引用本文： 柯能文, 劉續寶. Beclin-1 分子在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(6): 671-679. doi: 10.7507/1007-9424.201704018 復制
胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocar cinoma，PDAC）是一種常見的消化系統惡性腫瘤。在所有腫瘤中，其發病率位居第 12 位，但死亡率卻位居第 4 位[1-3]。目前胰腺癌的治療方法以手術切除為主，輔助以化學治療、放射治療等。但經上述方法治療后，患者的 1 年生存率仍低于 25%[4-5]，可手術切除者的 5 年生存率也不超過 5%[4-5]。自噬作為Ⅱ型程序性細胞死亡方式，是維持細胞自我平衡的重要機制，在腫瘤形成過程中發揮重要作用[6-9]。目前研究者對自噬與腫瘤的關系持兩種截然相反的觀點：一種認為自噬對腫瘤起保護作用，促進腫瘤的生長[10]；另外一種認為自噬是抑制腫瘤生長的重要因素[11-12]。在眾多的自噬基因中，Beclin-1 基因是第一個被發現的哺乳動物“自噬基因”[13]。同時 Beclin-1 分子也是連接自噬與凋亡通道的關鍵分子之一[14]。胰腺癌相關研究中涉及自噬和 Beclin-1 基因的研究較少。有研究[15-16]表明，抑制胰腺癌細胞中的自噬過程，可促進胰腺癌的形成，提示自噬的存在對胰腺癌發揮抑制效應。僅有的數個關于 Beclin-1 基因的研究[17-18]得出的結論又相互矛盾。Akar 等[19]研究發現，抑制蛋白激酶 C-β/谷氨酰胺轉胺酶 2（PKC-β/TG2）信號通路后，Beclin-1 蛋白的表達上調，促進胰腺癌細胞的自噬，從而抑制胰腺癌細胞的生長。另有研究[20]卻表明，抑制 Beclin-1 蛋白的表達可促進胰腺癌細胞的自噬發生。為進一步探討自噬基因 Beclin-1 基因在胰腺癌中的確切作用，筆者進行了本研究。
1 資料與方法
1.1 標本來源
本組 45 例組織石蠟標本來源于 2009 年 4 月至 2009 年 11 月期間在四川大學華西醫院住院的手術患者，包括 25 例胰腺癌標本和 20 例正常胰腺組織標本。25 例胰腺癌患者的年齡為 16～80 歲，中位年齡為 52.2 歲，其中≤52 歲者 9 例，>52 歲者 16 例；男 12 例，女 13 例；臨床分期：ⅠA 期 0 例，ⅠB 期 3 例，ⅡA 期 3 例，ⅡB 期 4 例，Ⅲ期 9 例，Ⅳ期 6 例；局部腫瘤直徑（可估計的病灶最大直徑）：≤3 cm 者 5 例，>3 cm 者 20 例；淋巴結轉移：陽性 17 例，陰性 8 例；腫瘤分化程度：高分化 11 例，中低分化 14 例。所有標本的診斷均經術后病理學檢查證實。20 例正常胰腺組織標本的來源：同期因胰腺體尾部 β 細胞瘤、脾切除時胰腺尾部無法與脾臟完全分離而予以切除的正常胰腺組織（14 例，距腫瘤邊緣 2 cm 以上取組織），部分正常胰腺組織標本（6 例）來源于胰腺外傷患者，所有正常胰腺組織標本均經術后病理學檢查證實為正常胰腺組織。20 例患者中，男 11 例，女 9 例；年齡 19～64 歲，中位年齡為 47 歲。為了排除腫瘤和慢性炎癥對周圍組織的影響，筆者并未采取同一胰腺癌患者的癌旁組織作為正常組織的對照。45 例患者術前均未接受任何放療和化療。45 例患者的臨床病理資料均完整，病理診斷均由筆者所在醫院病理科復核。該研究通過四川大學華西醫院倫理委員會批準，所有受試對象均簽署了知情同意書。
1.2 主要試劑和設備
主要試劑和材料包括：免疫組化 SP 試劑盒（美國 Sigma 公司），Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗體（B6061）及 MTT 試劑盒（美國 Sigma 公司），PrimeScript? RT reagent Kit、BamHⅠ、MluⅠ及 Taq polymerase（日本 TaKara 公司），PLenO-WPI 載體（美國 Invabio 公司），用于酶切的工作酶 PmeⅠ（美國 NEB 公司），AxyPrep 質粒小量制備試劑盒和 AxyPrep 質粒大量制備試劑盒（美國 Axygen 公司），制備感受態試劑盒（美國 BIOSCIENCES 公司），SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒〔DRR081S，寶生物工程（大連）有限公司〕，superfect 轉染試劑盒（德國 qiagen 公司）。239T 細胞和 PANC-1 細胞株均來源于中國科學院細胞庫。
主要軟件及設備包括：PowerPac 穩壓 DNA 電泳儀、iCycler iQTM 熒光實時多波長 PCR 儀、BIO-RAD680 酶標儀、Mini-PROTEAN Tetra 蛋白電泳儀及 Gel Doc 1000 凝膠成像系統均來源于美國 BIO-RAD 公司，Image-Pro Plus Version 6.0 分析軟件來源于美國 Media Cybernetics 公司。
1.3 PCR 法檢測人胰腺癌及正常胰腺組織中 Beclin-1 mRNA 的表達
取 30～50 mg 胰腺癌或正常胰腺組織塊，剪碎后置入裝有 0.5 mL RNAisoTM Plus 液的 1.5 mL EP 管中，立刻采用勻漿法破碎細胞，再加入 0.5 mL RNAisoTM Plus 液，移液器吹打（>50 次）。將 EP 管置于冰上片刻后，于 4 ℃ 條件下離心 10 min（12 000 r/min，r=8 cm）。取上清轉移至經焦碳酸二乙酯（DEPC）預處理的 EP 管中。室溫放置 5 min 使樣品充分裂解。在上述液體中加入 0.2 mL 氯仿，晃動 15 s，室溫放置 10 min。于 4 ℃ 下離心 10 min（12 000 r/min，r=8 cm），提取 RNA。提取的總 RNA 行 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗。檢驗合格后，以提取的總 RNA 作為模板，采用 PrimeScript? RT reagent Kit 試劑盒提供的 Random 6 mers 及 Oligo（dT）引物，利用逆轉錄酶將 RNA 逆轉錄成 cDNA。再行實時熒光定量 PCR。Beclin-1 基因引物：正義鏈 5′-GATTGAA-GACACAGGAGGCAGT-3′，反義鏈 5′-GTGAGG-ACACCCAAGCAAGAC-3′（擴增長度為 97 bp）。β-actin 為內參基因：正義鏈 5′-GTGGACATCCG-CAAAGAC-3′，反義鏈 5′-AAAGGGTGTAACG-CAACTA-3′（擴增長度為 302 bp），上述引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR 反應體系及反應條件按試劑盒說明書操作。PCR 擴增在 iCycler iQTM 熒光實時多波長 PCR 儀上進行，擴增采用兩步法 PCR 擴增標準程序。第一步：95 ℃ 30 s，40 個循環；第二步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。所有標本的 Beclin-1 mRNA 的相對表達量均經看家基因 β-actin 的校正，以減少實驗誤差。
