除由缺血及缺氧造成的受損線粒體，減少損傷線粒體所致氧化應激的同時，為細胞提供能量[9]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是自噬的主要負性調節因子，下調 mTOR 有助于提高自噬活性[10]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是細胞內的一種能量調節蛋白，在調節細胞能量代謝中起重要作用。AMPK 可通過抑制 mTOR 來激活自噬和線粒體自噬[11]。凋亡（apoptosis）是受損或無功能細胞的自我清除過程。自噬和凋亡是應激細胞中兩種主要的應答形式，它們通常是共調節的，但產生的作用卻是相反的[12]。本實驗探討了在小鼠 HIRI 過程中 AMPK 的作用及其機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料及設備
42 只健康雄性 SPF 級 C57 小鼠，體質量 20～24 g，鼠齡 7～8 周，由天津醫科大學實驗動物中心提供。mTOR 抑制劑雷帕霉素（Rapa）和 AMPK 抑制劑 Compound C 均購于美國 Selleck 公司，兔抗鼠 mTOR、磷酸化型哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、腺苷酸活化蛋白激酶 α（AMPKα）、磷酸化型腺苷酸活化蛋白激酶 α（p-AMPKα）、Nix、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）、分裂型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved Caspase-3）、BCL-2 同源的水溶性相關蛋白（Bax）、增殖細胞核抗原（PCNA）、自噬微管相關蛋白輕鏈 3（LC3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗及免疫組化染色試劑盒均購于美國 CST 公司，羅丹明染料購于德國 Sigma 公司，原位細胞凋亡檢測試劑盒購于德國羅氏公司。主要設備包括中國海力孚 HF240-300 生化分析儀、日本奧林巴斯 IX73 熒光顯微鏡及美國 Bio-Rad PowerPac Basic 電泳儀。
1.2 方法
本實驗的思路是，首先比較各時點 IR 組（2、6、12 及 24 h）和 Sham 組小鼠的血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）濃度，并取肝組織行 HE 染色觀察肝臟組織的病理學改變，行免疫組化染色以觀察 PCNA 的表達，行蛋白印跡實驗（Western blot 法）檢測自噬、凋亡相關蛋白的表達，用于篩選 IR 最佳缺血時間；之后再比較 IR 最佳時點組、Compound C 組及 Compound C+Rapa 組間的指標差異，因實驗前并不知道哪個時點組最佳，因此每個時點 IR 組均留取了相應標本以便于后期的比較。
1.2.1 建立小鼠 HIRI 模型 將小鼠隨機（隨機數字表法）分為假手術組（Sham 組）、4 個時點 IR 組（2、6、12 及 24 h）、Compound C 組及 Compound C+Rapa 組，每組 6 只小鼠。Compound C 組：腹腔注射 Compound C（25 mg/kg）[13]1 h 后，建模。Compound C+Rapa 組：腹腔注射 Rapa（1 mg/kg）[14-15]和 Compound C（25 mg/kg）1 h 后，建模。各組小鼠建模前均禁食 8 h、不禁水。各組小鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，固定，取腹部正中縱行切口進腹（切口長 3～5 cm），暴露腹腔內各個臟器。除 Sham 組外，其余組小鼠均應用血管夾夾閉肝左、中葉脈管（包括門靜脈、肝動脈與膽道）的共干 1 h，以實現 70%的肝臟缺血。達到預定缺血時間后松開血管夾，隨后關腹。Sham 組小鼠僅行開腹、游離第一肝門以及關腹操作，不行血管夾閉。Sham 組保證開腹操作和開腹所用的時間與其他組相同。本實驗期間小鼠均未死亡。
1.2.2 血生化檢測 Sham 組（關腹后立即再次開腹）和 IR 組（分別為建模后 2、6、12 及 24 h）小鼠經下腔靜脈取血 1 mL，3 000 r/min 離心 15 min（r=6 cm）取血清，在天津市第一中心醫院檢驗科檢測 ALT 和 AST 濃度。
1.2.3 HE 染色 經下腔靜脈取血后，Sham 組和各時點 IR 組小鼠采用頸椎脫臼法處死，取肝臟左、中葉組織（部分用于后續蛋白印跡實驗），行 4% 多聚甲醛固定，再行常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明，制作組織石蠟塊，按照常規步驟行 HE 染色，以觀察小鼠肝組織的病理學改變。
1.2.4 蛋白印跡法檢測小鼠肝組織中自噬、凋亡相關蛋白的表達 取小鼠肝組織，加入 400 μL 蛋白裂解液并勻漿，提取組織蛋白。用 BCA 法進行蛋白定量，取 10 μL 蛋白進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE ），轉膜、封閉后加適量（以完全覆蓋聚偏二氟乙烯膜即 PVDF 膜為宜）一抗，包括兔抗鼠 mTOR、p-mTOR、AMPKα、p-AMPKα、Nix、Caspase-3、Bax、LC3 與 GAPDH，均以 1∶1 000 稀釋），4 ℃ 孵育過夜。以 TBST 緩沖液洗滌后加入適量（以充分覆蓋 PVDF 膜為宜）羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗（1∶5 000），室溫緩慢孵育 1 h。洗膜后將等體積的化學發光液的 A 液和 B 液充分混合，然后與 PVDF 膜反應，曝光顯影。保存顯影后的圖片，截取目的蛋白條帶，在 Photoshop 中進行條帶的灰度值分析，以目的蛋白條帶和 GAPDH 條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。通過血生化檢測結果、HE 染色結果和自噬及凋亡相關蛋白的表達結果，篩選出最佳缺血時點（本實驗為 12 h）。后期， Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠于建模后 12 h 處死，取肝組織以同法檢測自噬及凋亡相關蛋白的表達。
