引用本文： 陳克霏, 劉俊, 李波. 免疫磁珠及無血清懸浮培養法對肝癌干細胞的分離與富集. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(8): 946-952. doi: 10.7507/1007-9424.201611088 復制
腫瘤的復發和放化療抵抗是導致腫瘤治療失敗的主要原因之一，近年來研究[1-2]表明，腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC）與腫瘤的發生、復發、耐藥和放化療抵抗均密切相關，CSC 理論及相關知識備受人們關注。CSC 可能源于正常干細胞，是正常干細胞在長期自我更新過程中，受微環境、致癌劑和遺傳因素相互作用，引起生長和分化調控途徑中某些分子發生遺傳或表觀遺傳學改變，進而發生基因表達異常或細胞表型改變所致[1, 3]。盡管 40 年前 CSC 的理論就已經被提出，然而直到近 10 年來，包括肝、肺、腦等實體 CSC 相關研究才進入新的階段[2-5]。肝癌作為一種常見的腫瘤，是否存在 CSC？這一直是近年來人肝癌研究領域的重點。2005 年日本學者 Koh 等[3]研究了 Huh7、PLC/PRF/5、HepG2 和 Huh6 四種肝癌細胞系，結果在 Huh7 和 PLC/PRF/5 細胞系中找到了 SP 細胞（side population cells），認為其可能是肝癌干細胞。最近一些研究[6-8]表明，人肝癌起源于肝臟祖細胞（hepatic progenitor cells，HPCs），且人 HPCs 的激活主要出現在與肝癌發生密切相關的疾病如慢性病毒性肝炎和乙醇性肝炎中，而且部分肝癌細胞表達 1 種或幾種 HPCs 的標志物。近來的研究[9]發現了人肝癌干細胞標志物。有學者[10-11]采用 CD90（Thy-1）來鑒定人 CSC，通過研究肝癌組織及肝癌患者血液中的 CSC 后發現：在不同肝癌細胞系中 CD90+ 細胞數目與致瘤能力成正相關，且在人肝癌組織中分選的 CD45–CD90+ 細胞比 CD45–CD90– 細胞具有更強的腫瘤形成能力，證實了在人肝癌組織及肝癌患者血液中存在肝癌干細胞，認為 CD90 是一種較理想的肝癌干細胞候選標志物。因此本實驗采用 CD90 作為肝癌干細胞標志物，對肝癌細胞進行分離與鑒定。
1 材料及方法
1.1 主要材料、試劑和設備
1.1.1 細胞株及組織 Huh-7 及 MHCC97-H 細胞株購于上海中科院上海細胞庫；SMMC-7721 和 Bel7402 細胞株由四川大學生物化學實驗室提供。正常肝組織（8 例）、肝癌組織及其癌旁組織（58 例）均源于四川大學華西醫院手術切除標本，由四川大學華西醫院病理科提供，其中癌旁組織距肝癌腫塊邊緣>3 cm。8 例正常肝組織來源患者均因外傷致肝破裂，在 2012 年 2 月至 2013 年 8 月期間于筆者所在醫院行肝部分切除術，其中男 6 例，女2 例；年齡 26～45 歲，平均年齡為 37 歲；所有患者無肝炎病史。58 例肝癌患者于 2012 年 2 月至 2013 年 8 月期間就診于筆者所在醫院，均因原發性肝細胞肝癌行肝癌切除術，其中男 39 例，女 19 例；年齡 41～68 歲，平均年齡為 53 歲；所有患者有肝炎病史。
1.1.2 實驗試劑 DMEM/F12 培養基和 PBS 緩沖液購自 Hyclone 公司；10% 胎牛血清、B27 培養基添加劑、胰島素-轉鐵蛋白（ITS-X）添加劑和 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液購自 Invitrogen Corp 公司；重組人表皮生長因子（EGF）、重組人成纖維生長因子（bFGF）和兔抗人 CD90 單克隆抗體購自 Abcam 公司；人 CD90–PE 熒光單克隆抗體購自 Miltenyi 公司；FITC 標記的羊抗兔 IgG 以及SP-9001羊抗兔 IgG 均購自北京中杉金橋公司。
1.1.3 培養基制備 含血清培養基的制備：于 90 mLDMEM/F12 培養基中加入 10 mL 胎牛血清。無血清培養基的制備：將 EGF、bFGF 及 B27 加入基礎培養基中，配成含 2% B27、20 mg/L EGF 及 20 mg/LbFGF 的無血清培養基。
