引用本文： 劉勤江, 魏溫濤, 田尤新, 楊榮. 甲狀腺胸腺樣分化癌 5 例分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(7): 830-836. doi: 10.7507/1007-9424.201611105 復制
甲狀腺胸腺樣分化癌（carcinoma showing thymus-like differentiation，CASTLE）在 WHO（2004 版）內分泌腫瘤分類[1]中作了明確定義，即甲狀腺癌伴類似于胸腺上皮腫瘤的結構。甲狀腺 CASTLE 是一種發生于甲狀腺少見的惡性腫瘤，具有特定的組織學改變和免疫表型，腫瘤中異型上皮成分有其特殊的免疫組化特征，形態及結構上與發生于胸腺的上皮性腫瘤及轉移性低分化癌類似，又稱甲狀腺內上皮樣胸腺瘤、原發性甲狀腺胸腺瘤或甲狀腺淋巴上皮癌等，臨床癥狀有時起病較重，但預后較好[1]。筆者自 2011 年 8 月以來收治了 5 例，現結合文獻對該類腫瘤的組織起源、病理學特點、免疫學表型及臨床診治情況進行分析。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本組甲狀腺 CASTLE 患者 5 例，男 3 例，女 2 例；年齡 47～66 歲，中位年齡 56 歲。TNM分期：T2 期 1 例、T3 期 2 例、T4a 期 2 例；N0 1 例、N1a 2 例、N1b 2 例；M0 5 例。按照甲狀腺 CASTLE 的統一標準進行診斷及治療[1-2]。采用手術及術后外放射治療，放療劑量（54～60）Gy/（27～30）d。隨訪 3～47 個月（平均 25.6 個月）無復發及轉移。5 例甲狀腺 CASTLE 患者的基本資料見表 1。另外，選擇同期治療的甲狀腺低分化癌 8 例及甲狀腺未分化癌 6 例進行對比分析。
表1
5 例甲狀腺 CASTLE 患者的基本資料
1.2 典型病例
患者，男，58 歲，因發現甲狀腺無痛性腫塊半年收入院。查體：甲狀腺右葉可捫及直徑約 5 cm 大小的腫塊，質地硬，與周圍界線較為清楚，隨吞咽移動。實驗室檢查甲狀腺功能在正常范圍。B 超檢查顯示甲狀腺右葉不均質低回聲結節，6 cm×4 cm 大，右側頸部中央區淋巴結腫大，最大者達 1.6 cm×1.1 cm，部分淋巴結顯示淋巴門結構偏移。CT 檢查顯示甲狀腺右葉占位、6 cm×5 cm 大，部分區域與氣管粘連，氣管受壓向左偏移。ECT 掃描腫塊為“冷結節”。手術中探查見：甲狀腺右葉腫塊直徑為 6 cm，質硬，占據甲狀腺整個右葉，部分區域與頸前肌群及氣管粘連，與食管及喉返神經無明顯粘連；右側氣管食管溝觸及腫大淋巴結數枚。探查完成后切除甲狀腺右葉腫塊并送快速冰凍病理學檢查，報告為“惡性腫瘤，多考慮分化較低的甲狀腺癌”，遂施行全甲狀腺切除并清掃右側頸淋巴結。術后病理學檢查報告：甲狀腺右葉顯示胸腺樣分化癌，癌組織伴灶狀凝固性壞死，并廣泛浸潤周圍正常甲狀腺及甲狀腺周圍脂肪及橫紋肌組織；檢出淋巴結 31 枚，轉移 5/31，其中Ⅱ區淋巴結轉移 0/5、Ⅲ區淋巴結轉移 1/7、Ⅳ區淋巴結轉移 1/6、Ⅴ區淋巴結轉移 0/4 及Ⅵ區淋巴結轉移 3/9。手術后給予左甲狀腺素鈉替代治療，術后 2 周開始外放射治療，在 4 周內采用三維適形調強放療技術，6MV 高能 X 線行放射治療。高危區（CTV1）包括甲狀腺及頸淋巴結Ⅵ區，放療劑量為 58 Gy，2.0 Gy/次，5 次/周；選擇治療區（CTV2）包括Ⅱ～Ⅴ區淋巴結及上縱隔淋巴引流區，放療劑量為：50 Gy，1.8 Gy/次，5 次/周。術后隨訪 47 個月，未發現腫瘤復發及轉移。
1.3 免疫組化染色
所有樣本由專人復查常規 HE 切片，甲狀腺 CASTLE 常規 HE 染色切片顯示腫瘤無包膜，腫瘤部分呈浸潤性生長，呈實性島狀、巢狀、分葉狀或片狀分布，被纖維組織分隔包繞，間質和腫瘤細胞間可見淋巴細胞和漿細胞浸潤。腫瘤細胞呈梭形鱗片樣、紡錘形或合體群，細胞質淡染或呈嗜酸性。細胞境界清楚，核卵圓形、呈空泡狀，有清楚的小核仁，核異型性較輕，可見核分裂；部分區域腫瘤細胞有向鱗狀細胞分化的現象。3 種腫瘤組織的病理改變見圖 1。經復查HE染色切片驗證并確定診斷后進行免疫組化染色檢測，檢測結果由兩位病理科醫師共同判斷。