1.2.5 免疫組化染色和羅丹明 123 染色 確定 IR 最佳時點為 12 h 后，Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠于建模后 12 h 處死，取肝臟組織制作石蠟塊，方法同 1.2.3。對 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠的肝組織切片進行免疫組化染色，以觀察肝組織中 PCNA 的表達與分布。免疫組化染色操作參照試劑盒說明書進行；同時行常規羅丹明 123 染色，以觀察線粒體損傷程度。
1.2.6 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法（TUNEL 法）檢測小鼠肝臟細胞的凋亡情況 IR-12 h 組、Compound C 組和 Comp-ound C+Rapa 組小鼠肝臟石蠟切片常規脫蠟、脫水。經過蛋白酶 K 消化處理后滴加 10 μL（以完全覆蓋組織為宜）TUNEL 反應混合液，在 37 ℃ 濕盒中避光孵育 1 h。后滴加 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）10 μL，在熒光顯微鏡下觀察肝細胞的凋亡情況。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料的統計方法采用單因素方差分析（兩兩比較采用 SNK 法）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Sham 組和各時點 IR 組小鼠的血清 ALT 以及 AST濃度比較
與 Sham 組比較，各時點 IR 組小鼠的血清 ALT 和 AST 濃度均較高（P<0.05）；與 IR-12 h 組比較，IR-2 h組、IR-6 h 組及 IR-24 h 組小鼠的 ALT 和 AST 濃度均較低（P<0.05）。見圖 1。
圖1
示 Sham 組和各時點 IR 組小鼠血清 ALT 和 AST 檢測結果 與 Sham 組同指標比較，*P<0.05；與 IR-12 h 組同指標比較，#P<0.05
2.2 Sham 組和各時點 IR 組小鼠肝組織的病理學改變
光鏡下所見，Sham 組小鼠的肝小葉結構尚清晰，肝細胞排列比較整齊，未見明顯的中性粒細胞浸潤和肝細胞壞死；IR-2 h 組小鼠的肝小葉組織結構欠清晰，肝細胞排列較整齊，在匯管區內可見膽管增生，僅見少量中性粒細胞浸潤；IR-6 h 組小鼠則出現部分肝小葉結構紊亂，部分肝細胞壞死，可見中性粒細胞浸潤、膽小管及上皮增生，中央靜脈周圍可見片狀的肝細胞壞死，肝竇內可見大量的中性粒細胞浸潤；IR-12 h 組小鼠的肝小葉結構明顯紊亂，出現大片肝細胞壞死，肝竇內可見大量的中性粒細胞浸潤；IR-24 h 組小鼠的肝小葉結構不清，肝細胞排列欠整齊，可見少量的中性粒細胞浸潤。各時點 IR 組中，IR-12 h 組小鼠的肝組織結構破壞最為嚴重（圖 2）。
圖2
示 Sham 組和各時點 IR 組小鼠肝臟組織的病理學改變（HE ×200） a：Sham 組；b：IR-2 h 組；c：IR-6 h 組；d：IR-12 h 組；e：IR-24 h 組
2.3 Sham 組和各時點 IR 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白的表達
電泳結果顯示，總體上看，各時點 IR 組小鼠肝組織中 AMPKα、p-AMPKα、Nix 和 Bax 表達均較 Sham 組上調，且 IR-12 h 組的表達最強；各時點 IR 組小鼠肝組織中 p-mTOR 的表達均弱于 Sham 組（主要觀察 p-mTOR），且 IR-12 h 組的表達最弱（圖 3）。半定量結果顯示：與 IR-12 h 組比較，Sham 組，IR-2 h 組、IR-6 h 組及 IR-24 h 組的 AMPKα、p-AMPKα、Nix 及 Bax 的表達水平，以及 LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ 比值均較低（P<0.05），而 p-mTOR 的表達水平均較高（P<0.05），見圖 4。綜合蛋白印跡結果、血生化檢測結果和 HE 染色結果，確定 IR-12 h 為最典型的時點。
圖3
示 Sham 組和各時點IR 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白的電泳結果 ①：Sham 組；② IR-2 h 組；③ IR-6 h 組；④ IR-12 h 組；⑤ IR-24 h 組
圖4
示 Sham 組、IR-2 h 組、IR-6 h 組、IR-12 h 組和 IR-24 h 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白表達的半定量結果 a：AMPKα；b：p-AMPKα；c：p-mTOR；d：Nix；e：LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ 比值；f：Bax；與 IR-12 h 組比較，*P<0.05
2.4 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織的免疫組化染色結果
光鏡下所見，PCNA 染色主要出現在細胞核中，細胞核中見大量棕褐色顆粒，細胞質和細胞膜呈弱表達或無表達。IR-12 h 組小鼠的肝細胞核中可見大量的棕褐色顆粒；相較于 IR-12 h 組，Compound C 組小鼠肝細胞的細胞核中棕褐色顆粒明顯減少，且染色也變淺；Compound C+Rapa 組小鼠肝細胞的細胞核中棕褐色顆粒明顯較 Compound C 組增多，且染色較深，與 IR-12 h 組相比較細胞核內棕褐色顆粒也增多（圖 5a–5c）。半定量結果表明：與 IR-12 h 組比較，Compound C 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達水平較低（P<0.05），而 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達水平較高（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達水平較高（P<0.05），見圖 5d。