1.4 免疫組化染色檢測胰腺癌及正常胰腺組織中 Beclin-1 蛋白的表達
免疫組化染色步驟是：首先對組織進行固定、切片脫蠟至水后，置于 3% H2O2 溶液中，37 ℃ 孵育 10 min，以 PBS 緩沖液沖洗 3 次，每次 5 min。置于枸櫞酸緩沖液中（95 ℃）15～20 min，自然冷卻 20 min 以上，冷水沖洗以加快冷卻至室溫，再以 PBS 緩沖液沖洗 3～5 min。加入正常羊血清工作液 10 mL 封閉，37 ℃ 孵育 10 min。滴加 Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗體，比例為 1∶60，4 ℃ 冰箱孵育過夜，再以 PBS 緩沖液沖洗 3～5 min。用 PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照，以乳腺癌標本作為陽性對照。滴加生物素標記的二抗（1∶100），37 ℃ 孵育 30 min。滴加鏈親和素——生物素過氧化物酶復合物，工作濃度為 1∶100，37 ℃ 恒溫孵育 30 min。以 DAB/H2O2 顯色，自來水充分沖洗后，以蘇木精復染，75%、80%、85%、95% 及 100% 乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察結果。首先在 100 倍光鏡下觀察全片，選擇 5 個陽性物質豐富的視野，然后采用 Image-Pro Plus Version 6.0 分析軟件在 400 倍光鏡下測定陽性物質的積分光密度（integated optical density，IOD）值，取 5 個視野的均值，分析 Beclin-1 蛋白的表達情況。IOD 值越高表明 Beclin-1 蛋白表達水平越高。
1.5 HE 染色
本實驗的 HE 染色按常規操作進行。
1.6 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體的構建
提取人正常胰腺組織中（20 例中的任一例）的總 RNA（操作按試劑盒說明書進行）。于美國國立生物技術信息中心（NCBI）基因文庫中獲得人 Beclin-1 cDNA 序列（NM_003766），再根據 PLenO-WPI 載體的插入位點，設計擴增 Beclin-l 基因的一對引物。為了方便檢測，在引物兩端分別加入 BamHⅠ和 MluⅠ酶切位點，同時設計保護性堿基。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列：正義鏈 5′-C GGATCCATGGAA-GGGTCTAAGACGTCCAACA-3′（5′端下劃線部分為 BamHⅠ酶切位點，斜體部分為保護性堿基）；反義鏈 5′-C ACGCGTTCATTTGTTATAAAATTGTG-AGG-3′（5′端下劃線部分為 MluⅠ酶切位點，斜體部分為保護性堿基）。以提取的總 RNA 為模版，通過上述引物和逆轉錄，擴增出 Beclin-1 cDNA（PCR 法，按 PrimeScript? RT reagent Kit 試劑盒說明書進行）。Beclin-1 cDNA 通過 BamHⅠ、MluⅠ雙酶切后，與 PLenO-WPI 載體連接，反應在 T4DNA 連接酶作用下進行。PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體完成后，行限制性內切酶 MluⅠ、BamHⅠ雙酶切來鑒定是否有目的片段插入。酶切產物行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統中觀察結果。同時通過 PCR 方法（PCR 操作按試劑盒說明書進行），擴增重組載體以再次確定是否有正確的 Beclin-1 基因插入 PLenO-WPI 載體。取經酶切反應及 PCR 反應均鑒定正確的克隆，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，將序列測定結果與 NCBI 數據庫公布的人 Beclin-l 基因序列進行比對和分析。最后將 PLenO-WPI-Beclin-1 重組載體轉染至 239T 細胞包裝（轉染按轉染試劑盒說明書進行）。
1.7 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體轉染 PANC-1 胰腺癌細胞
取凍存的 PANC-1 細胞株進行復蘇，調整細胞濃度后接種于 96 孔板中（1×104 個/孔），每孔加入不含抗生素的 DMEM 培養基 100 μL，于 37 ℃、5% CO2 培養箱內培養；取在 1.6 實驗中已包裝好、儲存于 –70 ℃ 保存的重組慢病毒，冰上融化（無菌操作），用漢克斯平衡液（HBSS）稀釋，調整終濃度為 1×104/μL；按病毒與細胞比率（MOI）將 PANC-1 細胞分組，MOI 分別為 1、10 及 100，分別加入相應量 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體，37 ℃、5% CO2 培養箱內培養，每 12 小時更換 1 次培養基；加入重組慢病毒 3 d 后，用熒光顯微鏡觀察陽性細胞比例，感染效率在 80% 以上者為最適轉染 MOI 值。實驗證實 MOI=10 時，感染效率最佳。將 PANC-1 細胞以 1×105 個/孔接種于 24 孔板中，同時每孔以最適 MOI 值加入PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體（同時設未轉染組，未進行重組慢病毒轉染），37 ℃、5% CO2 培養箱內混合培養，8 h 后更換為含 10% 小牛血清的 DMEM 培養基。分別于共培養 24 及 48 h 用熒光顯微鏡觀察病毒感染情況；同時通過熒光定量 PCR 檢測 Beclin-1 mRNA 的表達情況（操作按試劑盒說明書進行）。2 組不同時點均設 4 個復孔，不同時點提取不同培養孔中的細胞進行 PCR 實驗（操作同上）和 Western blot 檢測。
1.8 Western blot 法檢測 Beclin-1 蛋白的表達
通過 Western blot 法檢測 Beclin-1 蛋白的表達，具體步驟如下：在制備好的不連續變性聚丙稀酰胺膠上每孔上 20～100 μg 蛋白，置于電泳儀內電泳，電壓 100 V。之后將聚偏二氟乙烯膜于甲醇中泡 15 s，和膠一起放在轉膜液中平衡 15 min，然后按照陽極-海綿-濾紙-聚偏二氟乙烯膜-膠-濾紙-海綿-陰極的順序安置好，放到濕轉膜儀中，用冰覆蓋，300 mA 轉移 45 min。轉膜結束后取出聚偏二氟乙烯膜，放入麗春紅 S 中染色。再以 5% 牛奶封閉 1 h，TBST 緩沖液洗 3 次，每次 5 min。滴加一抗（Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗體，1∶100）4 ℃ 過夜，第二天以 TBST 緩沖液洗 4 次，每次 5 min。上二抗室溫放置 1 h 后，以 TBST 緩沖液洗 4 次，每次 5 min。最后以增強化學發光法（ ECL）顯色，暗房壓片。
1.9 MTT 法檢測細胞增殖情況
