引用本文： 張鑫, 劉臻, 孫韶龍, 吳鑫, 孟祥鵬, 姚威, 王寶勝. 趨化因子受體 CXCR7 與胰腺癌發生發展的關系研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(8): 940-945. doi: 10.7507/1007-9424.201702043 復制
胰腺癌是常見的嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤之一，其對放化療不敏感，手術是最有效的治療手段，但其特點是早期局部播散和遠處轉移，大部分患者在確診的時候已屬晚期，無法手術切除，僅 20% 左右的患者可行手術治療，總體 5 年生存率<5%。近年來，胰腺癌發病率在世界范圍內逐年攀升，迫切需要新的治療策略和手段。對胰腺癌生物學特性，尤其是侵襲和轉移的相關分子機制進行深入研究非常重要。
趨化因子受體是一類介導趨化因子行使功能的 G 蛋白偶聯跨膜受體，通過與其配體結合而發揮作用，廣泛參與細胞的生長發育、增殖、凋亡等多種生理功能。趨化因子受體與其配體構成生物學軸，其激活的特殊信號傳導途徑，對癌細胞在轉移部位的種植，存活和增殖起關鍵的作用[1-2]。CXCR7 是新近發現的與腫瘤發生有關的趨化因子受體，它能與配體 SDF-1α 結合，參與介導很多細胞功能，比如增殖、遷移等[3-4]，從而打破了 SDF-1α 只能與 CXCR4 這個唯一的受體結合的傳統觀點[5-6]。越來越多的研究[7-10]證實了 CXCR7 在腫瘤增殖、侵襲和轉移中的重要作用。在我們之前的研究[11]中發現，胰腺癌中 CXCR7 的表達率較正常胰腺組織明顯升高，并且 CXCR7 的陽性表達與淋巴結轉移相關。本研究探討 CXCR7 在人胰腺癌發生發展中的作用，通過構建 CXCR7-shRNA 序列的表達載體，運用 RNA 干擾技術沉默 CXCR7 的表達，探討沉默 CXCR7 對人胰腺癌細胞增殖、細胞周期、凋亡及侵襲的影響。
1 材料與方法
1.1 細胞系和細胞培養
人胰腺癌細胞高轉移株 AsPC-1，由中國醫科大學附屬盛京醫院譚曉東教授惠贈，用包含 10% 胎牛血清（Gibco，USA）和 100 U/mL 青霉素及 100 μg/mL 鏈霉素的 RPMI 1640 培養基（Gibco，USA），在 37 ℃、 5%CO2 的細胞培養箱中常規培養，當細胞生長狀態良好，處于對數生長期時，用于轉染。
1.2 轉染
本研究應用 short hairpin RNA（以下簡稱 shRNA）以下調 AsPC-1 細胞中 CXCR7 的表達。將 CXCR7-shRNA 慢病毒表達載體（上海凱基公司設計和合成）轉染 AsPC-1 細胞作為實驗組（CXCR7-shRNA 組），使用慢病毒表達載體陰性無關對照序列轉染 AsPC-1 細胞作為陰性對照組（NC 組），然后使用 G418（2 μg/mL）篩選穩定轉染的細胞株；未經任何轉染處理的 AsPC-1 細胞作為為空白對照組（BC 組）。采用 RT-PCR 和 Western blot 法檢測各組 AsPC-1 細胞中 CXCR7 的表達。
1.3 CXCR7 mRNA 表達的檢測
按照 Trizol 試劑盒（TaKaRa Bio Inc，Japan）說明從 AsPC-1 細胞中提取總 RNA，應用逆轉錄試劑盒（TaKaRa Bio Inc，Japan）合成 cDNA。實時 PCR 在 ABI7500 Real-time PCR 儀（Applied Biosystems，USA） 中進行。擴增條件：95 ℃、30 s，1 個循環；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個循環。目的基因 CXCR7 上游引物為 5′-AGCATCAAGGAGTGGCTGAT-3′，下游引物為 5′-TGTGCTTCTCCTGGTCACTG-3′；內參照基因 GAPDH 上游引物為 5′-ACAGTCAGCCGCTTCTT-3′，下游引物為 5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′[12-13]。根據熒光信號，檢測出每個反應體系中待測基因的 Ct 值。每個樣本均設 3 個復孔，結果應用 2–ΔΔCt法[12]進行分析。
1.4 CXCR7 蛋白表達的檢測
收獲各組細胞，用 PBS 液洗滌，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，勻漿裂解，12 000 r/min、4℃、離心 10 min 后，取上清液測定蛋白濃度。取蛋白樣本加入上樣緩沖液，煮沸變性 5 min，用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，蛋白通過濕轉轉移到 PVDF 膜（Millipore，USA），用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 溶液封閉 60 min，用 1∶400 的兔抗人 CXCR7 單克隆抗體（Proteintech Group Inc，USA）于 4℃ 孵育過夜，另用 1∶15 000 的鼠抗人 GAPDH 單克隆抗體（Proteintech Group Inc，USA）作為內參照。加入 1∶2 000 的山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗（ZSGB-BIO，China），室溫下孵育 90 min。底物化學發光 ECL 呈色（Beyotime Biotechnology，China）。采用 IPP 圖像分析系統（FluorChemo，USA）分析目的蛋白及內參蛋白的積分光密度（integral optical density，IOD）值，以 IOD 的比值（CXCR7 的 IOD 值/GAPDH 的 IOD 值）作為 CXCR7 蛋白的相對表達量。