圖5
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達結果 a、b 及 c：IR-12 h 組（a）、Compound C 組（b）及 Compound C+Rapa 組（c）小鼠肝組織的免疫組化染色結果（SABC ×200）；d：半定量結果
2.5 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織的羅丹明 123 染色結果
正常情況下由于線粒體膜電位的存在，帶陽離子的羅丹明 123 會聚集到線粒體上，當線粒體損傷、膜電位下降時，羅丹明 123 聚集減少，使發光強度減弱。熒光顯微鏡下見，IR-12 h 組小鼠肝組織的發光強度較強。Compound C 組小鼠肝組織的發光強度較 IR-12 h 組明顯降低，說明線粒體膜電位較 IR-12 h 組明顯下降，線粒體損傷嚴重。Compound C+Rapa 組小鼠肝組織的發光強度較 Compound C 組增強，提示線粒體膜電位較 Com-pound C 組提高，線粒體損傷減輕；但與 IR-12 h 組比較相差不大（圖 6）。
圖6
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中的線粒體改變（羅丹明染色 ×200） a：IR-12 h 組；b：Compound C 組；c：Compound C+Rapa 組
2.6 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織的細胞凋亡情況
熒光顯微鏡下可見，紅色為 TUNEL 標記的凋亡細胞，藍色為 DAPI 標記的細胞核。IR-12 h 組小鼠的肝組織中可見紅色凋亡細胞較少；Compound C 組小鼠的肝細胞凋亡數量較 IR-12 h 組小鼠明顯增高；Compound C+Rapa 組小鼠的肝細胞凋亡數量較 Compound C 組小鼠明顯下降，與 IR-12 h 組比較稍下降（圖 7）。
圖7
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝細胞的凋亡情況（TUNNEL 染色 ×100） a：IR-12 h 組；b：Compound C 組；c：Compound C+Rapa 組
2.7 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白的表達
2.7.1 電泳結果 電泳結果顯示，與 IR-12 h 組比較，Compound C 組的 p-AMPKα 和 Nix 的表達下調，p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達上調，AMPKα 的表達差異不大；Compound C+Rapa 組的 AMPKα、p-AMPKα、p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達下調，Nix 的表達上調。與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組的 AMPKα 和 p-AMPKα 的表達差距不大，p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達下調，Nix 的表達上調。具體見圖 8。
圖8
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白的電泳結果 ①：IR-12 h 組；②：Compound C 組；③：Compound C+Rapa 組
2.7.2 半定量結果 ① AMPKα。與 IR-12 h 組比較，Compound C 組肝組織中 AMPKα 的表達水平的差異無統計學意義（P>0.05），而 Compound C+Rapa 組的 AMPKα 的表達水平較高（P<0.05）；與Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 AMPKα 的表達水平較高（P<0.05）。② p-AMPKα。與 IR-12 h 組比較，Compound C 和 Compound C+Rapa 組肝組織中 p-AMPKα 的表達水平均較低（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 p-AMPKα 的表達水平略升高（P<0.05）。③ p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3。與 IR-12 h 組比較，Compound C 組肝組織中 p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達水平均較高（P<0.05），Compound C+Rapa 組肝組織中 p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達水平均較低（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達水平均較低（P<0.05）。④ Nix。與 IR-12 h 組比較，Compound C 組肝組織中 Nix 的表達水平降低（P<0.05），Compound C+Rapa 組肝組織中 Nix 的表達水平較高（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 Nix 的表達水平較高（P<0.05）。⑤ LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 比值。與 IR-12 h 組比較，Compound C 組和 Compound C+Rapa 組肝組織中 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 比值均較低（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值較高（P<0.05）。具體見圖 9。
圖9