1.1.4 主要設備 本實驗所需主要設備名稱、型號及生產公司見表 1。
表1
主要設備信息
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學染色法（SP 法）檢測 CD90 的表達 將正常肝組織、肝癌組織及其癌旁組織經固定、脫水、石蠟包埋后行 2 μm 厚切片，進行免疫組織化學染色（具體操作按試劑盒說明書進行）。
1.2.2 各肝癌細胞系細胞的培養、保種以及復蘇培養條件：培養基為含血清培養基，氣相為 95% 空氣+5% CO2，溫度為 37 ℃。保種時將細胞分裝至保種管，放置于超低溫冰箱（–150 ℃）中凍存。復蘇時將凍存細胞取出后置于 37℃ 水浴箱中快速融化，并轉移至離心管中，加入含 10% FBS 的 DMEM/F12 高糖培養基，離心（1 200 r/min，r=25 cm，3 min）去上清液、重懸，轉移至培養瓶中培養。
1.2.3 流式細胞儀檢測肝癌細胞系中 CD90+ 細胞比例 ① Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721 及 Bel7402 細胞經消化、離心（條件同上）、計數及清洗，分為空白對照組和實驗組（細胞數均為 5.5×105 個/管，只檢測 1 管），分別加入 200 μL PBS 液重懸。實驗組細胞中加入 5 μL CD90–PE 抗體，空白對照組加入 5 μL CD90– 無熒光抗體，常溫避光孵育15 min。清洗后加入 200 μL PBS 液重懸，上機檢測。② 采用流式細胞儀檢測經免疫磁珠分選后的細胞（CD90– 組和 CD90+ 組）、未分選的細胞（未分選空白對照組和未分選實驗組）中 CD90+ 細胞的比例。③ 經無血清和有血清懸浮培養的細胞，也采用流式細胞儀檢測 CD90+ 細胞比例。均檢測 1 次。
1.2.4 免疫磁珠分選 將流式細胞儀篩查出的細胞系進行免疫磁珠分選。① 磁珠標記：細胞經過消化、離心（條件同上）及計數后轉移至離心管中，每管含 1×107 個細胞。清洗離心（條件同上）去上清液后，每管加入 500 μL PBS 緩沖液重懸，之后每管再加入 20 μL 標記了 CD90 抗體的磁珠，混勻后放置于 4℃ 冰箱中 15 min，期間每 5 min 震蕩1 次。清洗后每管再加入 500 μL PBS 緩沖液重懸。② 磁珠分選：潤洗 MS 后加入上述細胞懸液，采用離心管收集流經 MS 后的細胞懸液 1 mL，標記為 CD90– 組。將 MS 移出磁場區域，加入 1 mL PBS 緩沖液快速沖洗至離心管中，標記為 CD90+ 組。以未分選細胞作為空白對照組（計 1×106 個/管細胞，加入5 μL CD90–PE 無熒光抗體）和未分選實驗組（計 1×106 個/管細胞，加入 CD90–PE 抗體 10 μL）。采用流式細胞儀檢測細胞中的 CD90+ 細胞比例（各組均檢測 1 次）。
1.2.5 無血清懸浮培養 Huh-7 細胞經消化、離心（條件同上）去上清、計數及清洗后接種到無血清培養基專用 6 孔板的 2 個孔中，每孔 1×105 個細胞，分別加入 2 mL 無血清培養基或含血清培養基（均是 1 孔），每日觀察生長狀況，隔日換液，1 周后采用流式細胞儀檢測培養后細胞中 CD90+ 細胞比例（空白對照組和實驗組加入試劑情況同 1.2.3）。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 13.0 軟件進行統計學分析。肝癌組織、癌旁組織的 CD90 表達陽性率與正常肝組織比較采用成組 χ2 檢驗，而肝癌組織和癌旁組織的比較采用配對 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 CD90 的表達結果
正常肝組織中 CD90 均呈陰性表達（圖 1），表達陽性率為 0（0/8），肝癌組織為 65.5%（38/58），癌旁組織為 20.7%（12/58），其中肝癌組織和癌旁組織均呈陽性表達 10 例，均呈陰性表達 18 例。與正常肝組織比較，肝癌組織中 CD90 的表達陽性率較高（χ2=6.78，P<0.05），但癌旁組織與正常肝組織比較差異無統計學意義（χ2=3.84，P>0.05）；與癌旁組織比較，肝癌組織中 CD90 的表達陽性率較高（χ2=20.83，P<0.05）。