1.5 細胞增殖能力的檢測
將各組細胞培養至對數生長期后制成單細胞懸液，按 1 000 個/孔分別接種于 96 孔培養板，每孔 200 μL 培養基，分別于 1 d、2 d、3 d、4 d 和 5 d 加入 MTT 溶液（5 mg/mL，Biosharp，China） 20 μL，繼續孵育 4 h 后，吸棄孔內培養液，加入 DMSO 150 μL，置搖床上低速振蕩 10 min，應用酶聯免疫檢測儀（Spectra Max 190，USA）測量各孔 570 nm 處的吸光度值（A 值），每組設 3 個復孔，取各組值的均數表示細胞的增殖能力。
1.6 細胞周期檢測
細胞在 6 孔板中培養，無血清培養基饑餓 24 h 后回收各組細胞，制成單細胞懸液（1×105個/mL），70% 冰乙醇固定，–20℃ 過夜，重懸細胞，加入 500 μL PBS：含 5 mg/mL 溴化乙錠（Sigmae-Aldrich，USA），100 g/mL RNaseA，4 ℃ 避光染色 30 min，在流式細胞儀上進行檢測，每組實驗重復 3 次。
1.7 細胞凋亡檢測
收集各組細胞，PBS 洗滌細胞 2 遍，離心（1 000 r/min、5 min）后加入 5 μL 7-AAD 染液（KeyGen Biotech，China），混勻；室溫、避光、反應 5～15 min；加入 500 μL 的 1×分析緩沖液懸浮細胞；1 h 內，在流式細胞儀上檢測，每組實驗重復 3 次。
1.8 細胞侵襲能力檢測
首先將基質膠（BD Biosciences，USA）加入到 Transwell 小室（孔徑 8 μm，Corning Costar Corp，USA）的上室，然后置于 37 ℃ 孵箱中靜止 4 h，使其成膠，然后加入無血清培養基水化基底膜。細胞饑餓 24 h 去除血清影響，收獲各組對數生長期的細胞，用無血清的 RPMI 1640 培養基懸浮細胞，調整細胞密度。將 200 μL 的細胞懸液（約 5×105 個/mL）加入上室，下室加入 0.5 mL 含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 完全培養基，37 ℃、5%CO2 條件下孵育 24 h 后取出 Transwell 小室，用棉簽輕輕擦去濾膜上室面的細胞，濾膜下室面的細胞用 4% 多聚甲醛固定，結晶紫染色。顯微鏡下（200 倍） 直接觀察穿過膜的細胞數，隨機取 5 個視野，計數每個視野內的細胞數，重復 3 次，取均值。
1.9 統計學方法
應用 SPSS 17.0 軟件（SPSS Inc.，USA） 進行數據分析，結果以均值±標準差（ ±s）表示，對 Western blot 和 RT-PCR 檢測的結果采用 t 檢驗分析，其余實驗結果則采用單因素方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 AsPC-1 細胞中 CXCR7 表達檢測結果
為了進一步研究 CXCR7 在胰腺癌中的作用，本研究利用 shRNA 敲除 AsPC-1 細胞中的 CXCR7 表達，采用 RT-PCR 和 Western blot 法來判定 CXCR7 是否穩定敲除。結果：與 BC 組相比，CXCR7-shRNA 組 AsPC-1 細胞中 CXCR7 在 mRNA 及蛋白水平的表達均顯著下調（P<0.05），而 NC 組 AsPC-1 細胞中 CXCR7 mRNA 及蛋白表達水平無明顯變化（P>0.05）。見圖 1。
圖1
示各組 AsPC-1 細胞中 CXCR7 表達檢測結果。 a：各組細胞中 CXCR7 mRNA 表達；b：各組細胞中 CXCR7 蛋白表達電泳圖；c：各組細胞中 CXCR7 蛋白表達； 與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
2.2 沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞增殖的影響
結果見圖 2。由圖 2 可看出，CXCR7-shRNA 組細胞的增殖能力于培養 2～5 d 均明顯低于 NC 組和 BC 組（P<0.05）；而 NC 組與 BC 組各時相細胞增殖能力的差異均無統計學意義（P>0.05）。該結果提示，沉默 CXCR7 可以抑制 AsPC-1 細胞的增殖能力。
圖2
示沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞增殖的影響。 與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
2.3 沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞周期的影響