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中各蛋白的半定量結果 a：AMPKα；b：p-AMPKα；c：p-mTOR；d：Nix；e：LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ 比值；f：Caspase-3；g：Cleaved Caspase-3；與 IR-12 h 組比較，*P<0.05；與 Compound C 組比較，#P<0.05
3 討論
肝移植是終末期肝臟疾病的有效治療方式。HIRI 是肝臟手術過程中的嚴重并發癥。由于供體短缺和邊緣性供體的使用，更加重了供肝的 HIRI 程度，嚴重影響手術效果及患者預后。HIRI 的機制復雜，與炎癥反應、代謝障礙、細胞活化、氧化應激等密切相關，上述各因素之間相互制約、相互促進[16-17]。最大限度減輕 IR 損傷是肝臟外科臨床實踐和實驗研究中亟待解決的問題[18]。
3.1 自噬及自噬相關蛋白
自噬在許多生理過程（如發育、先天免疫防御、蛋白質質量控制、細胞存活、細胞死亡等）中，以及在包括癌癥、神經變性疾病、代謝紊亂等疾病的發病中起重要作用[19]。發生 IR 損傷的器官其自噬水平會有不同程度的上調。研究[20-22]表明，在 HIRI 過程中，自噬起重要的保護作用。線粒體自噬是一種特殊的選擇性自噬，能調節線粒體內環境穩態，及時清除受損傷的線粒體。線粒體自噬被抑制，則會引起受損線粒體聚集、超氧化物歧化酶（ROS）異常增加、線粒體 DNA 突變和能量衰竭，最終導致細胞死亡。在 HIRI 過程中，線粒體自噬能有效保護線粒體功能，對減輕肝細胞的損傷發揮重要作用[23]。
3.1.1 AMPK 和 mTOR AMPK 可以通過增高的 AMP/ATP 比值激活，是能量平衡的主要調節器[24]。研究[25]證明能量感受器 AMPK 能夠通過多種下游信號通路，如 mTOR、真核延伸因子 2（eEF2）及 p27 來調節自噬活性；mTOR 負性調節自噬，而 AMPK 對 mTOR 的下調作用已被認為是影響自噬的重要調節通路。Compound C 是廣泛使用的 AMPK 抑制劑[26]。Compound C 通過抑制 AMPK 活化，解除其對 mTOR 的抑制作用[12]，而抑制 mTOR 可以激活線粒體自噬[27]。亦有文獻[28]報道，pp242 能抑制 mTOR，激活線粒體自噬，發揮抗凋亡作用。此外，Park 等[29]通過研究證明了 mTOR 和 AMPK 可以通過調控哺乳動物自噬啟動 ATG1 激酶 1（ULK1）來調節饑餓誘導的自噬，減少細胞凋亡。
3.1.2 Nix 線粒體外膜蛋白 Nix 和 Bcl-2 家族的 BH3-only 成員均是特定的選擇性自噬受體，能直接結合 LC3，激活線粒體自噬[30-31]。據報道[32]，在 IR 狀況下，Nix 能激活線粒體自噬，清除受損的線粒體，減輕細胞損傷，發揮保護作用。 有研究者[33]通過建立小鼠的 HIRI 模型，發現在 IR 組中干擾素調節因子 1（IRF-1）的表達水平增高，線粒體自噬相關蛋白 Nix 的表達水平下降，線粒體損傷加重，凋亡增加；進一步建立體外 HIRI 模型并沉默 IRF-1 基因的表達后，發現肝細胞內自噬體增加、線粒體自噬相關蛋白表達上調，細胞凋亡減少。Mazure 等[34]通過研究發現，Nix 在缺氧狀態下能激活線粒體自噬，敲除 Nix 基因可以促進缺氧狀態下細胞的死亡。李麗君等[35]報道，在癌細胞受到的刺激較輕微時，Nix 誘導的普通線粒體自噬促進了細胞的生存；當環境進一步惡化時，Nix 誘導的過度線粒體自噬反而可以促進細胞凋亡。
3.1.3 PCDA 有文獻[36]通過建立小鼠 HIRI 模型，發現 miR-30b 能通過降低 Atg12-Atg5 復合體形成，進而下調 PCNA 的表達，最終肝細胞凋亡減少，HIRI 減輕。
3.2 AMPK 通過調控 mTOR/Nix 信號通路參與 HIRI 過程
基于以上研究背景，本實驗就 AMPK 通過調控 mTOR/Nix 信號通路參與小鼠 HIRI 的作用機制進行了研究。實驗結果表明，IR-12 h 組的 AST 和 ALT 濃度最高，AMPKα、p-AMPKα、Nix、 Bax 的表達水平，以及 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 比值均最高，而 p-mTOR的表達水平最低。該實驗研究提示，再灌注 12 h 時肝臟損傷最嚴重。為進一步研究其作用機制，本實驗分別對小鼠給予腹腔注射 Compound C 及 Compound C+Rapa 預處理，1 h 后建立小鼠 HIRI 模型，于建模 12 h 時檢測自噬、凋亡相關蛋白的表達，以及肝細胞凋亡和線粒體損傷情況。結果發現：Compound C 組小鼠肝組織中 PCNA的表達 水平較 IR-12 h 組低，線粒體損傷嚴重，凋亡增加，Nix 的表達下調，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 比值下降，Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達上調；Compound C+ Rapa 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達水平較 Compound C組高，線粒體損傷較輕，凋亡減少，p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達下調，Nix 的表達上調。該結果提示，抑制 AMPK 可以上調 p-mTOR 的表達、下調 Nix 的表達，進而降低線粒體自噬，增加肝細胞凋亡，加重肝細胞損傷；通過加入Rapa 抑制 mTOR 后，p-mTOR 的表達下調，Nix 的表達上調，從而增強線粒體自噬，減輕了肝細胞凋亡，一定程度上減輕了肝細胞損傷。
綜上所述，筆者認為，IR 可促進 AMPK 的磷酸化，并通過抑制 mTOR 的活化，激活線粒體自噬，進而減輕肝細胞損傷。HIRI 過程中，AMPK 通過調控 mTOR/Nix 信號通路激活線粒體自噬，保護肝細胞損傷。 此研究為預防及治療肝臟外科中的 HIRI 提供了新方向。