采用 S-P 法進行免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色。第一抗體：CD5、CD117、P63、細胞角蛋白 5/6（CK5/6）、甲狀腺轉錄因子-1（TTF-1）、癌胚抗原（CEA）、甲狀腺球蛋白（Tg）、降鈣素（CT）、Ki-67 及嗜鉻粒蛋白 A（CgA）鼠抗人單克隆抗體均由福州邁新生物技術開發有限公司提供。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、鈉/碘轉運蛋白（NIS）和促甲狀腺素受體（TSHR）兔抗人多克隆抗體以及 S-P 試劑盒均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。分別用已知表達陽性的切片作陽性對照，PBS 代替一抗作陰性對照。陽性染色定位主要在細胞膜和細胞質，個別定位于細胞核，呈棕黃色或棕褐色為陽性表達，陰性細胞不著色。結果判定采用 I×E 乘積法進行半定量評估[3]。
圖1
示 3 種腫瘤組織的病理改變。 a：甲狀腺 CASTLE（HE ×100）；b：甲狀腺低分化癌（HE ×100）；c：甲狀腺未分化癌（HE ×200）
1.4 BRAF 和 TERT 基因突變檢測
1.4.1 基因組 DNA 提取 取 10% 甲醛固定包埋的蠟塊標本，常規制片 5 張，切片厚 5～10 μm，同時完成 1 張常規 HE 染色切片，由病理科醫生鑒定和評估腫瘤細胞的含量。基因組 DNA 提取采用 FFPE DNA Kit 試劑盒（Omega 公司），實驗流程按照試劑盒說明書逐步進行，提取產物用 NanoDrop 2000 分光光度計（美國 Thermo 公司）測定 DNA 純度和濃度，并用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 完整性，將總 DNA 樣品保存于 –20℃ 冰箱。
1.4.2 PCR 及 DNA 測序法檢測基因突變 根據 NCBI-GeneBank 中公布的 BRAF 和 TERT 基因全序列，確定擴增目的基因片段，應用 Primer 5.0 和 Oligo 6 軟件，根據引物設計原則設計引物。KRAS 基因的 PCR 上游引物為 5′-ACATTTCAAGCCCC-AAAAATCTT-3′，下游引物為 5′-CATCTCAGGGCC-AAAAATTTAATC-3′；TERT 基因的 PCR 上游引物為 5′-ACCCGTCCTGCCCCTTCA-3′，下游引物為 5′-GGCAGCACCTCGCGGTAGT-3′。采用 Taq Master Mix（Omega 公司）試劑，在 50 μL PCR 反應液中含有 100 ng 基因組 DNA，上下游引物各 1 μL。BRAF 基因的 PCR 產物長度是 395 bp，TERT 基因的 PCR 產物長度是 281 bp。PCR 反應條件：95℃ 預變性 5 min，95℃ 變性 30 s，53℃（BRAF）或 60℃（TERT）退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，共 35 個循環；72℃ 延伸 10 min，至 4℃ 結束。取 2 μL PCR 擴增產物上樣 2% 瓊脂糖凝膠電泳分離，EB 染色檢測 PCR 擴增質量。最后將 PCR 擴增產物進行 DNA 測序，并將測序結果分別與 BRAF 和 TERT 基因序列進行比對，以確定有無突變。
2 結果
2.1 免疫組化染色結果
甲狀腺 CASTLE 腫瘤細胞的 CD5、CD117、CK5/6 及 P63 均呈陽性表達（圖 2a～2d）；甲狀腺低分化癌 CD5 及 CD117 均呈陰性表達（圖 2e～2f），CK5/6 陽性表達 6 例（6/8）、P63 陽性表達 5 例（5/8）；甲狀腺未分化癌 CD5 及 CD117 均呈陰性表達（圖 2g～2h）、CK5/6 陽性表達 3 例（3/6）、P63 陽性表達 4 例（4/6）。甲狀腺 CASTLE 全部病例 TTF-1、CT、CgA、Tg、PPAR-γ、NIS及TSHR 均呈陰性表達（圖 2i～2p）；甲狀腺低分化癌 Tg 均呈陽性表達，TTF-1 陽性表達 6 例（6/8）、CgA 陽性 表達2 例（2/8）、NIS 及 TSHR 陽性表達分別為 4 例（4/8）及 5 例（5/8）；甲狀腺未分化癌 TTF-1 陽性表達 5 例（5/6）、CgA 陽性表達 1 例（1/6）、Tg 陽性表達 3 例（3/6）、NIS 及 TSHR 陽性表達分別為 1 例（1/6）及 2 例（2/6）。具體見表 2～表 4。
