引用本文： 畢華強, 劉輝, 張曦, 馬寬生, 張輝. Akt/mTOR 信號在轉化生長因子-β 誘導動脈內皮間質轉化中的作用研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(7): 808-812. doi: 10.7507/1007-9424.201612024 復制
移植動脈硬化是器官移植慢性排斥反應的主要病理特點[1-3]。移植動脈硬化的基本組織病理特征是移植動脈內膜進行性增厚，其中新生內膜平滑肌細胞增殖和積聚是硬化動脈內膜增生的主要細胞學基礎[4-7]。近來實驗研究[8-9]發現，在大鼠主動脈同種異體移植后，血清轉化生長因子（TGF）-β 水平明顯升高，誘導鄰近動脈內皮細胞向移植動脈遷移，并參與移植動脈內膜增厚和內膜平滑肌細胞的積聚，同時此過程中內皮細胞 Akt/mTOR 信號活化。但 TGF-β 誘導動脈內皮細胞向平滑肌細胞分化的作用及其機制尚缺乏充分研究。本研究應用重組 TGF-β 孵育大鼠動脈內皮細胞，檢測其對內皮細胞標志物表達變化的影響及對 Akt/mTOR 信號通路活化的影響，并觀察抑制此通路后，TGF-β 對動脈內皮細胞標志物表達變化的影響，探討 TGF-β 誘導動脈內皮細胞向平滑肌細胞間質轉化的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 材料
重組 TGF-β、磷酸化 Akt、總 Akt、磷酸化 mTOR以及總 mTOR 一抗均購自美國 Cell Signaling Technology 公司。平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌（smooth muscle，SM）-22α、 CD31以及vW 因子一抗均購自美國 Abcam 公司。Ly294002和雷帕霉素（rapamycin）購自 Sigma-Aldrich 上海公司。β-actin 一抗和二抗以及 SABC 免疫熒光試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司。ECL 發光試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。DMEM 培養基、細胞培養用的青霉素、鏈霉素以及內皮生長因子均購自美國 Gibco 公司。
1.2 原代大鼠動脈內皮細胞的分離培養
根據 McGuire 等[10]報道的外植貼壁法分離原代培養大鼠主動脈內皮細胞。大鼠麻醉后，取其胸主動脈，在 DMEM 無血清培養基中予以縱行剖開，并將其裁剪為大小約 1 mm 見方的組織塊。將組織塊以內膜面朝下，貼入Ⅰ型膠原酶包被的 T25 細胞培養瓶中，以含 20% 胎牛血清的 DMEM 培養基、100 u/mL 的青霉素、100 u/mL 鏈霉素以及 50 mg/mL 的內皮生長因子在 37 ℃、5%CO2 培養箱中培養 4 d，待鵝卵石樣細胞從組織塊周圍長出后，移除組織塊，貼壁細胞繼續于 37℃、含 5%CO2 的培養箱中傳代培養，經 vW 因子染色鑒定后，取第 3～第 8 代細胞用于實驗。
1.3 細胞處理
將重組的 TGF-β 稀釋于無血清培養基中，至 10 ng/mL。將上述內皮細胞予以 10 ng/mL 重組 TGF-β 孵育 48 h，對照組細胞予以無血清培養基孵育。對于信號通路抑制，先分別予以 20 μmol/L 的 Ly294002 和 10 nmol/L 雷帕霉素預孵育內皮細胞 12 h 后，再以 10 ng/mL 重組 TGF-β 孵育 48 h；對照組細胞先以無血清培養基預處理，再以 10 ng/mL 重組 TGF-β 孵育 48 h。然后進行后續實驗檢測。