圖1
示正常肝組織、肝癌組織及其癌旁組織中 CD90 的表達（SP） a 和 b：正常肝組織；c 和 d：肝癌組織；e 和 f：癌旁組織；a、c 及 e 放大倍數為 100 倍，b、d 及 f 放大倍數為 400 倍
2.2 流式細胞儀篩查結果
采用流式細胞儀篩查 Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721 及 Bel7402 細胞系中 CD90+ 細胞比例，結果顯示，4 種肝癌細胞系實驗組中 CD90+ 陽性細胞比例均較低；Bel7402 和 SMMC-7721 細胞系實驗組的 CD90+ 陽性細胞比例相對較高，但對應的空白對照組同樣較高（表 2 和圖 2），因此這兩種細胞系的 CD90 特異性不強，故選擇 Huh-7 以及 MHCC97-H 細胞系進行后續的免疫磁珠分選。
表2
Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721 及 Bel7402 細胞系中的 CD90+ 細胞比例（%，n=1）
圖2
示 4 種細胞系實驗組和空白對照組中 CD90+ 細胞比例的檢測結果 a 和 b：Huh-7 細胞系空白對照組（a）及實驗組（b）；c 和 d：MHCC97-H 細胞系空白對照組（c）及實驗組（d）；e 和 f：Bel7402 細胞系空白對照組（e）及實驗組（f）；g 和 h：SMMC-7721 細胞系空白對照組（g）及實驗組（h）
2.3 免疫磁珠法分選結果
對 Huh-7 及 MHCC97-H 細胞系進行一次分選后，CD90+ 細胞比例有所提高，但不明顯（表 3 和圖 3）。對 Huh-7 細胞進行 2 次分選后，CD90+ 細胞比例明顯提高，達到 9.700%（圖 4 和表 3），但通過流式細胞圖可以看出這樣二次通過 MS 對細胞的破壞很大，得到的細胞數量很少，1×107 個細胞分選得到的細胞不足 2.5×104 個，因此未再對其他細胞系進行二次分選。
表3
兩次分選后 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系中 CD90+ 細胞比例（%，n=1）
圖3
示采用免疫磁珠技術對 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞進行一次分選 a、b、c 及 d 為 Huh-7 細胞分選后的結果，e、f、g 及 h 為 MHCC97-H 細胞分選后的結果，其中 a 和 e 是未分選空白對照組，b 和 f 是未分選實驗組，c 和 g 是 CD90– 組，d 和 h 是 CD90+ 組
圖4
示 Huh-7 細胞的二次免疫磁珠分選結果 a：未分選空白對照；b：未分選實驗組；c：CD90– 組；d：CD90+ 組
2.4 無血清懸浮培養結果
無血清培養 Huh-7 細胞后，2 組的 CD90+ 細胞比例較含血清培養無明顯變化（表 4和圖 5），提示富集效果不佳，故未繼續培養其他細胞系。
表4
Huh-7 細胞行含血清培養和無血清培養后的 CD90+ 細胞比例（%，n=1）
圖5
Huh-7 細胞進行無血清和含血清懸浮培養后的流式細胞儀檢測結果 a：含血清培養、加入CD90–PE 無熒光抗體；b：含血清培養、加入 CD90–PE 熒光抗體；c：無血清培養、加入CD90–PE 無熒光抗體；d：無血清培養、加入 CD90–PE 熒光抗體
3 討論
3.1 正常肝臟組織、肝癌組織及其癌旁組織中 CD90 的表達
將正常肝臟組織、肝癌組織及其癌旁組織進行免疫組化染色分析，結果表明，正常肝組織不表達 CD90，肝癌組織高表達 CD90，提示了肝癌細胞表達 CD90+ 的特異性，這是將其作為肝癌干細胞標志物的依據之一。
3.2 肝癌細胞系的篩選
4 種肝癌細胞系的篩查結果表明，CD90 在肝癌細胞中確有表達。再通過流式細胞儀定量測定，4 種肝癌細胞系中 CD90+ 細胞比例均較低，這表明 CD90+ 細胞是肝癌細胞中含量極少的亞群，其中 CD90+ 細胞比例較高的 Bel7402 和 SMMC-7721 細胞系由于空白對照組中 CD90+ 細胞比例同樣較高，因此該兩種細胞系的 CD90 特異性不強。因而本研究選擇 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系進行下一步的免疫磁珠分選。