圖2
示 3 種腫瘤組織中各指標免疫組化染色結果。 a：甲狀腺 CASTLE 的 CD5 表達陽性（SP ×200）；b：甲狀腺 CASTLE 的 CD117 表達陽性（SP ×200）；c：甲狀腺 CASTLE 的 CK5/6 表達陽性（SP ×200）；d：甲狀腺 CASTLE 的 P63 表達陽性（SP ×200）；e：甲狀腺低分化癌的 CD5 表達陰性（SP ×200）；f：甲狀腺低分化癌的 CD117 表達陰性（SP ×200）；g：甲狀腺未分化癌的 CD5 表達陰性（SP ×400）；h：甲狀腺未分化癌的 CD117 表達陰性（SP ×200）；i：甲狀腺 CASTLE 的 TTF1 表達陰性（SP ×200）；j：甲狀腺 CASTLE 的 CT 表達陰性（SP ×200）；k：CASTLE 的 CgA 表達陰性（SP ×400）；l：甲狀腺 CASTLE 的 Tg 表達陰性（SP ×200）；m：甲狀腺 CASTLE 的 PPAR-γ 表達陰性（SP ×200）；n：甲狀腺 CASTLE 的 NIS 表達陰性（SP ×400）；p：甲狀腺 CASTLE 的 TSHR 表達陰性（SP ×100）
表2
5 例甲狀腺 CASTLE 患者腫瘤組織免疫組化染色結果
表3
8 例甲狀腺低分化癌患者腫瘤組織免疫組化染色結果
表4
6 例甲狀腺未分化癌患者腫瘤組織免疫組化染色結果
2.2 BRAF 和 TERT 基因突變檢測結果
5 例甲狀腺 CASTLE 患者中未發現 BRAFV600E 及 TERT 基因突變。8 例甲狀腺低分化癌及 6 例甲狀腺未分化癌中均未發現 BRAFV600E 基因突變；TERT 啟動子存在突變者 6 例，其中甲狀腺低分化癌 4 例（4/8）和甲狀腺未分化癌 2 例（2/6）。
TERT 啟動子突變共有兩種互斥突變類型，即 C228T 和 C250T，上述攜帶 TERT 啟動子突變的 6 例患者中 C228T 位點 4 例（甲狀腺低分化癌 3 例、未分化癌 1 例），C250T 位點 2 例（甲狀腺低分化癌和未分化癌各 1 例）。見圖 3～圖 5。
圖3
示 BRAFV600E 基因突變測序圖。 G-1A：野生型；G-1B：突變型
圖4
示 TERT 啟動子 C228T 突變測序圖。 G-2A：野生型；G-2B：突變型
圖5
示 TERT 啟動子 C250T 突變測序圖。 G-3A：野生型；G-3B：突變型
3 討論
3.1 甲狀腺 CASTLE 的組織來源
甲狀腺 CASTLE 屬于臨床比較少見的甲狀腺惡性腫瘤，1985 年由 Miyauchi 等[4]首次報道。該病基本沒有明顯的性別差異，以甲狀腺周圍組織侵犯為突出表現，同時常伴有區域淋巴結轉移，個別可發生遠處轉移[5]。甲狀腺 CASTLE 組織結構與胸腺上皮性腫瘤類似，組織學形態上容易誤診為甲狀腺低分化癌、未分化癌、淋巴上皮癌、髓樣癌等。目前該腫瘤的來源還不太明確，有人認為甲狀腺 CASTLE 的發生是局部甲狀腺組織化生或甲狀腺腫瘤細胞呈胸腺上皮分化的結果[6-7]，多數認為甲狀腺 CASTLE 來自異位胸腺或鰓體的殘留組織[8-9]。有研究[9-10]表明，甲狀腺 CASTLE 組織中 CD5 及 CD117 陽性表達與胸腺癌免疫組織化學染色結果相同，PPAR-γ 與甲狀腺癌的發生發展密切相關。甲狀腺組織來源的腫瘤，不同程度的具有甲狀腺組織特殊的原始功能表象，例如聚碘功能、分泌 Tg、受促甲狀腺素（TSH）抑制等。本組 5 例甲狀腺 CASTLE 患者的免疫組化染色結果顯示，腫瘤細胞 CD5 及 CD117 全部呈陽性表達，Tg、CT、TTF-1、PPAR-γ、NIS 及 TSHR 均呈陰性表達，不支持甲狀腺組織起源，提示甲狀腺 CASTLE 可能與胸腺上皮起源密切相關。另一方面，本組 5 例甲狀腺 CASTLE 患者的基因檢測未發現 BRAFV600E 基因及 TERT 啟動子存在突變，而存在 TERT 啟動子突變的甲狀腺低分化癌有 4 例（4/8）、甲狀腺未分化癌有 2 例（2/6）。目前認為[11-13]，BRAFV600E 突變是甲狀腺癌中最常見的一種基因突變，以甲狀腺乳頭狀癌多見并與其預后相關，TERT 啟動子突變與甲狀腺癌的惡性程度密切相關，在甲狀腺癌的細胞系中 TERT 啟動子突變發生率為 91.7%。因此筆者認為，本組 5 例甲狀腺 CASTLE 的組織學發生可能與甲狀腺無關。