將 PANC-1 細胞接種于 96 孔板中（1×104 個/孔）后，分為 3 組：轉染組、空載體組和空白對照組。轉染組加入 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體；空載體組加入 PLenO-WPI 慢病毒載體；空白對照組只加入培養基。將細胞于 37 ℃、5% CO2 培養箱內培養，每 12 小時更換 1 次培養基。于轉染 1～7 d 期間每天檢測細胞增殖情況（每個時點 3 組均設 3 個復孔）。MTT 檢測步驟：每孔加入 MTT 20 μL，孵育 4 h 后離心（1 200 r/min，r=11 cm，5 min），去上清，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩 10 min，用酶標儀于 570 nm 處測定 OD 值。OD 值隨細胞增殖而增加。
1.10 統計學方法
所有數據資料采用 SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（ ±s）表示，統計分析方法采用成組 t 檢驗或方差分析（兩兩比較采用 LSD 法）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 胰腺癌及正常胰腺組織中 Beclin-1 mRNA 及其蛋白的表達結果
實時熒光定量 PCR 結果顯示：胰腺癌組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平低于正常胰腺組織（P=0.003 9），見圖 1a，提示胰腺癌組織中 Beclin-1 mRNA 的表達下調。免疫組化染色結果顯示：Beclin-1 蛋白主要于細胞漿內表達，呈棕黃色物質沉積；胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白的 IOD 值低于正常胰腺組織（P=0.000 2），見圖 1b 和圖 2，提示胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白的表達也下調。
圖1
示胰腺癌組織和正常胰腺組織中 Beclin-1 mRNA 及其蛋白的表達結果 a：Beclin-1 mRNA；b：Beclin-1 蛋白；與正常胰腺組織比較，*P<0.05
圖2
示免疫組化染色結果（SP ×200） a：正常胰腺組織；b：胰腺癌組織
2.2 HE 染色結果
HE 染色顯示，胰腺癌組織中無典型的腺泡樣結構，細胞排列不規則，細胞大小不一，邊界不清，核大深染，無核仁，腺管呈條索狀；正常胰腺組織中可見典型的外分泌腺腺泡結構，細胞排列規則，極性分明（圖 3）。
圖3
示病理學檢查結果（HE ×200） a：正常胰腺組織；b：胰腺癌組織
2.3 人胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系
在胰腺癌患者中，Beclin-1 蛋白的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑及分化程度均無關（P>0.05），與 TNM 分期及淋巴結轉移有關，TNM Ⅲ期和Ⅳ期患者的 Beclin-1 蛋白的表達水平均低于Ⅰ期或Ⅱ期患者（P<0.05），但Ⅲ期和Ⅳ期比較、Ⅰ期和Ⅱ期比較差異均無統計學意義（P>0.05）；淋巴結轉移陽性患者 Beclin-1 蛋白的表達水平低于陰性患者（P=0.011）。見表 1。
表1
胰腺癌組織中 Beclin-l 蛋白的表達與患者臨床病理學特征的關系
2.4 PLenO-WPI-Beclin-1 重組載體的鑒定結果
用限制性內切酶 MluⅠ、BamHⅠ雙酶切PLenO-WPI-Beclin-1重組慢病毒載體，通過電泳分離酶切片段，得到 1 條長約 1 233 bp 的片段和 1 條長約 11 kp 的片段，片段長度符合 Beclin-1 基因及 PLenO-WPI 載體大小；而用 MluⅠ、BamHⅠ雙酶切的空質粒，電泳結果顯示為 1 條片段，長約 11 kp（圖 4a）。該結果顯示，目的基因片段已正確地插入到真核表達載體 PLenO-WPI 中。將獲得的 PLenO-WPI-Beclin-1 重組載體與 Beclin-1 特異引物混合，通過 PCR 擴增，電泳后得到 1 條長為 1 233 bp的片段（圖 4b），證明 Beclin-1 基因在重組載體中。將酶切鑒定及 PCR 鑒定均為陽性的克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司進行插入片段的序列測定。測序結果顯示，插入片段序列長度為 1 233 bp，測序圖譜如圖 4c 所示。將測序結果與 NCBI 數據庫公布的人 Beclin-l 基因序列進行 BLAST 比對，結果顯示插入片段與人 Beclin-1 基因序列相同。目的片段插入方向正確，閱讀框架不變。
圖4
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體鑒定 a： PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體酶切后的電泳圖，M 為 DNA maker，1、2 及 4 條帶為 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體，3 條帶為 PLenO-WPI 空載體；b：實時熒光 PCR 產物電泳圖，M 為 DNA marker，1 條帶為 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體；c：插入片段的測序結果
2.5 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體轉染 PANC-1 胰腺癌細胞后 Beclin-1 mRNA 的表達
PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體與 PANC-1 細胞共培養 24 h 后，可在熒光顯微鏡下觀察到 PANC-1 細胞熒光表達明顯（圖 5）；共培養 48 h 后，有 80% 細胞的胞漿內能觀察到綠色熒光顯示，提示 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體成功轉染 PANC-1 細胞并表達。為進一步明確是否有 Beclin-1 mRNA 的表達，筆者進行了 PCR 實驗。結果如圖 6 所示，和未轉染組對比，轉染后 24 h 和 48 h，同時點轉染組細胞的 Beclin-1 mRNA 的表達水平均高于未轉染組（P<0.05）。通過 Western blot 檢測轉染后 PANC-1 細胞中 Beclin-1 蛋白的表達，同樣發現，轉染后蛋白表達明顯上調（圖 7）。上述結果表明，PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體能在 PANC-1 細胞內正確表達 Beclin-1 基因。
圖5
示轉染組和未轉染組 PANC-1 細胞的熒光顯微鏡觀察結果（ ×400） a：未轉染組 24 h；b：未轉染組 48 h；c：轉染組 24 h；d：轉染組 48 h
圖6
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體轉染 PANC-1 細胞后細胞中 Beclin-1 mRNA 的表達情況 同時點與未轉染組比較，*P<0.05
圖7