3.3 CSC 的分選
CSC 的分選是進行干細胞研究的前提，目前主流的分選方法包括流式細胞術及免疫磁珠法[12-13]，它們均具有各自的優缺點，同一種分選法對不同種類的細胞分選效果不同，同一種細胞采用不同方法分選的效果也不同，所以根據所需要實驗的腫瘤細胞的特征，選擇適合的分選方法很重要，這關系著實驗的成敗。目前根據細胞表面標志物分選肝癌干細胞的技術包括流式細胞術及免疫磁珠法，而后者更為常用。
免疫磁珠是一種包含有單克隆抗體的磁性微粒，抗體可與靶細胞特異性結合，在磁場作用下可被滯留，使得靶細胞與其他細胞分離而富集純化[14-16]。磁珠的體積小，直徑為 50 nm，遠小于細胞體積，因而理論上不會對細胞造成損傷，同時磁珠成分可被降解，不影響細胞功能。流式細胞分選法也是分選 CSC 的常用方法之一，它亦是利用細胞表面標志物進行分選，它具有很多優點。① 它能夠對濃度<0.03% 的少量細胞進行富集分離，此外還能分選出單個細胞用于單細胞研究[17-20]。② 流式細胞儀中可保持無菌環境，所得的細胞可以繼續培養。學者們[20-24]以 CD90 作為標志物，應用流式細胞術分選前列腺癌基質中的成纖維細胞，將所得亞群細胞培養后再用流式細胞術純化以用于定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析。③ 流式細胞術可同時分選多種標志物所標記的多個亞群細胞。在慢性粒細胞白血病患者的血液標本中，學者們[11, 14, 25]利用 6 種不同顏色熒光抗體標記細胞分選出了 6 種不同細胞。④ 流式細胞術不僅能分選新鮮的組織標本，還能對快速冰凍標本及石蠟包埋組織進行分選。⑤ 對干細胞的分選，流式細胞術能夠提供多種策略[26-27]，包括利用表面標志物如 CD44、CD133、CD34、CD90 等進行陽性分選，利用 Mac-1、B220、CD4 等對成熟的造血細胞進行陰性分選，基于干細胞能排除 Hoechst-33342、羅丹明等染料的特性對其進行富集分選。
本實驗利用 CD90 作為肝癌干細胞的特異性表面標志物，首先采用流式細胞儀檢測 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系中 CD90+ 細胞比例，再運用免疫磁珠技術分選 Huh-7 和 MHCC97-H 肝癌細胞系中的 CD90+ 細胞，通過流式細胞儀檢測分選后 CD90+ 和 CD90– 細胞亞群中 CD90+ 細胞的比例，同時采用無血清懸浮培養法富集肝癌干細胞。對 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系的免疫磁珠分選結果表明，分選后兩種細胞中的 CD90+ 細胞比例均升高，但升高不明顯，遠達不到實驗所需的 CD90+ 細胞純度，因此對 Huh-7 細胞進行 2 次分選，即將通過 MS 后得到的 CD90+ 細胞再次經過 MS 分選，以提高 CD90+ 細胞比例。二次分選后 Huh-7 細胞中的 CD90+ 細胞比例提高至 9.700%，較未分選空白對照組明顯提高，但依然達不到實驗所需純度，并且經過二次分選對細胞的破壞較大，對后續實驗影響大，因而這種方法不可取。應用無血清懸浮培養 Huh-7 細胞以富集 CD90+ 細胞后，采用流式細胞術檢測富集效果，結果表明這種方法對提高肝癌細胞中 CD90+ 細胞比例的作用有限。
本次實驗筆者采用的免疫磁珠分選法對肝癌 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系中 CD90+ 細胞的分選能力有限，不能達到實驗所需的 80% 的 純度，而無血清懸浮培養對 Huh-7 中 CD90+ 細胞的富集幾乎無效果。原因可能是：① 肝癌細胞系中存在的 CD90+ 細胞比例本身太低，本次實驗對 Huh-7 細胞進行二次免疫磁珠分選后 CD90+ 細胞比例相對于未分選空白對照組明顯提高，但由于本身 CD90+ 細胞比例只有 0.8% 左右，因而分選后仍然達不到所需純度；② CD90 作為肝癌干細胞標志物，對 CD90 抗體磁珠的結合能力差，導致與免疫磁珠耦合的細胞數量有限；③ 分選過程中對細胞膜的破壞較大，造成 CD90+ 細胞大量受損。