3.2 甲狀腺 CASTLE 的診斷與鑒別診斷
目前認為[14]，甲狀腺 CASTLE 是一種低度惡性并具有相對惰性生物學行為的腫瘤，臨床常以頸部無痛性包塊就診，個別可伴有氣管壓迫和聲音嘶啞改變。彩色多普勒超聲檢查和其他侵襲性惡性甲狀腺腫瘤表現相似，ECT 掃描表現為“冷結節”。細針穿刺細胞學檢查（FNAC）對甲狀腺 CASTLE 的診斷具有局限性，只能提出鑒別診斷的建議[15-16]。甲狀腺 CASTLE 有其組織形態學特點，依靠 HE 切片中腫瘤組織獨特的形態學改變，初步可以與甲狀腺低分化癌及未分化癌進行鑒別而確立診斷。但是也有人[6, 17]認為，甲狀腺 CASTLE 的診斷必須依靠免疫組化染色，CD5 和 CD117 的雙陽性表達可作為診斷甲狀腺 CASTLE 的特異性免疫標記。本組 5 例甲狀腺 CASTLE 患者的免疫組化染色結果 CD5、CD117 及 P63 均呈陽性表達，而甲狀腺低分化癌及未分化癌中 CD5 及 CD117 均呈陰性表達、P63 部分病例呈陽性表達，提示 CD5 和 CD117 表達對診斷甲狀腺 CASTLE 具有特殊的臨床價值。甲狀腺 CASTLE 鑒別診斷的關鍵是要與那些生長迅速、侵襲性高且預后差、同時與甲狀腺 CASTLE 有十分相似組織學表象的甲狀腺惡性腫瘤進行鑒別，例如甲狀腺低分化癌、未分化癌等。甲狀腺低分化癌其組織學形態多樣，但尚殘留甲狀腺組織的某些功能，本組 8 例中全部表達 Tg，TTF-1 表達 6 例（6/8）、NIS 表達 4 例（4/8）、TSHR 表達 5 例（5/8）。甲狀腺未分化癌屬高度惡性腫瘤，發展迅速且侵襲性強，本組 6 例全部表達 Ki-67，少部分表達 CEA、Tg、NIS 及 TSHR。筆者認為，聯合檢測腫瘤組織中 CD5、CD117、P63、Tg、TTF-1、NIS 及 TSHR 的表達，對甲狀腺 CASTLE 的診斷及鑒別診斷具有重要的臨床意義，檢測 BRAFV600E 基因及 TERT 啟動子突變，對甲狀腺 CASTLE 的診斷與鑒別診斷雖有一定意義，但其價值尚需進一步研究。另一方面，甲狀腺 CASTLE 組織結構與胸腺上皮性腫瘤類似，CD5 及 CD117 陽性表達與胸腺癌免疫組化染色相同，因此，甲狀腺 CASTLE 與胸腺癌的鑒別也應重視。筆者認為這主要由腫瘤的原發部位決定，也就是說診斷甲狀腺 CASTLE 的前提應該首先是排除胸腺腫瘤的存在。目前尚未見到甲狀腺 CASTLE 與胸腺癌同時存在的病例報道。
3.3 甲狀腺 CASTLE 的治療
目前關于甲狀腺 CASTLE 的治療尚沒有標準的方案。甲狀腺 CASTLE 周圍組織侵犯及淋巴結轉移高于分化型甲狀腺癌，也是影響預后的主要因素[17]。多數認為[18-19]，外科手術根治性切除是最適宜的治療方法，手術方式以全甲狀腺切除加頸淋巴清掃為主，同時切除甲狀腺周圍被腫瘤侵犯的組織。關于甲狀腺 CASTLE 手術后的放射治療，有人[20-21]認為手術后放射治療對減少復發及提高生存率有重要作用，應做為甲狀腺 CASTLE 的常規治療手段。本組病例中有 1 例腫瘤侵出甲狀腺外并累及氣管和食管，同時侵犯頸內靜脈，完整切除腫瘤后行放療，60 Gy/30 d，隨訪 39 個月未見復發。對于化療的作用尚存在爭議，沒有足夠的證據說明化療對甲狀腺 CASTLE 的效果。有文獻[22-23]報道，甲狀腺 CASTLE 肺轉移者使用以卡鉑和紫杉醇為主的化療方案，對緩解癥狀有一定效果。由于甲狀腺 CASTLE 來自甲狀腺外組織且不表達 TSHR，其生長、增殖不依賴于 TSH 的作用，所以從理論上來說 TSH 抑制治療無效，僅需給予甲狀腺素替代治療。本組 5 例患者術后均加行放射治療〔（54～60）Gy/（27～30）d〕，未做化療，術后給予甲狀腺素替代治療，無復發病例。對于甲狀腺 CASTLE 預后的報道較少，有文獻[24]報道伴淋巴結轉移的甲狀腺 CASTLE 患者其 5 年和 10 年生存率分別為 76% 和 57%，而伴有周圍組織侵犯者 5 年和 10 年生存率分別為 92% 和 79%。因此，對淋巴結轉移和周圍組織侵犯者，應予足夠的重視。