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體轉染 PANC-1 細胞后細胞中 Beclin-1 蛋白表達的電泳圖
2.6 MTT 檢測結果
總體來說，轉染 1～7 d 期間，轉染組、空白對照組和空載體組細胞的增殖能力在轉染第 2 天時開始均有所升高，但轉染組相較于空白對照組和空載體組升高幅度較低，而空載體組和空白對照組間區分度不大（圖 8）。轉染 1、2 及 3 d 時，3 組細胞的 OD 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；從轉染 4 d 開始，至轉染 7 d 期間，同時點轉染組細胞的 OD 值較空白對照組和空載體組均較低（P<0.05），但同時點空載體組和空白對照組細胞的 OD 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。提示隨著 Beclin-1 基因的增強表達，PANC-1 細胞的增殖能力受到明顯抑制。
圖8
示 MTT 法檢測結果 同時點與空載體組和空白對照組比較，*P<0.05
3 討論
Beclin-1 基因是調控自噬的重要基因，自從認識到自噬與腫瘤的發生發展相關后，Beclin-1 表達對腫瘤的影響就成為研究的熱點。
3.1 Beclin-1 與腫瘤的關系
Beclin-1 基因與腫瘤的關系首先在乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌中得到驗證。研究[17]表明，有 75% 的卵巢癌、50% 的乳腺癌以及 40% 的前列腺癌組織中存在染色體 17q21 位點等位基因的缺失。通過對卵巢癌染色體 17q21 位點缺失的精確序列分析找到了目前唯一已知與自噬相關的基因就是 Beclin-l 基因[19]。Liang 等[18]將 Beclin-1 基因轉染人乳腺癌細胞后，發現細胞的增殖能力降低，在裸鼠上的成瘤能力減弱。2003 年，Qu 等[21]通過建立攜帶 Beclin-1+/– 雜合缺失的鼠模型，結果發現，Beclin-1+/– 雜合缺失鼠的自發性腫瘤的發生率很高，這些自發腫瘤包括肺腺癌、肝細胞癌、淋巴瘤等，在這些 Beclin-1+/– 雜合缺失的鼠細胞中自噬活性明顯下降，但沒有證據證明凋亡發生改變；此外還發現，Beclin-1+/– 雜合缺失可導致自噬空泡形成減少。據此，多數研究者[22-23]認為，Beclin-1 等位基因的缺失或表達降低促進了細胞增殖，削弱了自噬，導致腫瘤的形成。但并非所有腫瘤組織中 Beclin-1 基因的表達都是降低的。康凱夫等[24]在肝癌的研究中發現，肝癌組織中 Beclin-1 蛋白的表達水平明顯高于正常組織。對結腸癌的研究[25]也表明，Beclin-1 蛋白在腫瘤組織中的表達陽性率高達 85.2%（98/115），而癌旁組織中無或只有中等程度的 Beclin-1 蛋白表達。在其他腫瘤中也有類似發現[26-27]。
3.2 自噬在腫瘤中的作用
Beclin-1 分子對腫瘤的影響，最終要通過自噬來實現。如同 Beclin-1 分子在腫瘤組織中的表達不全是降低一樣，目前自噬與腫瘤的關系同樣存在較大爭論。研究[28]表明，自噬水平在細胞的“危機”狀況下可快速上調，如營養缺乏、細胞密度負荷、低氧等。此時自噬的降解產物如氨基酸、核苷酸、游離脂肪酸等可供能量并再循環；此外自噬還可以作為一種防御機制清除胞質內受損的細胞器和代謝產物，進行亞細胞水平上的重構，保護受損的細胞[28]。另有研究者[29-30]發現，在營養缺乏的環境下，自噬可保護腫瘤細胞，維持腫瘤的生存。如果此時阻斷自噬效應，腫瘤細胞則會發生凋亡[29-30]。然而其他研究者[31-33]對比腫瘤與正常細胞的自噬水平后卻發現，腫瘤細胞的自噬水平均明顯低于正常細胞。使用致癌物質作用于正常細胞，也發現這些細胞的自噬水平與未處理組對比明顯降低[11, 34]。在對大鼠胰腺癌的研究中發現，在癌前病變或良性腫瘤期，自噬活性增強，而腺瘤向腺癌轉化的過程中，自噬活性明顯降低，提示在胰腺癌的發生過程中自噬活性降低可能是必須的[35]。這些相互矛盾的研究結果表明，自噬對于腫瘤細胞可能是把“雙刃劍”。自噬時因大分子物質循環和有害物質得到隔離使腫瘤細胞生存，但當自噬超過某一閾值、大量降解蛋白質與細胞器時則會導致自噬性死亡。
3.3 Beclin-1 分子的表達下調可能是胰腺癌發展的機制之一
本研究通過實時熒光定量 PCR 及免疫組化染色技術檢測了人胰腺癌及正常胰腺組織中 Beclin-1 分子的表達情況，結果發現，人胰腺癌組織中 Beclin-1 基因及蛋白的表達水平均低于正常胰腺組織。胰腺癌組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平僅為正常胰腺組織的 5.47%（0.148 5/2.713 9），且其 Beclin-1 蛋白的表達水平僅為正常胰腺組織的 10.20%（22 990.304 3/225 432.089 3）。該結果表明，Beclin-1 分子在人胰腺癌組織中的表達下調，Beclin-1 分子的表達下調可能是導致胰腺癌發生發展的機制之一。本研究結論支持自噬及 Beclin-1 分子為腫瘤抑制機制之一的觀點。
本研究組進一步分析了胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白的表達水平與患者臨床病理學特征的關系。結果顯示，Beclin-1 蛋白的表達水平在不同年齡和不同性別組之間并無差別，且其表達和腫瘤直徑及分化程度間的關系也無統計學意義。但在不同臨床分期患者之間，Beclin-1 蛋白的表達水平存在差別，分期較早（Ⅰ期和Ⅱ期）的胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白的表達水平高于分期較晚（Ⅲ期和Ⅳ期）者。這一結果提示，Beclin-1 蛋白的表達下調，可能增強了胰腺癌細胞的侵襲力。因為分期較早的胰腺癌（Ⅰ期和Ⅱ期）并無血管侵襲及遠處轉移，而Ⅲ期和Ⅳ期患者均有遠隔器官轉移及血管侵襲現象。此外，本組資料結果還表明，淋巴結轉移陽性組患者的 Beclin-1 蛋白的表達水平低于轉移陰性組，提示 Beclin-1 蛋白可能對腫瘤淋巴轉移也有影響。
為進一步驗證 Beclin-1 基因對胰腺癌的影響，筆者通過體外實驗將 Beclin-1 基因表達載體轉染進入 PANC-1 細胞。結果提示，轉染了 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體的 PANC-1 細胞的體外增殖能力明顯下降。MTT 法檢測結果表明，自培養第 4 天開始，轉染組與空載體組和空白對照組之間的 OD 值出現差別，轉染組的 OD 值較低；轉染第 7 天時，轉染組的 OD 值僅為空白對照組的 44.38%（0.851 5/1.918 7）。這一結果與 Liang 等[18]在乳腺癌細胞上的研究結果一致，表明自噬基因 Beclin-1 在體外確實對腫瘤細胞有抑制作用。Chau 等[36]的研究表明，自噬可能是抑制腫瘤血管形成和分布的一種方式。當血管形成抑制劑 endostatin 作用于細胞時，可以在血管內皮細胞中觀察到自噬性細胞死亡的特征。在實性腫瘤中，血管形成有助于腫瘤的轉移和增長，通過自噬性細胞死亡抑制血管形成可以阻止腫瘤的進展。而自噬能力的減弱，有助于胰腺癌周圍毛細血管的形成，提高了腫瘤的侵襲力。