腫瘤的復發和放化療抵抗是導致腫瘤治療失敗的主要原因之一，近年來研究[1-2]表明，腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC）與腫瘤的發生、復發、耐藥和放化療抵抗均密切相關，CSC 理論及相關知識備受人們關注。CSC 可能源于正常干細胞，是正常干細胞在長期自我更新過程中，受微環境、致癌劑和遺傳因素相互作用，引起生長和分化調控途徑中某些分子發生遺傳或表觀遺傳學改變，進而發生基因表達異常或細胞表型改變所致[1, 3]。盡管 40 年前 CSC 的理論就已經被提出，然而直到近 10 年來，包括肝、肺、腦等實體 CSC 相關研究才進入新的階段[2-5]。肝癌作為一種常見的腫瘤，是否存在 CSC？這一直是近年來人肝癌研究領域的重點。2005 年日本學者 Koh 等[3]研究了 Huh7、PLC/PRF/5、HepG2 和 Huh6 四種肝癌細胞系，結果在 Huh7 和 PLC/PRF/5 細胞系中找到了 SP 細胞（side population cells），認為其可能是肝癌干細胞。最近一些研究[6-8]表明，人肝癌起源于肝臟祖細胞（hepatic progenitor cells，HPCs），且人 HPCs 的激活主要出現在與肝癌發生密切相關的疾病如慢性病毒性肝炎和乙醇性肝炎中，而且部分肝癌細胞表達 1 種或幾種 HPCs 的標志物。近來的研究[9]發現了人肝癌干細胞標志物。有學者[10-11]采用 CD90（Thy-1）來鑒定人 CSC，通過研究肝癌組織及肝癌患者血液中的 CSC 后發現：在不同肝癌細胞系中 CD90+ 細胞數目與致瘤能力成正相關，且在人肝癌組織中分選的 CD45–CD90+ 細胞比 CD45–CD90– 細胞具有更強的腫瘤形成能力，證實了在人肝癌組織及肝癌患者血液中存在肝癌干細胞，認為 CD90 是一種較理想的肝癌干細胞候選標志物。因此本實驗采用 CD90 作為肝癌干細胞標志物，對肝癌細胞進行分離與鑒定。
1 材料及方法
1.1 主要材料、試劑和設備
1.1.1 細胞株及組織 Huh-7 及 MHCC97-H 細胞株購于上海中科院上海細胞庫；SMMC-7721 和 Bel7402 細胞株由四川大學生物化學實驗室提供。正常肝組織（8 例）、肝癌組織及其癌旁組織（58 例）均源于四川大學華西醫院手術切除標本，由四川大學華西醫院病理科提供，其中癌旁組織距肝癌腫塊邊緣>3 cm。8 例正常肝組織來源患者均因外傷致肝破裂，在 2012 年 2 月至 2013 年 8 月期間于筆者所在醫院行肝部分切除術，其中男 6 例，女2 例；年齡 26～45 歲，平均年齡為 37 歲；所有患者無肝炎病史。58 例肝癌患者于 2012 年 2 月至 2013 年 8 月期間就診于筆者所在醫院，均因原發性肝細胞肝癌行肝癌切除術，其中男 39 例，女 19 例；年齡 41～68 歲，平均年齡為 53 歲；所有患者有肝炎病史。
1.1.2 實驗試劑 DMEM/F12 培養基和 PBS 緩沖液購自 Hyclone 公司；10% 胎牛血清、B27 培養基添加劑、胰島素-轉鐵蛋白（ITS-X）添加劑和 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液購自 Invitrogen Corp 公司；重組人表皮生長因子（EGF）、重組人成纖維生長因子（bFGF）和兔抗人 CD90 單克隆抗體購自 Abcam 公司；人 CD90–PE 熒光單克隆抗體購自 Miltenyi 公司；FITC 標記的羊抗兔 IgG 以及SP-9001羊抗兔 IgG 均購自北京中杉金橋公司。
1.1.3 培養基制備 含血清培養基的制備：于 90 mLDMEM/F12 培養基中加入 10 mL 胎牛血清。無血清培養基的制備：將 EGF、bFGF 及 B27 加入基礎培養基中，配成含 2% B27、20 mg/L EGF 及 20 mg/LbFGF 的無血清培養基。
1.1.4 主要設備 本實驗所需主要設備名稱、型號及生產公司見表 1。