肝臟缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝臟創傷、肝切除和肝移植中最常見的損傷之一，是影響患者肝臟手術效果和生存預后的重要因素[1-2]。缺血-再灌注（IR）損傷的機制復雜，目前尚不十分清楚[3]。自噬（autophagy）是細胞內重要的降解途徑，可以將胞質內受損或不必要的細胞器靶向運送至溶酶體降解，以維持細胞內環境的穩定[4-5]。線粒體自噬（mitophagy）是一種選擇性自噬，能夠特異性通過溶酶體降解受損的線粒體[6]。研究[7]顯示，調控自噬可能成為減輕 HIRI 的有效措施。Nip3 樣蛋白 X（Nix）是 BH3 家族相關蛋白，能夠誘導細胞自噬和凋亡[8]。Nix 通過調節線粒體自噬參與靶向清除由缺血及缺氧造成的受損線粒體，減少損傷線粒體所致氧化應激的同時，為細胞提供能量[9]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是自噬的主要負性調節因子，下調 mTOR 有助于提高自噬活性[10]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是細胞內的一種能量調節蛋白，在調節細胞能量代謝中起重要作用。AMPK 可通過抑制 mTOR 來激活自噬和線粒體自噬[11]。凋亡（apoptosis）是受損或無功能細胞的自我清除過程。自噬和凋亡是應激細胞中兩種主要的應答形式，它們通常是共調節的，但產生的作用卻是相反的[12]。本實驗探討了在小鼠 HIRI 過程中 AMPK 的作用及其機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料及設備
42 只健康雄性 SPF 級 C57 小鼠，體質量 20～24 g，鼠齡 7～8 周，由天津醫科大學實驗動物中心提供。mTOR 抑制劑雷帕霉素（Rapa）和 AMPK 抑制劑 Compound C 均購于美國 Selleck 公司，兔抗鼠 mTOR、磷酸化型哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、腺苷酸活化蛋白激酶 α（AMPKα）、磷酸化型腺苷酸活化蛋白激酶 α（p-AMPKα）、Nix、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）、分裂型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved Caspase-3）、BCL-2 同源的水溶性相關蛋白（Bax）、增殖細胞核抗原（PCNA）、自噬微管相關蛋白輕鏈 3（LC3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗及免疫組化染色試劑盒均購于美國 CST 公司，羅丹明染料購于德國 Sigma 公司，原位細胞凋亡檢測試劑盒購于德國羅氏公司。主要設備包括中國海力孚 HF240-300 生化分析儀、日本奧林巴斯 IX73 熒光顯微鏡及美國 Bio-Rad PowerPac Basic 電泳儀。
1.2 方法
本實驗的思路是，首先比較各時點 IR 組（2、6、12 及 24 h）和 Sham 組小鼠的血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）濃度，并取肝組織行 HE 染色觀察肝臟組織的病理學改變，行免疫組化染色以觀察 PCNA 的表達，行蛋白印跡實驗（Western blot 法）檢測自噬、凋亡相關蛋白的表達，用于篩選 IR 最佳缺血時間；之后再比較 IR 最佳時點組、Compound C 組及 Compound C+Rapa 組間的指標差異，因實驗前并不知道哪個時點組最佳，因此每個時點 IR 組均留取了相應標本以便于后期的比較。
1.2.1 建立小鼠 HIRI 模型 將小鼠隨機（隨機數字表法）分為假手術組（Sham 組）、4 個時點 IR 組（2、6、12 及 24 h）、Compound C 組及 Compound C+Rapa 組，每組 6 只小鼠。Compound C 組：腹腔注射 Compound C（25 mg/kg）[13]1 h 后，建模。Compound C+Rapa 組：腹腔注射 Rapa（1 mg/kg）[14-15]和 Compound C（25 mg/kg）1 h 后，建模。各組小鼠建模前均禁食 8 h、不禁水。各組小鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，固定，取腹部正中縱行切口進腹（切口長 3～5 cm），暴露腹腔內各個臟器。除 Sham 組外，其余組小鼠均應用血管夾夾閉肝左、中葉脈管（包括門靜脈、肝動脈與膽道）的共干 1 h，以實現 70%的肝臟缺血。達到預定缺血時間后松開血管夾，隨后關腹。Sham 組小鼠僅行開腹、游離第一肝門以及關腹操作，不行血管夾閉。Sham 組保證開腹操作和開腹所用的時間與其他組相同。本實驗期間小鼠均未死亡。
1.2.2 血生化檢測 Sham 組（關腹后立即再次開腹）和 IR 組（分別為建模后 2、6、12 及 24 h）小鼠經下腔靜脈取血 1 mL，3 000 r/min 離心 15 min（r=6 cm）取血清，在天津市第一中心醫院檢驗科檢測 ALT 和 AST 濃度。
1.2.3 HE 染色 經下腔靜脈取血后，Sham 組和各時點 IR 組小鼠采用頸椎脫臼法處死，取肝臟左、中葉組織（部分用于后續蛋白印跡實驗），行 4% 多聚甲醛固定，再行常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明，制作組織石蠟塊，按照常規步驟行 HE 染色，以觀察小鼠肝組織的病理學改變。
1.2.4 蛋白印跡法檢測小鼠肝組織中自噬、凋亡相關蛋白的表達 取小鼠肝組織，加入 400 μL 蛋白裂解液并勻漿，提取組織蛋白。用 BCA 法進行蛋白定量，取 10 μL 蛋白進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE ），轉膜、封閉后加適量（以完全覆蓋聚偏二氟乙烯膜即 PVDF 膜為宜）一抗，包括兔抗鼠 mTOR、p-mTOR、AMPKα、p-AMPKα、Nix、Caspase-3、Bax、LC3 與 GAPDH，均以 1∶1 000 稀釋），4 ℃ 孵育過夜。以 TBST 緩沖液洗滌后加入適量（以充分覆蓋 PVDF 膜為宜）羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗（1∶5 000），室溫緩慢孵育 1 h。洗膜后將等體積的化學發光液的 A 液和 B 液充分混合，然后與 PVDF 膜反應，曝光顯影。保存顯影后的圖片，截取目的蛋白條帶，在 Photoshop 中進行條帶的灰度值分析，以目的蛋白條帶和 GAPDH 條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。通過血生化檢測結果、HE 染色結果和自噬及凋亡相關蛋白的表達結果，篩選出最佳缺血時點（本實驗為 12 h）。后期， Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠于建模后 12 h 處死，取肝組織以同法檢測自噬及凋亡相關蛋白的表達。