甲狀腺胸腺樣分化癌（carcinoma showing thymus-like differentiation，CASTLE）在 WHO（2004 版）內分泌腫瘤分類[1]中作了明確定義，即甲狀腺癌伴類似于胸腺上皮腫瘤的結構。甲狀腺 CASTLE 是一種發生于甲狀腺少見的惡性腫瘤，具有特定的組織學改變和免疫表型，腫瘤中異型上皮成分有其特殊的免疫組化特征，形態及結構上與發生于胸腺的上皮性腫瘤及轉移性低分化癌類似，又稱甲狀腺內上皮樣胸腺瘤、原發性甲狀腺胸腺瘤或甲狀腺淋巴上皮癌等，臨床癥狀有時起病較重，但預后較好[1]。筆者自 2011 年 8 月以來收治了 5 例，現結合文獻對該類腫瘤的組織起源、病理學特點、免疫學表型及臨床診治情況進行分析。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本組甲狀腺 CASTLE 患者 5 例，男 3 例，女 2 例；年齡 47～66 歲，中位年齡 56 歲。TNM分期：T2 期 1 例、T3 期 2 例、T4a 期 2 例；N0 1 例、N1a 2 例、N1b 2 例；M0 5 例。按照甲狀腺 CASTLE 的統一標準進行診斷及治療[1-2]。采用手術及術后外放射治療，放療劑量（54～60）Gy/（27～30）d。隨訪 3～47 個月（平均 25.6 個月）無復發及轉移。5 例甲狀腺 CASTLE 患者的基本資料見表 1。另外，選擇同期治療的甲狀腺低分化癌 8 例及甲狀腺未分化癌 6 例進行對比分析。
表1
5 例甲狀腺 CASTLE 患者的基本資料
1.2 典型病例
患者，男，58 歲，因發現甲狀腺無痛性腫塊半年收入院。查體：甲狀腺右葉可捫及直徑約 5 cm 大小的腫塊，質地硬，與周圍界線較為清楚，隨吞咽移動。實驗室檢查甲狀腺功能在正常范圍。B 超檢查顯示甲狀腺右葉不均質低回聲結節，6 cm×4 cm 大，右側頸部中央區淋巴結腫大，最大者達 1.6 cm×1.1 cm，部分淋巴結顯示淋巴門結構偏移。CT 檢查顯示甲狀腺右葉占位、6 cm×5 cm 大，部分區域與氣管粘連，氣管受壓向左偏移。ECT 掃描腫塊為“冷結節”。手術中探查見：甲狀腺右葉腫塊直徑為 6 cm，質硬，占據甲狀腺整個右葉，部分區域與頸前肌群及氣管粘連，與食管及喉返神經無明顯粘連；右側氣管食管溝觸及腫大淋巴結數枚。探查完成后切除甲狀腺右葉腫塊并送快速冰凍病理學檢查，報告為“惡性腫瘤，多考慮分化較低的甲狀腺癌”，遂施行全甲狀腺切除并清掃右側頸淋巴結。術后病理學檢查報告：甲狀腺右葉顯示胸腺樣分化癌，癌組織伴灶狀凝固性壞死，并廣泛浸潤周圍正常甲狀腺及甲狀腺周圍脂肪及橫紋肌組織；檢出淋巴結 31 枚，轉移 5/31，其中Ⅱ區淋巴結轉移 0/5、Ⅲ區淋巴結轉移 1/7、Ⅳ區淋巴結轉移 1/6、Ⅴ區淋巴結轉移 0/4 及Ⅵ區淋巴結轉移 3/9。手術后給予左甲狀腺素鈉替代治療，術后 2 周開始外放射治療，在 4 周內采用三維適形調強放療技術，6MV 高能 X 線行放射治療。高危區（CTV1）包括甲狀腺及頸淋巴結Ⅵ區，放療劑量為 58 Gy，2.0 Gy/次，5 次/周；選擇治療區（CTV2）包括Ⅱ～Ⅴ區淋巴結及上縱隔淋巴引流區，放療劑量為：50 Gy，1.8 Gy/次，5 次/周。術后隨訪 47 個月，未發現腫瘤復發及轉移。
1.3 免疫組化染色
所有樣本由專人復查常規 HE 切片，甲狀腺 CASTLE 常規 HE 染色切片顯示腫瘤無包膜，腫瘤部分呈浸潤性生長，呈實性島狀、巢狀、分葉狀或片狀分布，被纖維組織分隔包繞，間質和腫瘤細胞間可見淋巴細胞和漿細胞浸潤。腫瘤細胞呈梭形鱗片樣、紡錘形或合體群，細胞質淡染或呈嗜酸性。細胞境界清楚，核卵圓形、呈空泡狀，有清楚的小核仁，核異型性較輕，可見核分裂；部分區域腫瘤細胞有向鱗狀細胞分化的現象。3 種腫瘤組織的病理改變見圖 1。經復查HE染色切片驗證并確定診斷后進行免疫組化染色檢測，檢測結果由兩位病理科醫師共同判斷。采用 S-P 法進行免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色。