表1
主要設備信息
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學染色法（SP 法）檢測 CD90 的表達 將正常肝組織、肝癌組織及其癌旁組織經固定、脫水、石蠟包埋后行 2 μm 厚切片，進行免疫組織化學染色（具體操作按試劑盒說明書進行）。
1.2.2 各肝癌細胞系細胞的培養、保種以及復蘇培養條件：培養基為含血清培養基，氣相為 95% 空氣+5% CO2，溫度為 37 ℃。保種時將細胞分裝至保種管，放置于超低溫冰箱（–150 ℃）中凍存。復蘇時將凍存細胞取出后置于 37℃ 水浴箱中快速融化，并轉移至離心管中，加入含 10% FBS 的 DMEM/F12 高糖培養基，離心（1 200 r/min，r=25 cm，3 min）去上清液、重懸，轉移至培養瓶中培養。
1.2.3 流式細胞儀檢測肝癌細胞系中 CD90+ 細胞比例 ① Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721 及 Bel7402 細胞經消化、離心（條件同上）、計數及清洗，分為空白對照組和實驗組（細胞數均為 5.5×105 個/管，只檢測 1 管），分別加入 200 μL PBS 液重懸。實驗組細胞中加入 5 μL CD90–PE 抗體，空白對照組加入 5 μL CD90– 無熒光抗體，常溫避光孵育15 min。清洗后加入 200 μL PBS 液重懸，上機檢測。② 采用流式細胞儀檢測經免疫磁珠分選后的細胞（CD90– 組和 CD90+ 組）、未分選的細胞（未分選空白對照組和未分選實驗組）中 CD90+ 細胞的比例。③ 經無血清和有血清懸浮培養的細胞，也采用流式細胞儀檢測 CD90+ 細胞比例。均檢測 1 次。
1.2.4 免疫磁珠分選 將流式細胞儀篩查出的細胞系進行免疫磁珠分選。① 磁珠標記：細胞經過消化、離心（條件同上）及計數后轉移至離心管中，每管含 1×107 個細胞。清洗離心（條件同上）去上清液后，每管加入 500 μL PBS 緩沖液重懸，之后每管再加入 20 μL 標記了 CD90 抗體的磁珠，混勻后放置于 4℃ 冰箱中 15 min，期間每 5 min 震蕩1 次。清洗后每管再加入 500 μL PBS 緩沖液重懸。② 磁珠分選：潤洗 MS 后加入上述細胞懸液，采用離心管收集流經 MS 后的細胞懸液 1 mL，標記為 CD90– 組。將 MS 移出磁場區域，加入 1 mL PBS 緩沖液快速沖洗至離心管中，標記為 CD90+ 組。以未分選細胞作為空白對照組（計 1×106 個/管細胞，加入5 μL CD90–PE 無熒光抗體）和未分選實驗組（計 1×106 個/管細胞，加入 CD90–PE 抗體 10 μL）。采用流式細胞儀檢測細胞中的 CD90+ 細胞比例（各組均檢測 1 次）。
1.2.5 無血清懸浮培養 Huh-7 細胞經消化、離心（條件同上）去上清、計數及清洗后接種到無血清培養基專用 6 孔板的 2 個孔中，每孔 1×105 個細胞，分別加入 2 mL 無血清培養基或含血清培養基（均是 1 孔），每日觀察生長狀況，隔日換液，1 周后采用流式細胞儀檢測培養后細胞中 CD90+ 細胞比例（空白對照組和實驗組加入試劑情況同 1.2.3）。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 13.0 軟件進行統計學分析。肝癌組織、癌旁組織的 CD90 表達陽性率與正常肝組織比較采用成組 χ2 檢驗，而肝癌組織和癌旁組織的比較采用配對 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 CD90 的表達結果
正常肝組織中 CD90 均呈陰性表達（圖 1），表達陽性率為 0（0/8），肝癌組織為 65.5%（38/58），癌旁組織為 20.7%（12/58），其中肝癌組織和癌旁組織均呈陽性表達 10 例，均呈陰性表達 18 例。與正常肝組織比較，肝癌組織中 CD90 的表達陽性率較高（χ2=6.78，P<0.05），但癌旁組織與正常肝組織比較差異無統計學意義（χ2=3.84，P>0.05）；與癌旁組織比較，肝癌組織中 CD90 的表達陽性率較高（χ2=20.83，P<0.05）。