1.4 免疫熒光染色檢測內皮及間質細胞標志物
將經上述處理后的內皮細胞接種于蓋玻片上，以 SABC 法進行免疫熒光染色。4% 多聚甲醛固定后，以 0.3% triton-x-100 對細胞膜打孔 15 min，30% 雙氧水與甲醇混合浸泡 60 min 以滅活內源性過氧化物酶，洗滌后以 5% 牛血清白蛋白封閉 60 min，分別加入 α-SMA 一抗（1∶500）、SM-22α 一抗（1∶400）及 CD31（1∶400）和 vW 因子一抗（1∶400），以 IgG 作為對照，4℃ 濕盒內孵育過夜。再滴加生物素化二抗室溫孵育 20 min 后加入 SABC 反應液室溫孵育 20 min，洗滌后 DAPI 復染核、封片，于熒光顯微鏡下定性觀察內皮及間質細胞標志物紅色或綠色熒光顯色情況，以熒光增強表示表達上調，熒光減弱表示表達下調。
1.5 免疫蛋白印跡法檢測信號通路蛋白的表達
將上述處理后的細胞洗滌后加入蛋白裂解液提取總蛋白。經煮沸變性后按 30 μg/孔上樣，然后經 10% SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移至 PVDF 膜，以 5% 脫脂奶粉封閉 60 min，分別加入 p-Akt 一抗（1∶1 000）、t-Akt 一抗（1∶1 000）、p-mTOR 一抗（1∶1 000）、t-mTOR 一抗（1∶1 000）和 β-actin 一抗（1∶1 000）4 ℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育 1 h 后，ECL 發光，曝光顯影。以 Image J 軟件定量分析顯影條帶相對于內參蛋白的密度。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 11.0 統計軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（ ±s）表示，行方差分析。檢驗水準=0.05。
2 結果
2.1 TGF-β 誘導大鼠動脈內皮細胞向間質平滑肌細胞轉化相關指標檢測結果
細胞免疫熒光染色結果顯示，大鼠動脈內皮細胞經重組 TGF-β 孵育后，其平滑肌細胞標志物 α-SMA 和 SM-22α 表達明顯上調，而內皮細胞標志物 CD31 和 vW 因子的表達明顯下調（圖 1）。
圖1
TGF-β 處理后大鼠動脈內皮細胞中內皮細胞標志物 和間質細胞標志物的免疫熒光染色結果（ ×200）
2.2 TGF-β 活化大鼠動脈內皮細胞 Akt/mTOR 信號通路
免疫蛋白印跡法檢測結果顯示，TGF-β 在誘導大鼠動脈內皮細胞向平滑肌細胞轉化時，其 Akt 和 mTOR 磷酸化水平顯著增加，磷酸化 Akt/總 Akt 比例和磷酸化 mTOR/總 mTOR 比例顯著提高（圖 2）。
圖2
TGF-β 處理后大鼠動脈內皮細胞中 Akt 和 mTOR 磷酸化水平檢測結果。 a：蛋白電泳圖；b：蛋白相對定量檢測結果；與對照組比較，*P<0.05
2.3 Akt/mTOR 信號抑制，阻斷 TGF-β 誘導大鼠動脈內皮細胞間質轉化
免疫蛋白印跡法檢測結果顯示，內皮細胞經 Ly294002 和雷帕霉素預處理后，Akt 和 mTOR 磷酸化活化被明顯抑制（圖 3）。經 Ly294002 和雷帕霉素預處理的細胞，免疫熒光染色結果顯示，TGF-β 不能誘導大鼠動脈內皮細胞表達平滑肌細胞標志物 α-SMA 和 SM-22α，而保持表達內皮細胞標志物 CD31 和 vW 因子（圖 4）。
圖3