第一抗體：CD5、CD117、P63、細胞角蛋白 5/6（CK5/6）、甲狀腺轉錄因子-1（TTF-1）、癌胚抗原（CEA）、甲狀腺球蛋白（Tg）、降鈣素（CT）、Ki-67 及嗜鉻粒蛋白 A（CgA）鼠抗人單克隆抗體均由福州邁新生物技術開發有限公司提供。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、鈉/碘轉運蛋白（NIS）和促甲狀腺素受體（TSHR）兔抗人多克隆抗體以及 S-P 試劑盒均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。分別用已知表達陽性的切片作陽性對照，PBS 代替一抗作陰性對照。陽性染色定位主要在細胞膜和細胞質，個別定位于細胞核，呈棕黃色或棕褐色為陽性表達，陰性細胞不著色。結果判定采用 I×E 乘積法進行半定量評估[3]。
圖1
示 3 種腫瘤組織的病理改變。 a：甲狀腺 CASTLE（HE ×100）；b：甲狀腺低分化癌（HE ×100）；c：甲狀腺未分化癌（HE ×200）
1.4 BRAF 和 TERT 基因突變檢測
1.4.1 基因組 DNA 提取 取 10% 甲醛固定包埋的蠟塊標本，常規制片 5 張，切片厚 5～10 μm，同時完成 1 張常規 HE 染色切片，由病理科醫生鑒定和評估腫瘤細胞的含量。基因組 DNA 提取采用 FFPE DNA Kit 試劑盒（Omega 公司），實驗流程按照試劑盒說明書逐步進行，提取產物用 NanoDrop 2000 分光光度計（美國 Thermo 公司）測定 DNA 純度和濃度，并用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 完整性，將總 DNA 樣品保存于 –20℃ 冰箱。
1.4.2 PCR 及 DNA 測序法檢測基因突變 根據 NCBI-GeneBank 中公布的 BRAF 和 TERT 基因全序列，確定擴增目的基因片段，應用 Primer 5.0 和 Oligo 6 軟件，根據引物設計原則設計引物。KRAS 基因的 PCR 上游引物為 5′-ACATTTCAAGCCCC-AAAAATCTT-3′，下游引物為 5′-CATCTCAGGGCC-AAAAATTTAATC-3′；TERT 基因的 PCR 上游引物為 5′-ACCCGTCCTGCCCCTTCA-3′，下游引物為 5′-GGCAGCACCTCGCGGTAGT-3′。采用 Taq Master Mix（Omega 公司）試劑，在 50 μL PCR 反應液中含有 100 ng 基因組 DNA，上下游引物各 1 μL。BRAF 基因的 PCR 產物長度是 395 bp，TERT 基因的 PCR 產物長度是 281 bp。PCR 反應條件：95℃ 預變性 5 min，95℃ 變性 30 s，53℃（BRAF）或 60℃（TERT）退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，共 35 個循環；72℃ 延伸 10 min，至 4℃ 結束。取 2 μL PCR 擴增產物上樣 2% 瓊脂糖凝膠電泳分離，EB 染色檢測 PCR 擴增質量。最后將 PCR 擴增產物進行 DNA 測序，并將測序結果分別與 BRAF 和 TERT 基因序列進行比對，以確定有無突變。
2 結果
2.1 免疫組化染色結果
甲狀腺 CASTLE 腫瘤細胞的 CD5、CD117、CK5/6 及 P63 均呈陽性表達（圖 2a～2d）；甲狀腺低分化癌 CD5 及 CD117 均呈陰性表達（圖 2e～2f），CK5/6 陽性表達 6 例（6/8）、P63 陽性表達 5 例（5/8）；甲狀腺未分化癌 CD5 及 CD117 均呈陰性表達（圖 2g～2h）、CK5/6 陽性表達 3 例（3/6）、P63 陽性表達 4 例（4/6）。甲狀腺 CASTLE 全部病例 TTF-1、CT、CgA、Tg、PPAR-γ、NIS及TSHR 均呈陰性表達（圖 2i～2p）；甲狀腺低分化癌 Tg 均呈陽性表達，TTF-1 陽性表達 6 例（6/8）、CgA 陽性 表達2 例（2/8）、NIS 及 TSHR 陽性表達分別為 4 例（4/8）及 5 例（5/8）；甲狀腺未分化癌 TTF-1 陽性表達 5 例（5/6）、CgA 陽性表達 1 例（1/6）、Tg 陽性表達 3 例（3/6）、NIS 及 TSHR 陽性表達分別為 1 例（1/6）及 2 例（2/6）。具體見表 2～表 4。