圖1
示正常肝組織、肝癌組織及其癌旁組織中 CD90 的表達（SP） a 和 b：正常肝組織；c 和 d：肝癌組織；e 和 f：癌旁組織；a、c 及 e 放大倍數為 100 倍，b、d 及 f 放大倍數為 400 倍
2.2 流式細胞儀篩查結果
采用流式細胞儀篩查 Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721 及 Bel7402 細胞系中 CD90+ 細胞比例，結果顯示，4 種肝癌細胞系實驗組中 CD90+ 陽性細胞比例均較低；Bel7402 和 SMMC-7721 細胞系實驗組的 CD90+ 陽性細胞比例相對較高，但對應的空白對照組同樣較高（表 2 和圖 2），因此這兩種細胞系的 CD90 特異性不強，故選擇 Huh-7 以及 MHCC97-H 細胞系進行后續的免疫磁珠分選。
表2
Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721 及 Bel7402 細胞系中的 CD90+ 細胞比例（%，n=1）
圖2
示 4 種細胞系實驗組和空白對照組中 CD90+ 細胞比例的檢測結果 a 和 b：Huh-7 細胞系空白對照組（a）及實驗組（b）；c 和 d：MHCC97-H 細胞系空白對照組（c）及實驗組（d）；e 和 f：Bel7402 細胞系空白對照組（e）及實驗組（f）；g 和 h：SMMC-7721 細胞系空白對照組（g）及實驗組（h）
2.3 免疫磁珠法分選結果
對 Huh-7 及 MHCC97-H 細胞系進行一次分選后，CD90+ 細胞比例有所提高，但不明顯（表 3 和圖 3）。對 Huh-7 細胞進行 2 次分選后，CD90+ 細胞比例明顯提高，達到 9.700%（圖 4 和表 3），但通過流式細胞圖可以看出這樣二次通過 MS 對細胞的破壞很大，得到的細胞數量很少，1×107 個細胞分選得到的細胞不足 2.5×104 個，因此未再對其他細胞系進行二次分選。
表3
兩次分選后 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系中 CD90+ 細胞比例（%，n=1）
圖3
示采用免疫磁珠技術對 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞進行一次分選 a、b、c 及 d 為 Huh-7 細胞分選后的結果，e、f、g 及 h 為 MHCC97-H 細胞分選后的結果，其中 a 和 e 是未分選空白對照組，b 和 f 是未分選實驗組，c 和 g 是 CD90– 組，d 和 h 是 CD90+ 組
圖4
示 Huh-7 細胞的二次免疫磁珠分選結果 a：未分選空白對照；b：未分選實驗組；c：CD90– 組；d：CD90+ 組
2.4 無血清懸浮培養結果
無血清培養 Huh-7 細胞后，2 組的 CD90+ 細胞比例較含血清培養無明顯變化（表 4和圖 5），提示富集效果不佳，故未繼續培養其他細胞系。
表4
Huh-7 細胞行含血清培養和無血清培養后的 CD90+ 細胞比例（%，n=1）
圖5
Huh-7 細胞進行無血清和含血清懸浮培養后的流式細胞儀檢測結果 a：含血清培養、加入CD90–PE 無熒光抗體；b：含血清培養、加入 CD90–PE 熒光抗體；c：無血清培養、加入CD90–PE 無熒光抗體；d：無血清培養、加入 CD90–PE 熒光抗體
3 討論
3.1 正常肝臟組織、肝癌組織及其癌旁組織中 CD90 的表達
將正常肝臟組織、肝癌組織及其癌旁組織進行免疫組化染色分析，結果表明，正常肝組織不表達 CD90，肝癌組織高表達 CD90，提示了肝癌細胞表達 CD90+ 的特異性，這是將其作為肝癌干細胞標志物的依據之一。
3.2 肝癌細胞系的篩選
4 種肝癌細胞系的篩查結果表明，CD90 在肝癌細胞中確有表達。再通過流式細胞儀定量測定，4 種肝癌細胞系中 CD90+ 細胞比例均較低，這表明 CD90+ 細胞是肝癌細胞中含量極少的亞群，其中 CD90+ 細胞比例較高的 Bel7402 和 SMMC-7721 細胞系由于空白對照組中 CD90+ 細胞比例同樣較高，因此該兩種細胞系的 CD90 特異性不強。因而本研究選擇 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系進行下一步的免疫磁珠分選。