Ly294002 和雷帕霉素預處理后 TGF-β 誘導大鼠動脈內皮細胞中 Akt 和 mTOR 磷酸化水平檢測結果。 a：蛋白電泳圖；b：蛋白相對定量檢測結果；與無 TGF-β 處理組比較，*P<0.05；與單一 TGF-β 處理組比較，#P<0.05
圖4
Ly294002 和雷帕霉素預處理后 TGF-β 誘導大鼠動脈內皮細胞中內皮細胞標志物和間質細胞標志物的免疫熒光染色結果 （ ×200）
3 討論
移植動脈硬化是導致移植物功能喪失和移植失敗的主要原因[1-3]。其基本病理特征是移植動脈內膜進行性增厚，其中新生內膜平滑肌細胞增殖和積聚是硬化動脈內膜增生的主要細胞學基礎[4-7]。然而目前對于新生內膜平滑肌細胞的來源仍不明確。既往研究發現，新生內膜平滑肌細胞除由中膜平滑肌細胞遷移而來[11-14]，以及由循環骨髓間充質干細胞遷移、聚集和分化而來外[15-16]，移植動脈內皮直接向間質平滑肌細胞轉化[8-9]，也是移植動脈新生內膜細胞的重要來源。因此闡明動脈內皮細胞向間質平滑肌細胞分化的機制，對于開發新的抗移植排斥藥物，防治移植物動脈硬化具有重要意義。
TGF-β 是誘導上皮間質轉化及內皮間質轉化最重要的細胞因子。TGF-β 通過活化 Smad3 信號通路誘導上皮細胞及內皮細胞表達間質標志物，并減弱自身上皮性或內皮性標志物的表達，同時促進細胞的遷移能力，因此 TGF-β/Smad3 信號通路被視為誘導上皮間質轉化和內皮間質轉化的經典分子通路[17-20]。有研究[8]也證實，在實驗性移植動脈模型中，移植后大鼠血清 TGF-β 濃度顯著升高，并誘導動脈內皮細胞參與移植動脈硬化的形成。然而臨床實踐及實驗研究[8, 21-22]表明，移植后給以 Akt/mTOR 信號通路抑制劑 Ly294002 和雷帕霉素也可顯著減輕移植動脈硬化，提示 Akt/mTOR 信號通路可能在移植動脈新生內膜形成中發揮重要作用。本研究發現，大鼠內皮細胞經 TGF-β 刺激后，其 Akt/mTOR 信號通路顯著活化，同時內皮標志物表達下調，平滑肌細胞標志物表達明顯上調，提示 TGF-β 對大鼠動脈內皮細胞的間質轉化誘導可能是由 Akt/mTOR 信號通路介導發揮作用的。在應用 Akt 信號抑制劑 Ly294002 和 mTOR 抑制劑雷帕霉素預先抑制大鼠內皮細胞 Akt/mTOR 信號通路后，TGF-β 對大鼠動脈內皮細胞的間質平滑肌轉化的誘導作用則明顯減弱，進一步證實 TGF-β 誘導動脈內皮向間質平滑肌轉化依賴于 Akt/mTOR 信號通路的活化。
近來研究[10]表明，泛素特異蛋白酶 4（ubiquitin-specific protease，USP4）能夠直接與 TGF-βⅠ型受體相互作用，阻止后者被泛素化降解，從而使 TGF-βⅠ型受體在細胞質膜表面維持較高水平，從而增強 TGF-β/Smad3 信號。然而同時 AKT 蛋白也能直接與 USP4 作用并將其磷酸化，磷酸化的 USP4 能夠重新從細胞核轉移到細胞質膜上，一旦去除 USP4 和抑制 TGF-β受體Ⅰ型激酶則能夠抑制 AKT 信號，提示 USP4 是 TGF-β 通路與 AKT 通路進行交聯的決定性因子[23-25]，也證實本研究中 TGF-β 除可活化 Smas3 信號介導內皮間質轉化外，也可通過活化 Akt/mTOR 信號通路介導內皮間質轉化。
除既往發現的移植受體可通過產生 SDF-1α 誘導移植受體骨髓間充質干細胞遷移、聚集、分化導致動脈內膜增生外[15]，本研究結果提示還可通過產生 TGF-β 活化鄰近動脈內皮細胞的 Akt/mTOR 信號，直接誘導其向平滑肌細胞轉化，進而參與移植動脈內膜增生。表明移植動脈內皮細胞本身即可能是移植動脈增生內膜平滑肌細胞的主要來源之一。因此開發新的、可用于人體的 Akt/mTOR 信號抑制劑，可能是防治移植動脈硬化和慢性排斥反應的又一途徑。