圖2
示 3 種腫瘤組織中各指標免疫組化染色結果。 a：甲狀腺 CASTLE 的 CD5 表達陽性（SP ×200）；b：甲狀腺 CASTLE 的 CD117 表達陽性（SP ×200）；c：甲狀腺 CASTLE 的 CK5/6 表達陽性（SP ×200）；d：甲狀腺 CASTLE 的 P63 表達陽性（SP ×200）；e：甲狀腺低分化癌的 CD5 表達陰性（SP ×200）；f：甲狀腺低分化癌的 CD117 表達陰性（SP ×200）；g：甲狀腺未分化癌的 CD5 表達陰性（SP ×400）；h：甲狀腺未分化癌的 CD117 表達陰性（SP ×200）；i：甲狀腺 CASTLE 的 TTF1 表達陰性（SP ×200）；j：甲狀腺 CASTLE 的 CT 表達陰性（SP ×200）；k：CASTLE 的 CgA 表達陰性（SP ×400）；l：甲狀腺 CASTLE 的 Tg 表達陰性（SP ×200）；m：甲狀腺 CASTLE 的 PPAR-γ 表達陰性（SP ×200）；n：甲狀腺 CASTLE 的 NIS 表達陰性（SP ×400）；p：甲狀腺 CASTLE 的 TSHR 表達陰性（SP ×100）
表2
5 例甲狀腺 CASTLE 患者腫瘤組織免疫組化染色結果
表3
8 例甲狀腺低分化癌患者腫瘤組織免疫組化染色結果
表4
6 例甲狀腺未分化癌患者腫瘤組織免疫組化染色結果
2.2 BRAF 和 TERT 基因突變檢測結果
5 例甲狀腺 CASTLE 患者中未發現 BRAFV600E 及 TERT 基因突變。8 例甲狀腺低分化癌及 6 例甲狀腺未分化癌中均未發現 BRAFV600E 基因突變；TERT 啟動子存在突變者 6 例，其中甲狀腺低分化癌 4 例（4/8）和甲狀腺未分化癌 2 例（2/6）。
TERT 啟動子突變共有兩種互斥突變類型，即 C228T 和 C250T，上述攜帶 TERT 啟動子突變的 6 例患者中 C228T 位點 4 例（甲狀腺低分化癌 3 例、未分化癌 1 例），C250T 位點 2 例（甲狀腺低分化癌和未分化癌各 1 例）。見圖 3～圖 5。
圖3
示 BRAFV600E 基因突變測序圖。 G-1A：野生型；G-1B：突變型
圖4
示 TERT 啟動子 C228T 突變測序圖。 G-2A：野生型；G-2B：突變型
圖5
示 TERT 啟動子 C250T 突變測序圖。 G-3A：野生型；G-3B：突變型
3 討論
3.1 甲狀腺 CASTLE 的組織來源
甲狀腺 CASTLE 屬于臨床比較少見的甲狀腺惡性腫瘤，1985 年由 Miyauchi 等[4]首次報道。該病基本沒有明顯的性別差異，以甲狀腺周圍組織侵犯為突出表現，同時常伴有區域淋巴結轉移，個別可發生遠處轉移[5]。甲狀腺 CASTLE 組織結構與胸腺上皮性腫瘤類似，組織學形態上容易誤診為甲狀腺低分化癌、未分化癌、淋巴上皮癌、髓樣癌等。目前該腫瘤的來源還不太明確，有人認為甲狀腺 CASTLE 的發生是局部甲狀腺組織化生或甲狀腺腫瘤細胞呈胸腺上皮分化的結果[6-7]，多數認為甲狀腺 CASTLE 來自異位胸腺或鰓體的殘留組織[8-9]。有研究[9-10]表明，甲狀腺 CASTLE 組織中 CD5 及 CD117 陽性表達與胸腺癌免疫組織化學染色結果相同，PPAR-γ 與甲狀腺癌的發生發展密切相關。甲狀腺組織來源的腫瘤，不同程度的具有甲狀腺組織特殊的原始功能表象，例如聚碘功能、分泌 Tg、受促甲狀腺素（TSH）抑制等。本組 5 例甲狀腺 CASTLE 患者的免疫組化染色結果顯示，腫瘤細胞 CD5 及 CD117 全部呈陽性表達，Tg、CT、TTF-1、PPAR-γ、NIS 及 TSHR 均呈陰性表達，不支持甲狀腺組織起源，提示甲狀腺 CASTLE 可能與胸腺上皮起源密切相關。另一方面，本組 5 例甲狀腺 CASTLE 患者的基因檢測未發現 BRAFV600E 基因及 TERT 啟動子存在突變，而存在 TERT 啟動子突變的甲狀腺低分化癌有 4 例（4/8）、甲狀腺未分化癌有 2 例（2/6）。目前認為[11-13]，BRAFV600E 突變是甲狀腺癌中最常見的一種基因突變，以甲狀腺乳頭狀癌多見并與其預后相關，TERT 啟動子突變與甲狀腺癌的惡性程度密切相關，在甲狀腺癌的細胞系中 TERT 啟動子突變發生率為 91.7%。因此筆者認為，本組 5 例甲狀腺 CASTLE 的組織學發生可能與甲狀腺無關。