胰腺癌預后極差的原因除了胰腺癌癥狀不明顯、患者就診時就屬中晚期之外，其侵襲和轉移能力也是制約和影響胰腺癌治療效果的關鍵所在。本研究結果表明，Beclin-1 基因的表達與胰腺癌侵襲力及淋巴結轉移有關，這可能為胰腺癌的治療提供了新的思路。
胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocar cinoma，PDAC）是一種常見的消化系統惡性腫瘤。在所有腫瘤中，其發病率位居第 12 位，但死亡率卻位居第 4 位[1-3]。目前胰腺癌的治療方法以手術切除為主，輔助以化學治療、放射治療等。但經上述方法治療后，患者的 1 年生存率仍低于 25%[4-5]，可手術切除者的 5 年生存率也不超過 5%[4-5]。自噬作為Ⅱ型程序性細胞死亡方式，是維持細胞自我平衡的重要機制，在腫瘤形成過程中發揮重要作用[6-9]。目前研究者對自噬與腫瘤的關系持兩種截然相反的觀點：一種認為自噬對腫瘤起保護作用，促進腫瘤的生長[10]；另外一種認為自噬是抑制腫瘤生長的重要因素[11-12]。在眾多的自噬基因中，Beclin-1 基因是第一個被發現的哺乳動物“自噬基因”[13]。同時 Beclin-1 分子也是連接自噬與凋亡通道的關鍵分子之一[14]。胰腺癌相關研究中涉及自噬和 Beclin-1 基因的研究較少。有研究[15-16]表明，抑制胰腺癌細胞中的自噬過程，可促進胰腺癌的形成，提示自噬的存在對胰腺癌發揮抑制效應。僅有的數個關于 Beclin-1 基因的研究[17-18]得出的結論又相互矛盾。Akar 等[19]研究發現，抑制蛋白激酶 C-β/谷氨酰胺轉胺酶 2（PKC-β/TG2）信號通路后，Beclin-1 蛋白的表達上調，促進胰腺癌細胞的自噬，從而抑制胰腺癌細胞的生長。另有研究[20]卻表明，抑制 Beclin-1 蛋白的表達可促進胰腺癌細胞的自噬發生。為進一步探討自噬基因 Beclin-1 基因在胰腺癌中的確切作用，筆者進行了本研究。
1 資料與方法
1.1 標本來源
本組 45 例組織石蠟標本來源于 2009 年 4 月至 2009 年 11 月期間在四川大學華西醫院住院的手術患者，包括 25 例胰腺癌標本和 20 例正常胰腺組織標本。25 例胰腺癌患者的年齡為 16～80 歲，中位年齡為 52.2 歲，其中≤52 歲者 9 例，>52 歲者 16 例；男 12 例，女 13 例；臨床分期：ⅠA 期 0 例，ⅠB 期 3 例，ⅡA 期 3 例，ⅡB 期 4 例，Ⅲ期 9 例，Ⅳ期 6 例；局部腫瘤直徑（可估計的病灶最大直徑）：≤3 cm 者 5 例，>3 cm 者 20 例；淋巴結轉移：陽性 17 例，陰性 8 例；腫瘤分化程度：高分化 11 例，中低分化 14 例。所有標本的診斷均經術后病理學檢查證實。20 例正常胰腺組織標本的來源：同期因胰腺體尾部 β 細胞瘤、脾切除時胰腺尾部無法與脾臟完全分離而予以切除的正常胰腺組織（14 例，距腫瘤邊緣 2 cm 以上取組織），部分正常胰腺組織標本（6 例）來源于胰腺外傷患者，所有正常胰腺組織標本均經術后病理學檢查證實為正常胰腺組織。20 例患者中，男 11 例，女 9 例；年齡 19～64 歲，中位年齡為 47 歲。為了排除腫瘤和慢性炎癥對周圍組織的影響，筆者并未采取同一胰腺癌患者的癌旁組織作為正常組織的對照。45 例患者術前均未接受任何放療和化療。45 例患者的臨床病理資料均完整，病理診斷均由筆者所在醫院病理科復核。該研究通過四川大學華西醫院倫理委員會批準，所有受試對象均簽署了知情同意書。
1.2 主要試劑和設備
主要試劑和材料包括：免疫組化 SP 試劑盒（美國 Sigma 公司），Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗體（B6061）及 MTT 試劑盒（美國 Sigma 公司），PrimeScript? RT reagent Kit、BamHⅠ、MluⅠ及 Taq polymerase（日本 TaKara 公司），PLenO-WPI 載體（美國 Invabio 公司），用于酶切的工作酶 PmeⅠ（美國 NEB 公司），AxyPrep 質粒小量制備試劑盒和 AxyPrep 質粒大量制備試劑盒（美國 Axygen 公司），制備感受態試劑盒（美國 BIOSCIENCES 公司），SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒〔DRR081S，寶生物工程（大連）有限公司〕，superfect 轉染試劑盒（德國 qiagen 公司）。239T 細胞和 PANC-1 細胞株均來源于中國科學院細胞庫。
主要軟件及設備包括：PowerPac 穩壓 DNA 電泳儀、iCycler iQTM 熒光實時多波長 PCR 儀、BIO-RAD680 酶標儀、Mini-PROTEAN Tetra 蛋白電泳儀及 Gel Doc 1000 凝膠成像系統均來源于美國 BIO-RAD 公司，Image-Pro Plus Version 6.0 分析軟件來源于美國 Media Cybernetics 公司。
1.3 PCR 法檢測人胰腺癌及正常胰腺組織中 Beclin-1 mRNA 的表達
取 30～50 mg 胰腺癌或正常胰腺組織塊，剪碎后置入裝有 0.5 mL RNAisoTM Plus 液的 1.5 mL EP 管中，立刻采用勻漿法破碎細胞，再加入 0.5 mL RNAisoTM Plus 液，移液器吹打（>50 次）。將 EP 管置于冰上片刻后，于 4 ℃ 條件下離心 10 min（12 000 r/min，r=8 cm）。取上清轉移至經焦碳酸二乙酯（DEPC）預處理的 EP 管中。室溫放置 5 min 使樣品充分裂解。在上述液體中加入 0.2 mL 氯仿，晃動 15 s，室溫放置 10 min。于 4 ℃ 下離心 10 min（12 000 r/min，r=8 cm），提取 RNA。提取的總 RNA 行 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗。檢驗合格后，以提取的總 RNA 作為模板，采用 PrimeScript? RT reagent Kit 試劑盒提供的 Random 6 mers 及 Oligo（dT）引物，利用逆轉錄酶將 RNA 逆轉錄成 cDNA。再行實時熒光定量 PCR。Beclin-1 基因引物：正義鏈 5′-GATTGAA-GACACAGGAGGCAGT-3′，反義鏈 5′-GTGAGG-ACACCCAAGCAAGAC-3′（擴增長度為 97 bp）。β-actin 為內參基因：正義鏈 5′-GTGGACATCCG-CAAAGAC-3′，反義鏈 5′-AAAGGGTGTAACG-CAACTA-3′（擴增長度為 302 bp），上述引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR 反應體系及反應條件按試劑盒說明書操作。PCR 擴增在 iCycler iQTM 熒光實時多波長 PCR 儀上進行，擴增采用兩步法 PCR 擴增標準程序。第一步：95 ℃ 30 s，40 個循環；第二步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。所有標本的 Beclin-1 mRNA 的相對表達量均經看家基因 β-actin 的校正，以減少實驗誤差。
1.4 免疫組化染色檢測胰腺癌及正常胰腺組織中 Beclin-1 蛋白的表達