移植動脈硬化是器官移植慢性排斥反應的主要病理特點[1-3]。移植動脈硬化的基本組織病理特征是移植動脈內膜進行性增厚，其中新生內膜平滑肌細胞增殖和積聚是硬化動脈內膜增生的主要細胞學基礎[4-7]。近來實驗研究[8-9]發現，在大鼠主動脈同種異體移植后，血清轉化生長因子（TGF）-β 水平明顯升高，誘導鄰近動脈內皮細胞向移植動脈遷移，并參與移植動脈內膜增厚和內膜平滑肌細胞的積聚，同時此過程中內皮細胞 Akt/mTOR 信號活化。但 TGF-β 誘導動脈內皮細胞向平滑肌細胞分化的作用及其機制尚缺乏充分研究。本研究應用重組 TGF-β 孵育大鼠動脈內皮細胞，檢測其對內皮細胞標志物表達變化的影響及對 Akt/mTOR 信號通路活化的影響，并觀察抑制此通路后，TGF-β 對動脈內皮細胞標志物表達變化的影響，探討 TGF-β 誘導動脈內皮細胞向平滑肌細胞間質轉化的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 材料
重組 TGF-β、磷酸化 Akt、總 Akt、磷酸化 mTOR以及總 mTOR 一抗均購自美國 Cell Signaling Technology 公司。平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌（smooth muscle，SM）-22α、 CD31以及vW 因子一抗均購自美國 Abcam 公司。Ly294002和雷帕霉素（rapamycin）購自 Sigma-Aldrich 上海公司。β-actin 一抗和二抗以及 SABC 免疫熒光試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司。ECL 發光試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。DMEM 培養基、細胞培養用的青霉素、鏈霉素以及內皮生長因子均購自美國 Gibco 公司。
1.2 原代大鼠動脈內皮細胞的分離培養
根據 McGuire 等[10]報道的外植貼壁法分離原代培養大鼠主動脈內皮細胞。大鼠麻醉后，取其胸主動脈，在 DMEM 無血清培養基中予以縱行剖開，并將其裁剪為大小約 1 mm 見方的組織塊。將組織塊以內膜面朝下，貼入Ⅰ型膠原酶包被的 T25 細胞培養瓶中，以含 20% 胎牛血清的 DMEM 培養基、100 u/mL 的青霉素、100 u/mL 鏈霉素以及 50 mg/mL 的內皮生長因子在 37 ℃、5%CO2 培養箱中培養 4 d，待鵝卵石樣細胞從組織塊周圍長出后，移除組織塊，貼壁細胞繼續于 37℃、含 5%CO2 的培養箱中傳代培養，經 vW 因子染色鑒定后，取第 3～第 8 代細胞用于實驗。
1.3 細胞處理
將重組的 TGF-β 稀釋于無血清培養基中，至 10 ng/mL。將上述內皮細胞予以 10 ng/mL 重組 TGF-β 孵育 48 h，對照組細胞予以無血清培養基孵育。對于信號通路抑制，先分別予以 20 μmol/L 的 Ly294002 和 10 nmol/L 雷帕霉素預孵育內皮細胞 12 h 后，再以 10 ng/mL 重組 TGF-β 孵育 48 h；對照組細胞先以無血清培養基預處理，再以 10 ng/mL 重組 TGF-β 孵育 48 h。然后進行后續實驗檢測。
1.4 免疫熒光染色檢測內皮及間質細胞標志物