1.2.5 免疫組化染色和羅丹明 123 染色 確定 IR 最佳時點為 12 h 后，Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠于建模后 12 h 處死，取肝臟組織制作石蠟塊，方法同 1.2.3。對 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠的肝組織切片進行免疫組化染色，以觀察肝組織中 PCNA 的表達與分布。免疫組化染色操作參照試劑盒說明書進行；同時行常規羅丹明 123 染色，以觀察線粒體損傷程度。
1.2.6 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法（TUNEL 法）檢測小鼠肝臟細胞的凋亡情況 IR-12 h 組、Compound C 組和 Comp-ound C+Rapa 組小鼠肝臟石蠟切片常規脫蠟、脫水。經過蛋白酶 K 消化處理后滴加 10 μL（以完全覆蓋組織為宜）TUNEL 反應混合液，在 37 ℃ 濕盒中避光孵育 1 h。后滴加 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）10 μL，在熒光顯微鏡下觀察肝細胞的凋亡情況。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料的統計方法采用單因素方差分析（兩兩比較采用 SNK 法）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Sham 組和各時點 IR 組小鼠的血清 ALT 以及 AST濃度比較
與 Sham 組比較，各時點 IR 組小鼠的血清 ALT 和 AST 濃度均較高（P<0.05）；與 IR-12 h 組比較，IR-2 h組、IR-6 h 組及 IR-24 h 組小鼠的 ALT 和 AST 濃度均較低（P<0.05）。見圖 1。
圖1
示 Sham 組和各時點 IR 組小鼠血清 ALT 和 AST 檢測結果 與 Sham 組同指標比較，*P<0.05；與 IR-12 h 組同指標比較，#P<0.05
2.2 Sham 組和各時點 IR 組小鼠肝組織的病理學改變
光鏡下所見，Sham 組小鼠的肝小葉結構尚清晰，肝細胞排列比較整齊，未見明顯的中性粒細胞浸潤和肝細胞壞死；IR-2 h 組小鼠的肝小葉組織結構欠清晰，肝細胞排列較整齊，在匯管區內可見膽管增生，僅見少量中性粒細胞浸潤；IR-6 h 組小鼠則出現部分肝小葉結構紊亂，部分肝細胞壞死，可見中性粒細胞浸潤、膽小管及上皮增生，中央靜脈周圍可見片狀的肝細胞壞死，肝竇內可見大量的中性粒細胞浸潤；IR-12 h 組小鼠的肝小葉結構明顯紊亂，出現大片肝細胞壞死，肝竇內可見大量的中性粒細胞浸潤；IR-24 h 組小鼠的肝小葉結構不清，肝細胞排列欠整齊，可見少量的中性粒細胞浸潤。各時點 IR 組中，IR-12 h 組小鼠的肝組織結構破壞最為嚴重（圖 2）。
圖2
示 Sham 組和各時點 IR 組小鼠肝臟組織的病理學改變（HE ×200） a：Sham 組；b：IR-2 h 組；c：IR-6 h 組；d：IR-12 h 組；e：IR-24 h 組
2.3 Sham 組和各時點 IR 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白的表達
電泳結果顯示，總體上看，各時點 IR 組小鼠肝組織中 AMPKα、p-AMPKα、Nix 和 Bax 表達均較 Sham 組上調，且 IR-12 h 組的表達最強；各時點 IR 組小鼠肝組織中 p-mTOR 的表達均弱于 Sham 組（主要觀察 p-mTOR），且 IR-12 h 組的表達最弱（圖 3）。半定量結果顯示：與 IR-12 h 組比較，Sham 組，IR-2 h 組、IR-6 h 組及 IR-24 h 組的 AMPKα、p-AMPKα、Nix 及 Bax 的表達水平，以及 LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ 比值均較低（P<0.05），而 p-mTOR 的表達水平均較高（P<0.05），見圖 4。綜合蛋白印跡結果、血生化檢測結果和 HE 染色結果，確定 IR-12 h 為最典型的時點。
圖3
示 Sham 組和各時點IR 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白的電泳結果 ①：Sham 組；② IR-2 h 組；③ IR-6 h 組；④ IR-12 h 組；⑤ IR-24 h 組
圖4
示 Sham 組、IR-2 h 組、IR-6 h 組、IR-12 h 組和 IR-24 h 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白表達的半定量結果 a：AMPKα；b：p-AMPKα；c：p-mTOR；d：Nix；e：LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ 比值；f：Bax；與 IR-12 h 組比較，*P<0.05
2.4 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織的免疫組化染色結果
光鏡下所見，PCNA 染色主要出現在細胞核中，細胞核中見大量棕褐色顆粒，細胞質和細胞膜呈弱表達或無表達。IR-12 h 組小鼠的肝細胞核中可見大量的棕褐色顆粒；相較于 IR-12 h 組，Compound C 組小鼠肝細胞的細胞核中棕褐色顆粒明顯減少，且染色也變淺；Compound C+Rapa 組小鼠肝細胞的細胞核中棕褐色顆粒明顯較 Compound C 組增多，且染色較深，與 IR-12 h 組相比較細胞核內棕褐色顆粒也增多（圖 5a–5c）。半定量結果表明：與 IR-12 h 組比較，Compound C 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達水平較低（P<0.05），而 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達水平較高（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達水平較高（P<0.05），見圖 5d。