3.3 CSC 的分選
CSC 的分選是進行干細胞研究的前提，目前主流的分選方法包括流式細胞術及免疫磁珠法[12-13]，它們均具有各自的優缺點，同一種分選法對不同種類的細胞分選效果不同，同一種細胞采用不同方法分選的效果也不同，所以根據所需要實驗的腫瘤細胞的特征，選擇適合的分選方法很重要，這關系著實驗的成敗。目前根據細胞表面標志物分選肝癌干細胞的技術包括流式細胞術及免疫磁珠法，而后者更為常用。
免疫磁珠是一種包含有單克隆抗體的磁性微粒，抗體可與靶細胞特異性結合，在磁場作用下可被滯留，使得靶細胞與其他細胞分離而富集純化[14-16]。磁珠的體積小，直徑為 50 nm，遠小于細胞體積，因而理論上不會對細胞造成損傷，同時磁珠成分可被降解，不影響細胞功能。流式細胞分選法也是分選 CSC 的常用方法之一，它亦是利用細胞表面標志物進行分選，它具有很多優點。① 它能夠對濃度<0.03% 的少量細胞進行富集分離，此外還能分選出單個細胞用于單細胞研究[17-20]。② 流式細胞儀中可保持無菌環境，所得的細胞可以繼續培養。學者們[20-24]以 CD90 作為標志物，應用流式細胞術分選前列腺癌基質中的成纖維細胞，將所得亞群細胞培養后再用流式細胞術純化以用于定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析。③ 流式細胞術可同時分選多種標志物所標記的多個亞群細胞。在慢性粒細胞白血病患者的血液標本中，學者們[11, 14, 25]利用 6 種不同顏色熒光抗體標記細胞分選出了 6 種不同細胞。④ 流式細胞術不僅能分選新鮮的組織標本，還能對快速冰凍標本及石蠟包埋組織進行分選。⑤ 對干細胞的分選，流式細胞術能夠提供多種策略[26-27]，包括利用表面標志物如 CD44、CD133、CD34、CD90 等進行陽性分選，利用 Mac-1、B220、CD4 等對成熟的造血細胞進行陰性分選，基于干細胞能排除 Hoechst-33342、羅丹明等染料的特性對其進行富集分選。
本實驗利用 CD90 作為肝癌干細胞的特異性表面標志物，首先采用流式細胞儀檢測 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系中 CD90+ 細胞比例，再運用免疫磁珠技術分選 Huh-7 和 MHCC97-H 肝癌細胞系中的 CD90+ 細胞，通過流式細胞儀檢測分選后 CD90+ 和 CD90– 細胞亞群中 CD90+ 細胞的比例，同時采用無血清懸浮培養法富集肝癌干細胞。對 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系的免疫磁珠分選結果表明，分選后兩種細胞中的 CD90+ 細胞比例均升高，但升高不明顯，遠達不到實驗所需的 CD90+ 細胞純度，因此對 Huh-7 細胞進行 2 次分選，即將通過 MS 后得到的 CD90+ 細胞再次經過 MS 分選，以提高 CD90+ 細胞比例。二次分選后 Huh-7 細胞中的 CD90+ 細胞比例提高至 9.700%，較未分選空白對照組明顯提高，但依然達不到實驗所需純度，并且經過二次分選對細胞的破壞較大，對后續實驗影響大，因而這種方法不可取。應用無血清懸浮培養 Huh-7 細胞以富集 CD90+ 細胞后，采用流式細胞術檢測富集效果，結果表明這種方法對提高肝癌細胞中 CD90+ 細胞比例的作用有限。
本次實驗筆者采用的免疫磁珠分選法對肝癌 Huh-7 和 MHCC97-H 細胞系中 CD90+ 細胞的分選能力有限，不能達到實驗所需的 80% 的 純度，而無血清懸浮培養對 Huh-7 中 CD90+ 細胞的富集幾乎無效果。原因可能是：① 肝癌細胞系中存在的 CD90+ 細胞比例本身太低，本次實驗對 Huh-7 細胞進行二次免疫磁珠分選后 CD90+ 細胞比例相對于未分選空白對照組明顯提高，但由于本身 CD90+ 細胞比例只有 0.8% 左右，因而分選后仍然達不到所需純度；② CD90 作為肝癌干細胞標志物，對 CD90 抗體磁珠的結合能力差，導致與免疫磁珠耦合的細胞數量有限；③ 分選過程中對細胞膜的破壞較大，造成 CD90+ 細胞大量受損。