將經上述處理后的內皮細胞接種于蓋玻片上，以 SABC 法進行免疫熒光染色。4% 多聚甲醛固定后，以 0.3% triton-x-100 對細胞膜打孔 15 min，30% 雙氧水與甲醇混合浸泡 60 min 以滅活內源性過氧化物酶，洗滌后以 5% 牛血清白蛋白封閉 60 min，分別加入 α-SMA 一抗（1∶500）、SM-22α 一抗（1∶400）及 CD31（1∶400）和 vW 因子一抗（1∶400），以 IgG 作為對照，4℃ 濕盒內孵育過夜。再滴加生物素化二抗室溫孵育 20 min 后加入 SABC 反應液室溫孵育 20 min，洗滌后 DAPI 復染核、封片，于熒光顯微鏡下定性觀察內皮及間質細胞標志物紅色或綠色熒光顯色情況，以熒光增強表示表達上調，熒光減弱表示表達下調。
1.5 免疫蛋白印跡法檢測信號通路蛋白的表達
將上述處理后的細胞洗滌后加入蛋白裂解液提取總蛋白。經煮沸變性后按 30 μg/孔上樣，然后經 10% SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移至 PVDF 膜，以 5% 脫脂奶粉封閉 60 min，分別加入 p-Akt 一抗（1∶1 000）、t-Akt 一抗（1∶1 000）、p-mTOR 一抗（1∶1 000）、t-mTOR 一抗（1∶1 000）和 β-actin 一抗（1∶1 000）4 ℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育 1 h 后，ECL 發光，曝光顯影。以 Image J 軟件定量分析顯影條帶相對于內參蛋白的密度。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 11.0 統計軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（ ±s）表示，行方差分析。檢驗水準=0.05。
2 結果
2.1 TGF-β 誘導大鼠動脈內皮細胞向間質平滑肌細胞轉化相關指標檢測結果
細胞免疫熒光染色結果顯示，大鼠動脈內皮細胞經重組 TGF-β 孵育后，其平滑肌細胞標志物 α-SMA 和 SM-22α 表達明顯上調，而內皮細胞標志物 CD31 和 vW 因子的表達明顯下調（圖 1）。
圖1
TGF-β 處理后大鼠動脈內皮細胞中內皮細胞標志物 和間質細胞標志物的免疫熒光染色結果（ ×200）
2.2 TGF-β 活化大鼠動脈內皮細胞 Akt/mTOR 信號通路
免疫蛋白印跡法檢測結果顯示，TGF-β 在誘導大鼠動脈內皮細胞向平滑肌細胞轉化時，其 Akt 和 mTOR 磷酸化水平顯著增加，磷酸化 Akt/總 Akt 比例和磷酸化 mTOR/總 mTOR 比例顯著提高（圖 2）。
圖2
TGF-β 處理后大鼠動脈內皮細胞中 Akt 和 mTOR 磷酸化水平檢測結果。 a：蛋白電泳圖；b：蛋白相對定量檢測結果；與對照組比較，*P<0.05
2.3 Akt/mTOR 信號抑制，阻斷 TGF-β 誘導大鼠動脈內皮細胞間質轉化
免疫蛋白印跡法檢測結果顯示，內皮細胞經 Ly294002 和雷帕霉素預處理后，Akt 和 mTOR 磷酸化活化被明顯抑制（圖 3）。經 Ly294002 和雷帕霉素預處理的細胞，免疫熒光染色結果顯示，TGF-β 不能誘導大鼠動脈內皮細胞表達平滑肌細胞標志物 α-SMA 和 SM-22α，而保持表達內皮細胞標志物 CD31 和 vW 因子（圖 4）。
圖3
Ly294002 和雷帕霉素預處理后 TGF-β 誘導大鼠動脈內皮細胞中 Akt 和 mTOR 磷酸化水平檢測結果。 a：蛋白電泳圖；b：蛋白相對定量檢測結果；與無 TGF-β 處理組比較，*P<0.05；與單一 TGF-β 處理組比較，#P<0.05