免疫組化染色步驟是：首先對組織進行固定、切片脫蠟至水后，置于 3% H2O2 溶液中，37 ℃ 孵育 10 min，以 PBS 緩沖液沖洗 3 次，每次 5 min。置于枸櫞酸緩沖液中（95 ℃）15～20 min，自然冷卻 20 min 以上，冷水沖洗以加快冷卻至室溫，再以 PBS 緩沖液沖洗 3～5 min。加入正常羊血清工作液 10 mL 封閉，37 ℃ 孵育 10 min。滴加 Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗體，比例為 1∶60，4 ℃ 冰箱孵育過夜，再以 PBS 緩沖液沖洗 3～5 min。用 PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照，以乳腺癌標本作為陽性對照。滴加生物素標記的二抗（1∶100），37 ℃ 孵育 30 min。滴加鏈親和素——生物素過氧化物酶復合物，工作濃度為 1∶100，37 ℃ 恒溫孵育 30 min。以 DAB/H2O2 顯色，自來水充分沖洗后，以蘇木精復染，75%、80%、85%、95% 及 100% 乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察結果。首先在 100 倍光鏡下觀察全片，選擇 5 個陽性物質豐富的視野，然后采用 Image-Pro Plus Version 6.0 分析軟件在 400 倍光鏡下測定陽性物質的積分光密度（integated optical density，IOD）值，取 5 個視野的均值，分析 Beclin-1 蛋白的表達情況。IOD 值越高表明 Beclin-1 蛋白表達水平越高。
1.5 HE 染色
本實驗的 HE 染色按常規操作進行。
1.6 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體的構建
提取人正常胰腺組織中（20 例中的任一例）的總 RNA（操作按試劑盒說明書進行）。于美國國立生物技術信息中心（NCBI）基因文庫中獲得人 Beclin-1 cDNA 序列（NM_003766），再根據 PLenO-WPI 載體的插入位點，設計擴增 Beclin-l 基因的一對引物。為了方便檢測，在引物兩端分別加入 BamHⅠ和 MluⅠ酶切位點，同時設計保護性堿基。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列：正義鏈 5′-C GGATCCATGGAA-GGGTCTAAGACGTCCAACA-3′（5′端下劃線部分為 BamHⅠ酶切位點，斜體部分為保護性堿基）；反義鏈 5′-C ACGCGTTCATTTGTTATAAAATTGTG-AGG-3′（5′端下劃線部分為 MluⅠ酶切位點，斜體部分為保護性堿基）。以提取的總 RNA 為模版，通過上述引物和逆轉錄，擴增出 Beclin-1 cDNA（PCR 法，按 PrimeScript? RT reagent Kit 試劑盒說明書進行）。Beclin-1 cDNA 通過 BamHⅠ、MluⅠ雙酶切后，與 PLenO-WPI 載體連接，反應在 T4DNA 連接酶作用下進行。PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體完成后，行限制性內切酶 MluⅠ、BamHⅠ雙酶切來鑒定是否有目的片段插入。酶切產物行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統中觀察結果。同時通過 PCR 方法（PCR 操作按試劑盒說明書進行），擴增重組載體以再次確定是否有正確的 Beclin-1 基因插入 PLenO-WPI 載體。取經酶切反應及 PCR 反應均鑒定正確的克隆，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，將序列測定結果與 NCBI 數據庫公布的人 Beclin-l 基因序列進行比對和分析。最后將 PLenO-WPI-Beclin-1 重組載體轉染至 239T 細胞包裝（轉染按轉染試劑盒說明書進行）。
1.7 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體轉染 PANC-1 胰腺癌細胞
取凍存的 PANC-1 細胞株進行復蘇，調整細胞濃度后接種于 96 孔板中（1×104 個/孔），每孔加入不含抗生素的 DMEM 培養基 100 μL，于 37 ℃、5% CO2 培養箱內培養；取在 1.6 實驗中已包裝好、儲存于 –70 ℃ 保存的重組慢病毒，冰上融化（無菌操作），用漢克斯平衡液（HBSS）稀釋，調整終濃度為 1×104/μL；按病毒與細胞比率（MOI）將 PANC-1 細胞分組，MOI 分別為 1、10 及 100，分別加入相應量 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體，37 ℃、5% CO2 培養箱內培養，每 12 小時更換 1 次培養基；加入重組慢病毒 3 d 后，用熒光顯微鏡觀察陽性細胞比例，感染效率在 80% 以上者為最適轉染 MOI 值。實驗證實 MOI=10 時，感染效率最佳。將 PANC-1 細胞以 1×105 個/孔接種于 24 孔板中，同時每孔以最適 MOI 值加入PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體（同時設未轉染組，未進行重組慢病毒轉染），37 ℃、5% CO2 培養箱內混合培養，8 h 后更換為含 10% 小牛血清的 DMEM 培養基。分別于共培養 24 及 48 h 用熒光顯微鏡觀察病毒感染情況；同時通過熒光定量 PCR 檢測 Beclin-1 mRNA 的表達情況（操作按試劑盒說明書進行）。2 組不同時點均設 4 個復孔，不同時點提取不同培養孔中的細胞進行 PCR 實驗（操作同上）和 Western blot 檢測。
1.8 Western blot 法檢測 Beclin-1 蛋白的表達
通過 Western blot 法檢測 Beclin-1 蛋白的表達，具體步驟如下：在制備好的不連續變性聚丙稀酰胺膠上每孔上 20～100 μg 蛋白，置于電泳儀內電泳，電壓 100 V。之后將聚偏二氟乙烯膜于甲醇中泡 15 s，和膠一起放在轉膜液中平衡 15 min，然后按照陽極-海綿-濾紙-聚偏二氟乙烯膜-膠-濾紙-海綿-陰極的順序安置好，放到濕轉膜儀中，用冰覆蓋，300 mA 轉移 45 min。轉膜結束后取出聚偏二氟乙烯膜，放入麗春紅 S 中染色。再以 5% 牛奶封閉 1 h，TBST 緩沖液洗 3 次，每次 5 min。滴加一抗（Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗體，1∶100）4 ℃ 過夜，第二天以 TBST 緩沖液洗 4 次，每次 5 min。上二抗室溫放置 1 h 后，以 TBST 緩沖液洗 4 次，每次 5 min。最后以增強化學發光法（ ECL）顯色，暗房壓片。
1.9 MTT 法檢測細胞增殖情況