3.2 甲狀腺 CASTLE 的診斷與鑒別診斷
目前認為[14]，甲狀腺 CASTLE 是一種低度惡性并具有相對惰性生物學行為的腫瘤，臨床常以頸部無痛性包塊就診，個別可伴有氣管壓迫和聲音嘶啞改變。彩色多普勒超聲檢查和其他侵襲性惡性甲狀腺腫瘤表現相似，ECT 掃描表現為“冷結節”。細針穿刺細胞學檢查（FNAC）對甲狀腺 CASTLE 的診斷具有局限性，只能提出鑒別診斷的建議[15-16]。甲狀腺 CASTLE 有其組織形態學特點，依靠 HE 切片中腫瘤組織獨特的形態學改變，初步可以與甲狀腺低分化癌及未分化癌進行鑒別而確立診斷。但是也有人[6, 17]認為，甲狀腺 CASTLE 的診斷必須依靠免疫組化染色，CD5 和 CD117 的雙陽性表達可作為診斷甲狀腺 CASTLE 的特異性免疫標記。本組 5 例甲狀腺 CASTLE 患者的免疫組化染色結果 CD5、CD117 及 P63 均呈陽性表達，而甲狀腺低分化癌及未分化癌中 CD5 及 CD117 均呈陰性表達、P63 部分病例呈陽性表達，提示 CD5 和 CD117 表達對診斷甲狀腺 CASTLE 具有特殊的臨床價值。甲狀腺 CASTLE 鑒別診斷的關鍵是要與那些生長迅速、侵襲性高且預后差、同時與甲狀腺 CASTLE 有十分相似組織學表象的甲狀腺惡性腫瘤進行鑒別，例如甲狀腺低分化癌、未分化癌等。甲狀腺低分化癌其組織學形態多樣，但尚殘留甲狀腺組織的某些功能，本組 8 例中全部表達 Tg，TTF-1 表達 6 例（6/8）、NIS 表達 4 例（4/8）、TSHR 表達 5 例（5/8）。甲狀腺未分化癌屬高度惡性腫瘤，發展迅速且侵襲性強，本組 6 例全部表達 Ki-67，少部分表達 CEA、Tg、NIS 及 TSHR。筆者認為，聯合檢測腫瘤組織中 CD5、CD117、P63、Tg、TTF-1、NIS 及 TSHR 的表達，對甲狀腺 CASTLE 的診斷及鑒別診斷具有重要的臨床意義，檢測 BRAFV600E 基因及 TERT 啟動子突變，對甲狀腺 CASTLE 的診斷與鑒別診斷雖有一定意義，但其價值尚需進一步研究。另一方面，甲狀腺 CASTLE 組織結構與胸腺上皮性腫瘤類似，CD5 及 CD117 陽性表達與胸腺癌免疫組化染色相同，因此，甲狀腺 CASTLE 與胸腺癌的鑒別也應重視。筆者認為這主要由腫瘤的原發部位決定，也就是說診斷甲狀腺 CASTLE 的前提應該首先是排除胸腺腫瘤的存在。目前尚未見到甲狀腺 CASTLE 與胸腺癌同時存在的病例報道。
3.3 甲狀腺 CASTLE 的治療
目前關于甲狀腺 CASTLE 的治療尚沒有標準的方案。甲狀腺 CASTLE 周圍組織侵犯及淋巴結轉移高于分化型甲狀腺癌，也是影響預后的主要因素[17]。多數認為[18-19]，外科手術根治性切除是最適宜的治療方法，手術方式以全甲狀腺切除加頸淋巴清掃為主，同時切除甲狀腺周圍被腫瘤侵犯的組織。關于甲狀腺 CASTLE 手術后的放射治療，有人[20-21]認為手術后放射治療對減少復發及提高生存率有重要作用，應做為甲狀腺 CASTLE 的常規治療手段。本組病例中有 1 例腫瘤侵出甲狀腺外并累及氣管和食管，同時侵犯頸內靜脈，完整切除腫瘤后行放療，60 Gy/30 d，隨訪 39 個月未見復發。對于化療的作用尚存在爭議，沒有足夠的證據說明化療對甲狀腺 CASTLE 的效果。有文獻[22-23]報道，甲狀腺 CASTLE 肺轉移者使用以卡鉑和紫杉醇為主的化療方案，對緩解癥狀有一定效果。由于甲狀腺 CASTLE 來自甲狀腺外組織且不表達 TSHR，其生長、增殖不依賴于 TSH 的作用，所以從理論上來說 TSH 抑制治療無效，僅需給予甲狀腺素替代治療。本組 5 例患者術后均加行放射治療〔（54～60）Gy/（27～30）d〕，未做化療，術后給予甲狀腺素替代治療，無復發病例。對于甲狀腺 CASTLE 預后的報道較少，有文獻[24]報道伴淋巴結轉移的甲狀腺 CASTLE 患者其 5 年和 10 年生存率分別為 76% 和 57%，而伴有周圍組織侵犯者 5 年和 10 年生存率分別為 92% 和 79%。因此，對淋巴結轉移和周圍組織侵犯者，應予足夠的重視。