圖5
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達結果 a、b 及 c：IR-12 h 組（a）、Compound C 組（b）及 Compound C+Rapa 組（c）小鼠肝組織的免疫組化染色結果（SABC ×200）；d：半定量結果
2.5 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織的羅丹明 123 染色結果
正常情況下由于線粒體膜電位的存在，帶陽離子的羅丹明 123 會聚集到線粒體上，當線粒體損傷、膜電位下降時，羅丹明 123 聚集減少，使發光強度減弱。熒光顯微鏡下見，IR-12 h 組小鼠肝組織的發光強度較強。Compound C 組小鼠肝組織的發光強度較 IR-12 h 組明顯降低，說明線粒體膜電位較 IR-12 h 組明顯下降，線粒體損傷嚴重。Compound C+Rapa 組小鼠肝組織的發光強度較 Compound C 組增強，提示線粒體膜電位較 Com-pound C 組提高，線粒體損傷減輕；但與 IR-12 h 組比較相差不大（圖 6）。
圖6
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中的線粒體改變（羅丹明染色 ×200） a：IR-12 h 組；b：Compound C 組；c：Compound C+Rapa 組
2.6 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織的細胞凋亡情況
熒光顯微鏡下可見，紅色為 TUNEL 標記的凋亡細胞，藍色為 DAPI 標記的細胞核。IR-12 h 組小鼠的肝組織中可見紅色凋亡細胞較少；Compound C 組小鼠的肝細胞凋亡數量較 IR-12 h 組小鼠明顯增高；Compound C+Rapa 組小鼠的肝細胞凋亡數量較 Compound C 組小鼠明顯下降，與 IR-12 h 組比較稍下降（圖 7）。
圖7
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝細胞的凋亡情況（TUNNEL 染色 ×100） a：IR-12 h 組；b：Compound C 組；c：Compound C+Rapa 組
2.7 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白的表達
2.7.1 電泳結果 電泳結果顯示，與 IR-12 h 組比較，Compound C 組的 p-AMPKα 和 Nix 的表達下調，p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達上調，AMPKα 的表達差異不大；Compound C+Rapa 組的 AMPKα、p-AMPKα、p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達下調，Nix 的表達上調。與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組的 AMPKα 和 p-AMPKα 的表達差距不大，p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達下調，Nix 的表達上調。具體見圖 8。
圖8
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中自噬及凋亡相關蛋白的電泳結果 ①：IR-12 h 組；②：Compound C 組；③：Compound C+Rapa 組
2.7.2 半定量結果 ① AMPKα。與 IR-12 h 組比較，Compound C 組肝組織中 AMPKα 的表達水平的差異無統計學意義（P>0.05），而 Compound C+Rapa 組的 AMPKα 的表達水平較高（P<0.05）；與Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 AMPKα 的表達水平較高（P<0.05）。② p-AMPKα。與 IR-12 h 組比較，Compound C 和 Compound C+Rapa 組肝組織中 p-AMPKα 的表達水平均較低（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 p-AMPKα 的表達水平略升高（P<0.05）。③ p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3。與 IR-12 h 組比較，Compound C 組肝組織中 p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達水平均較高（P<0.05），Compound C+Rapa 組肝組織中 p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達水平均較低（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達水平均較低（P<0.05）。④ Nix。與 IR-12 h 組比較，Compound C 組肝組織中 Nix 的表達水平降低（P<0.05），Compound C+Rapa 組肝組織中 Nix 的表達水平較高（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 Nix 的表達水平較高（P<0.05）。⑤ LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 比值。與 IR-12 h 組比較，Compound C 組和 Compound C+Rapa 組肝組織中 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 比值均較低（P<0.05）；與 Compound C 組比較，Compound C+Rapa 組肝組織中 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值較高（P<0.05）。具體見圖 9。