將 PANC-1 細胞接種于 96 孔板中（1×104 個/孔）后，分為 3 組：轉染組、空載體組和空白對照組。轉染組加入 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體；空載體組加入 PLenO-WPI 慢病毒載體；空白對照組只加入培養基。將細胞于 37 ℃、5% CO2 培養箱內培養，每 12 小時更換 1 次培養基。于轉染 1～7 d 期間每天檢測細胞增殖情況（每個時點 3 組均設 3 個復孔）。MTT 檢測步驟：每孔加入 MTT 20 μL，孵育 4 h 后離心（1 200 r/min，r=11 cm，5 min），去上清，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩 10 min，用酶標儀于 570 nm 處測定 OD 值。OD 值隨細胞增殖而增加。
1.10 統計學方法
所有數據資料采用 SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（ ±s）表示，統計分析方法采用成組 t 檢驗或方差分析（兩兩比較采用 LSD 法）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 胰腺癌及正常胰腺組織中 Beclin-1 mRNA 及其蛋白的表達結果
實時熒光定量 PCR 結果顯示：胰腺癌組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平低于正常胰腺組織（P=0.003 9），見圖 1a，提示胰腺癌組織中 Beclin-1 mRNA 的表達下調。免疫組化染色結果顯示：Beclin-1 蛋白主要于細胞漿內表達，呈棕黃色物質沉積；胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白的 IOD 值低于正常胰腺組織（P=0.000 2），見圖 1b 和圖 2，提示胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白的表達也下調。
圖1
示胰腺癌組織和正常胰腺組織中 Beclin-1 mRNA 及其蛋白的表達結果 a：Beclin-1 mRNA；b：Beclin-1 蛋白；與正常胰腺組織比較，*P<0.05
圖2
示免疫組化染色結果（SP ×200） a：正常胰腺組織；b：胰腺癌組織
2.2 HE 染色結果
HE 染色顯示，胰腺癌組織中無典型的腺泡樣結構，細胞排列不規則，細胞大小不一，邊界不清，核大深染，無核仁，腺管呈條索狀；正常胰腺組織中可見典型的外分泌腺腺泡結構，細胞排列規則，極性分明（圖 3）。
圖3
示病理學檢查結果（HE ×200） a：正常胰腺組織；b：胰腺癌組織
2.3 人胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系
在胰腺癌患者中，Beclin-1 蛋白的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑及分化程度均無關（P>0.05），與 TNM 分期及淋巴結轉移有關，TNM Ⅲ期和Ⅳ期患者的 Beclin-1 蛋白的表達水平均低于Ⅰ期或Ⅱ期患者（P<0.05），但Ⅲ期和Ⅳ期比較、Ⅰ期和Ⅱ期比較差異均無統計學意義（P>0.05）；淋巴結轉移陽性患者 Beclin-1 蛋白的表達水平低于陰性患者（P=0.011）。見表 1。
表1
胰腺癌組織中 Beclin-l 蛋白的表達與患者臨床病理學特征的關系
2.4 PLenO-WPI-Beclin-1 重組載體的鑒定結果
用限制性內切酶 MluⅠ、BamHⅠ雙酶切PLenO-WPI-Beclin-1重組慢病毒載體，通過電泳分離酶切片段，得到 1 條長約 1 233 bp 的片段和 1 條長約 11 kp 的片段，片段長度符合 Beclin-1 基因及 PLenO-WPI 載體大小；而用 MluⅠ、BamHⅠ雙酶切的空質粒，電泳結果顯示為 1 條片段，長約 11 kp（圖 4a）。該結果顯示，目的基因片段已正確地插入到真核表達載體 PLenO-WPI 中。將獲得的 PLenO-WPI-Beclin-1 重組載體與 Beclin-1 特異引物混合，通過 PCR 擴增，電泳后得到 1 條長為 1 233 bp的片段（圖 4b），證明 Beclin-1 基因在重組載體中。將酶切鑒定及 PCR 鑒定均為陽性的克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司進行插入片段的序列測定。測序結果顯示，插入片段序列長度為 1 233 bp，測序圖譜如圖 4c 所示。將測序結果與 NCBI 數據庫公布的人 Beclin-l 基因序列進行 BLAST 比對，結果顯示插入片段與人 Beclin-1 基因序列相同。目的片段插入方向正確，閱讀框架不變。
圖4
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體鑒定 a： PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體酶切后的電泳圖，M 為 DNA maker，1、2 及 4 條帶為 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體，3 條帶為 PLenO-WPI 空載體；b：實時熒光 PCR 產物電泳圖，M 為 DNA marker，1 條帶為 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體；c：插入片段的測序結果
2.5 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體轉染 PANC-1 胰腺癌細胞后 Beclin-1 mRNA 的表達
PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體與 PANC-1 細胞共培養 24 h 后，可在熒光顯微鏡下觀察到 PANC-1 細胞熒光表達明顯（圖 5）；共培養 48 h 后，有 80% 細胞的胞漿內能觀察到綠色熒光顯示，提示 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體成功轉染 PANC-1 細胞并表達。為進一步明確是否有 Beclin-1 mRNA 的表達，筆者進行了 PCR 實驗。結果如圖 6 所示，和未轉染組對比，轉染后 24 h 和 48 h，同時點轉染組細胞的 Beclin-1 mRNA 的表達水平均高于未轉染組（P<0.05）。通過 Western blot 檢測轉染后 PANC-1 細胞中 Beclin-1 蛋白的表達，同樣發現，轉染后蛋白表達明顯上調（圖 7）。上述結果表明，PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體能在 PANC-1 細胞內正確表達 Beclin-1 基因。
圖5
示轉染組和未轉染組 PANC-1 細胞的熒光顯微鏡觀察結果（ ×400） a：未轉染組 24 h；b：未轉染組 48 h；c：轉染組 24 h；d：轉染組 48 h
圖6
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體轉染 PANC-1 細胞后細胞中 Beclin-1 mRNA 的表達情況 同時點與未轉染組比較，*P<0.05
圖7
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體轉染 PANC-1 細胞后細胞中 Beclin-1 蛋白表達的電泳圖