圖4
Ly294002 和雷帕霉素預處理后 TGF-β 誘導大鼠動脈內皮細胞中內皮細胞標志物和間質細胞標志物的免疫熒光染色結果 （ ×200）
3 討論
移植動脈硬化是導致移植物功能喪失和移植失敗的主要原因[1-3]。其基本病理特征是移植動脈內膜進行性增厚，其中新生內膜平滑肌細胞增殖和積聚是硬化動脈內膜增生的主要細胞學基礎[4-7]。然而目前對于新生內膜平滑肌細胞的來源仍不明確。既往研究發現，新生內膜平滑肌細胞除由中膜平滑肌細胞遷移而來[11-14]，以及由循環骨髓間充質干細胞遷移、聚集和分化而來外[15-16]，移植動脈內皮直接向間質平滑肌細胞轉化[8-9]，也是移植動脈新生內膜細胞的重要來源。因此闡明動脈內皮細胞向間質平滑肌細胞分化的機制，對于開發新的抗移植排斥藥物，防治移植物動脈硬化具有重要意義。
TGF-β 是誘導上皮間質轉化及內皮間質轉化最重要的細胞因子。TGF-β 通過活化 Smad3 信號通路誘導上皮細胞及內皮細胞表達間質標志物，并減弱自身上皮性或內皮性標志物的表達，同時促進細胞的遷移能力，因此 TGF-β/Smad3 信號通路被視為誘導上皮間質轉化和內皮間質轉化的經典分子通路[17-20]。有研究[8]也證實，在實驗性移植動脈模型中，移植后大鼠血清 TGF-β 濃度顯著升高，并誘導動脈內皮細胞參與移植動脈硬化的形成。然而臨床實踐及實驗研究[8, 21-22]表明，移植后給以 Akt/mTOR 信號通路抑制劑 Ly294002 和雷帕霉素也可顯著減輕移植動脈硬化，提示 Akt/mTOR 信號通路可能在移植動脈新生內膜形成中發揮重要作用。本研究發現，大鼠內皮細胞經 TGF-β 刺激后，其 Akt/mTOR 信號通路顯著活化，同時內皮標志物表達下調，平滑肌細胞標志物表達明顯上調，提示 TGF-β 對大鼠動脈內皮細胞的間質轉化誘導可能是由 Akt/mTOR 信號通路介導發揮作用的。在應用 Akt 信號抑制劑 Ly294002 和 mTOR 抑制劑雷帕霉素預先抑制大鼠內皮細胞 Akt/mTOR 信號通路后，TGF-β 對大鼠動脈內皮細胞的間質平滑肌轉化的誘導作用則明顯減弱，進一步證實 TGF-β 誘導動脈內皮向間質平滑肌轉化依賴于 Akt/mTOR 信號通路的活化。
近來研究[10]表明，泛素特異蛋白酶 4（ubiquitin-specific protease，USP4）能夠直接與 TGF-βⅠ型受體相互作用，阻止后者被泛素化降解，從而使 TGF-βⅠ型受體在細胞質膜表面維持較高水平，從而增強 TGF-β/Smad3 信號。然而同時 AKT 蛋白也能直接與 USP4 作用并將其磷酸化，磷酸化的 USP4 能夠重新從細胞核轉移到細胞質膜上，一旦去除 USP4 和抑制 TGF-β受體Ⅰ型激酶則能夠抑制 AKT 信號，提示 USP4 是 TGF-β 通路與 AKT 通路進行交聯的決定性因子[23-25]，也證實本研究中 TGF-β 除可活化 Smas3 信號介導內皮間質轉化外，也可通過活化 Akt/mTOR 信號通路介導內皮間質轉化。
除既往發現的移植受體可通過產生 SDF-1α 誘導移植受體骨髓間充質干細胞遷移、聚集、分化導致動脈內膜增生外[15]，本研究結果提示還可通過產生 TGF-β 活化鄰近動脈內皮細胞的 Akt/mTOR 信號，直接誘導其向平滑肌細胞轉化，進而參與移植動脈內膜增生。表明移植動脈內皮細胞本身即可能是移植動脈增生內膜平滑肌細胞的主要來源之一。因此開發新的、可用于人體的 Akt/mTOR 信號抑制劑，可能是防治移植動脈硬化和慢性排斥反應的又一途徑。