圖9
示 IR-12 h 組、Compound C 組和 Compound C+Rapa 組小鼠肝組織中各蛋白的半定量結果 a：AMPKα；b：p-AMPKα；c：p-mTOR；d：Nix；e：LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ 比值；f：Caspase-3；g：Cleaved Caspase-3；與 IR-12 h 組比較，*P<0.05；與 Compound C 組比較，#P<0.05
3 討論
肝移植是終末期肝臟疾病的有效治療方式。HIRI 是肝臟手術過程中的嚴重并發癥。由于供體短缺和邊緣性供體的使用，更加重了供肝的 HIRI 程度，嚴重影響手術效果及患者預后。HIRI 的機制復雜，與炎癥反應、代謝障礙、細胞活化、氧化應激等密切相關，上述各因素之間相互制約、相互促進[16-17]。最大限度減輕 IR 損傷是肝臟外科臨床實踐和實驗研究中亟待解決的問題[18]。
3.1 自噬及自噬相關蛋白
自噬在許多生理過程（如發育、先天免疫防御、蛋白質質量控制、細胞存活、細胞死亡等）中，以及在包括癌癥、神經變性疾病、代謝紊亂等疾病的發病中起重要作用[19]。發生 IR 損傷的器官其自噬水平會有不同程度的上調。研究[20-22]表明，在 HIRI 過程中，自噬起重要的保護作用。線粒體自噬是一種特殊的選擇性自噬，能調節線粒體內環境穩態，及時清除受損傷的線粒體。線粒體自噬被抑制，則會引起受損線粒體聚集、超氧化物歧化酶（ROS）異常增加、線粒體 DNA 突變和能量衰竭，最終導致細胞死亡。在 HIRI 過程中，線粒體自噬能有效保護線粒體功能，對減輕肝細胞的損傷發揮重要作用[23]。
3.1.1 AMPK 和 mTOR AMPK 可以通過增高的 AMP/ATP 比值激活，是能量平衡的主要調節器[24]。研究[25]證明能量感受器 AMPK 能夠通過多種下游信號通路，如 mTOR、真核延伸因子 2（eEF2）及 p27 來調節自噬活性；mTOR 負性調節自噬，而 AMPK 對 mTOR 的下調作用已被認為是影響自噬的重要調節通路。Compound C 是廣泛使用的 AMPK 抑制劑[26]。Compound C 通過抑制 AMPK 活化，解除其對 mTOR 的抑制作用[12]，而抑制 mTOR 可以激活線粒體自噬[27]。亦有文獻[28]報道，pp242 能抑制 mTOR，激活線粒體自噬，發揮抗凋亡作用。此外，Park 等[29]通過研究證明了 mTOR 和 AMPK 可以通過調控哺乳動物自噬啟動 ATG1 激酶 1（ULK1）來調節饑餓誘導的自噬，減少細胞凋亡。
3.1.2 Nix 線粒體外膜蛋白 Nix 和 Bcl-2 家族的 BH3-only 成員均是特定的選擇性自噬受體，能直接結合 LC3，激活線粒體自噬[30-31]。據報道[32]，在 IR 狀況下，Nix 能激活線粒體自噬，清除受損的線粒體，減輕細胞損傷，發揮保護作用。 有研究者[33]通過建立小鼠的 HIRI 模型，發現在 IR 組中干擾素調節因子 1（IRF-1）的表達水平增高，線粒體自噬相關蛋白 Nix 的表達水平下降，線粒體損傷加重，凋亡增加；進一步建立體外 HIRI 模型并沉默 IRF-1 基因的表達后，發現肝細胞內自噬體增加、線粒體自噬相關蛋白表達上調，細胞凋亡減少。Mazure 等[34]通過研究發現，Nix 在缺氧狀態下能激活線粒體自噬，敲除 Nix 基因可以促進缺氧狀態下細胞的死亡。李麗君等[35]報道，在癌細胞受到的刺激較輕微時，Nix 誘導的普通線粒體自噬促進了細胞的生存；當環境進一步惡化時，Nix 誘導的過度線粒體自噬反而可以促進細胞凋亡。
3.1.3 PCDA 有文獻[36]通過建立小鼠 HIRI 模型，發現 miR-30b 能通過降低 Atg12-Atg5 復合體形成，進而下調 PCNA 的表達，最終肝細胞凋亡減少，HIRI 減輕。
3.2 AMPK 通過調控 mTOR/Nix 信號通路參與 HIRI 過程
基于以上研究背景，本實驗就 AMPK 通過調控 mTOR/Nix 信號通路參與小鼠 HIRI 的作用機制進行了研究。實驗結果表明，IR-12 h 組的 AST 和 ALT 濃度最高，AMPKα、p-AMPKα、Nix、 Bax 的表達水平，以及 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 比值均最高，而 p-mTOR的表達水平最低。該實驗研究提示，再灌注 12 h 時肝臟損傷最嚴重。為進一步研究其作用機制，本實驗分別對小鼠給予腹腔注射 Compound C 及 Compound C+Rapa 預處理，1 h 后建立小鼠 HIRI 模型，于建模 12 h 時檢測自噬、凋亡相關蛋白的表達，以及肝細胞凋亡和線粒體損傷情況。結果發現：Compound C 組小鼠肝組織中 PCNA的表達 水平較 IR-12 h 組低，線粒體損傷嚴重，凋亡增加，Nix 的表達下調，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 比值下降，Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達上調；Compound C+ Rapa 組小鼠肝組織中 PCNA 的表達水平較 Compound C組高，線粒體損傷較輕，凋亡減少，p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表達下調，Nix 的表達上調。該結果提示，抑制 AMPK 可以上調 p-mTOR 的表達、下調 Nix 的表達，進而降低線粒體自噬，增加肝細胞凋亡，加重肝細胞損傷；通過加入Rapa 抑制 mTOR 后，p-mTOR 的表達下調，Nix 的表達上調，從而增強線粒體自噬，減輕了肝細胞凋亡，一定程度上減輕了肝細胞損傷。
綜上所述，筆者認為，IR 可促進 AMPK 的磷酸化，并通過抑制 mTOR 的活化，激活線粒體自噬，進而減輕肝細胞損傷。HIRI 過程中，AMPK 通過調控 mTOR/Nix 信號通路激活線粒體自噬，保護肝細胞損傷。 此研究為預防及治療肝臟外科中的 HIRI 提供了新方向。