2.6 MTT 檢測結果
總體來說，轉染 1～7 d 期間，轉染組、空白對照組和空載體組細胞的增殖能力在轉染第 2 天時開始均有所升高，但轉染組相較于空白對照組和空載體組升高幅度較低，而空載體組和空白對照組間區分度不大（圖 8）。轉染 1、2 及 3 d 時，3 組細胞的 OD 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；從轉染 4 d 開始，至轉染 7 d 期間，同時點轉染組細胞的 OD 值較空白對照組和空載體組均較低（P<0.05），但同時點空載體組和空白對照組細胞的 OD 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。提示隨著 Beclin-1 基因的增強表達，PANC-1 細胞的增殖能力受到明顯抑制。
圖8
示 MTT 法檢測結果 同時點與空載體組和空白對照組比較，*P<0.05
3 討論
Beclin-1 基因是調控自噬的重要基因，自從認識到自噬與腫瘤的發生發展相關后，Beclin-1 表達對腫瘤的影響就成為研究的熱點。
3.1 Beclin-1 與腫瘤的關系
Beclin-1 基因與腫瘤的關系首先在乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌中得到驗證。研究[17]表明，有 75% 的卵巢癌、50% 的乳腺癌以及 40% 的前列腺癌組織中存在染色體 17q21 位點等位基因的缺失。通過對卵巢癌染色體 17q21 位點缺失的精確序列分析找到了目前唯一已知與自噬相關的基因就是 Beclin-l 基因[19]。Liang 等[18]將 Beclin-1 基因轉染人乳腺癌細胞后，發現細胞的增殖能力降低，在裸鼠上的成瘤能力減弱。2003 年，Qu 等[21]通過建立攜帶 Beclin-1+/– 雜合缺失的鼠模型，結果發現，Beclin-1+/– 雜合缺失鼠的自發性腫瘤的發生率很高，這些自發腫瘤包括肺腺癌、肝細胞癌、淋巴瘤等，在這些 Beclin-1+/– 雜合缺失的鼠細胞中自噬活性明顯下降，但沒有證據證明凋亡發生改變；此外還發現，Beclin-1+/– 雜合缺失可導致自噬空泡形成減少。據此，多數研究者[22-23]認為，Beclin-1 等位基因的缺失或表達降低促進了細胞增殖，削弱了自噬，導致腫瘤的形成。但并非所有腫瘤組織中 Beclin-1 基因的表達都是降低的。康凱夫等[24]在肝癌的研究中發現，肝癌組織中 Beclin-1 蛋白的表達水平明顯高于正常組織。對結腸癌的研究[25]也表明，Beclin-1 蛋白在腫瘤組織中的表達陽性率高達 85.2%（98/115），而癌旁組織中無或只有中等程度的 Beclin-1 蛋白表達。在其他腫瘤中也有類似發現[26-27]。
3.2 自噬在腫瘤中的作用
Beclin-1 分子對腫瘤的影響，最終要通過自噬來實現。如同 Beclin-1 分子在腫瘤組織中的表達不全是降低一樣，目前自噬與腫瘤的關系同樣存在較大爭論。研究[28]表明，自噬水平在細胞的“危機”狀況下可快速上調，如營養缺乏、細胞密度負荷、低氧等。此時自噬的降解產物如氨基酸、核苷酸、游離脂肪酸等可供能量并再循環；此外自噬還可以作為一種防御機制清除胞質內受損的細胞器和代謝產物，進行亞細胞水平上的重構，保護受損的細胞[28]。另有研究者[29-30]發現，在營養缺乏的環境下，自噬可保護腫瘤細胞，維持腫瘤的生存。如果此時阻斷自噬效應，腫瘤細胞則會發生凋亡[29-30]。然而其他研究者[31-33]對比腫瘤與正常細胞的自噬水平后卻發現，腫瘤細胞的自噬水平均明顯低于正常細胞。使用致癌物質作用于正常細胞，也發現這些細胞的自噬水平與未處理組對比明顯降低[11, 34]。在對大鼠胰腺癌的研究中發現，在癌前病變或良性腫瘤期，自噬活性增強，而腺瘤向腺癌轉化的過程中，自噬活性明顯降低，提示在胰腺癌的發生過程中自噬活性降低可能是必須的[35]。這些相互矛盾的研究結果表明，自噬對于腫瘤細胞可能是把“雙刃劍”。自噬時因大分子物質循環和有害物質得到隔離使腫瘤細胞生存，但當自噬超過某一閾值、大量降解蛋白質與細胞器時則會導致自噬性死亡。
3.3 Beclin-1 分子的表達下調可能是胰腺癌發展的機制之一
本研究通過實時熒光定量 PCR 及免疫組化染色技術檢測了人胰腺癌及正常胰腺組織中 Beclin-1 分子的表達情況，結果發現，人胰腺癌組織中 Beclin-1 基因及蛋白的表達水平均低于正常胰腺組織。胰腺癌組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平僅為正常胰腺組織的 5.47%（0.148 5/2.713 9），且其 Beclin-1 蛋白的表達水平僅為正常胰腺組織的 10.20%（22 990.304 3/225 432.089 3）。該結果表明，Beclin-1 分子在人胰腺癌組織中的表達下調，Beclin-1 分子的表達下調可能是導致胰腺癌發生發展的機制之一。本研究結論支持自噬及 Beclin-1 分子為腫瘤抑制機制之一的觀點。
本研究組進一步分析了胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白的表達水平與患者臨床病理學特征的關系。結果顯示，Beclin-1 蛋白的表達水平在不同年齡和不同性別組之間并無差別，且其表達和腫瘤直徑及分化程度間的關系也無統計學意義。但在不同臨床分期患者之間，Beclin-1 蛋白的表達水平存在差別，分期較早（Ⅰ期和Ⅱ期）的胰腺癌組織中 Beclin-1 蛋白的表達水平高于分期較晚（Ⅲ期和Ⅳ期）者。這一結果提示，Beclin-1 蛋白的表達下調，可能增強了胰腺癌細胞的侵襲力。因為分期較早的胰腺癌（Ⅰ期和Ⅱ期）并無血管侵襲及遠處轉移，而Ⅲ期和Ⅳ期患者均有遠隔器官轉移及血管侵襲現象。此外，本組資料結果還表明，淋巴結轉移陽性組患者的 Beclin-1 蛋白的表達水平低于轉移陰性組，提示 Beclin-1 蛋白可能對腫瘤淋巴轉移也有影響。
為進一步驗證 Beclin-1 基因對胰腺癌的影響，筆者通過體外實驗將 Beclin-1 基因表達載體轉染進入 PANC-1 細胞。結果提示，轉染了 PLenO-WPI-Beclin-1 重組慢病毒載體的 PANC-1 細胞的體外增殖能力明顯下降。MTT 法檢測結果表明，自培養第 4 天開始，轉染組與空載體組和空白對照組之間的 OD 值出現差別，轉染組的 OD 值較低；轉染第 7 天時，轉染組的 OD 值僅為空白對照組的 44.38%（0.851 5/1.918 7）。這一結果與 Liang 等[18]在乳腺癌細胞上的研究結果一致，表明自噬基因 Beclin-1 在體外確實對腫瘤細胞有抑制作用。Chau 等[36]的研究表明，自噬可能是抑制腫瘤血管形成和分布的一種方式。當血管形成抑制劑 endostatin 作用于細胞時，可以在血管內皮細胞中觀察到自噬性細胞死亡的特征。在實性腫瘤中，血管形成有助于腫瘤的轉移和增長，通過自噬性細胞死亡抑制血管形成可以阻止腫瘤的進展。而自噬能力的減弱，有助于胰腺癌周圍毛細血管的形成，提高了腫瘤的侵襲力。
胰腺癌預后極差的原因除了胰腺癌癥狀不明顯、患者就診時就屬中晚期之外，其侵襲和轉移能力也是制約和影響胰腺癌治療效果的關鍵所在。本研究結果表明，Beclin-1 基因的表達與胰腺癌侵襲力及淋巴結轉移有關，這可能為胰腺癌的治療提供了新的思路。