結果見圖 3。由圖 3 可見，與 BC 組及 NC 組相比，CXCR7-shRNA 組 G0/G1 期細胞明顯增多，S 期及 G2/M 期的細胞顯著減少（P<0.05），提示細胞明顯被阻滯于 G0/G1 期。NC 組細胞周期較 BC 組無明顯變化（P>0.05）。
圖3
示沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞周期的影響。 a：流式細胞儀檢測各組細胞周期示意圖；b：各組細胞周期檢測結果；與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
2.4 沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞凋亡的影響
流式細胞術檢測結果提示：CXCR7-shRNA 組細胞凋亡率明顯高于 BC 組及 NC 組（P<0.05），BC 組與 NC 組之間細胞凋亡率差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
示沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞凋亡率影響。 a：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡代表示意圖；b：各組細胞的凋亡率。與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
2.5 沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞的離體侵襲能力影響
結果見圖 5。由圖 5 可見，與 NC 組和 BC 組比較，CXCR7-shRNA 組細胞的侵襲能力明顯下降（P<0.05），NC 組和 BC 組細胞的侵襲能力比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖5
示各組細胞侵襲情況檢測結果（結晶紫染色 ×200）。 a: BC 組；b：NC 組；c: CXCR7-shRNA 組；d：各組細胞侵襲細胞數情況，與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
3 討論
腫瘤的生長和轉移受到多因素的調節，其中趨化因子及其受體成為最近研究的熱點，特別是 SDF-1α 及其受體。既往研究[14]認為，SDF-1α 是通過其唯一受體 CXCR4 而發揮作用的。但有研究[5]發現，SDF-1α 還有另一受體 CXCR7，其與 SDF-1α 的親和性還明顯高于 CXCR4，由于這一研究成果的報道，人們開始重新審視 SDF-1α 的作用機制。CXCR7 已經證實在多種惡性腫瘤中有表達，包括肺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌和肝細胞癌[7, 15-18]；并且有研究[19]認為，CXCR7 高表達的胰腺癌預后較差。CXCR7 與腫瘤分級相關，并且在腫瘤的進展和分化中起著潛在的作用[20]。在筆者所在團隊之前的研究[11]中，發現胰腺癌組織中 CXCR7 的表達陽性率較正常胰腺組織明顯升高，并且 CXCR7 的陽性表達與淋巴結轉移相關，提示 CXCR7 可能參與胰腺癌的侵襲和轉移過程。
目前的研究表明，CXCR7 在癌細胞趨化性中的作用仍然存在爭議。一些研究認為，CXCR7 不能通過 SDF-1α 介導趨化性[3, 21]，然而其他的一些報道則提示 CXCR7 能通過 SDF-1α 觸發癌細胞的趨化性[22-23]。Wang 等[16]研究發現，過表達 CXCR7 的前列腺癌細胞黏附于人真皮微血管內皮細胞的細胞數明顯高于對照組，并且在 SDF-1α 存在的條件下，過表達 CXCR7 細胞的侵襲能力也比對照組要高；CXCR7 通過調節細胞黏附分子 FN1、CDH11、CD44 及基質金屬蛋白酶從而增強腫瘤細胞的侵襲性和轉移能力。本研究發現，沉默 CXCR7 表達可抑制 AsPC-1 細胞的侵襲能力。總的來說，這些結果提示，SDF-1α 可通過 CXCR7 調節 AsPC-1 細胞的定向遷移和侵襲。
本研究通過 MTT 法分析敲除 CXCR7 后觀察 AsPC-1 細胞增殖能力的變化，結果發現，抑制 AsPC-1 細胞中 CXCR7 的表達后，AsPC-1 細胞的增殖能力明顯降低，提示 CXCR7 在促進 AsPC-1 增殖中發揮了重要作用，這與前期報道 CXCR7 促進乳腺癌[24]、前列腺癌[16] 及肝細胞癌[9]增殖基本一致。但也有人[25]報道，SDF-1α 的表達抑制人胰腺癌的增殖和轉移。目前關于 CXCR7 促進腫瘤增殖的作用機制尚不明確，在未來的研究中我們將進一步探討 SDF-1α/CXCR7 促進胰腺癌細胞增殖的作用機制。
本研究發現，AsPC-1 細胞在敲除 CXCR7 后休眠于 G0/G1 期，增殖受抑制且凋亡率增加。細胞周期由蛋白激酶復合物調節[26]，這些激酶功能的異常會導致細胞周期失調，從而導致細胞增殖及凋亡的異常。Liu 等[27]報道了甲狀腺癌細胞在敲除 CXCR7 后休眠于 S 期，并且與細胞周期蛋白 A-CDK2-PCNA 的減少和 P21 及 P57 表達水平增加有關。提示 CXCR7 可通過調節細胞周期蛋白來控制細胞周期。
綜上所述，CXCR7 與胰腺癌細胞的惡性行為密切相關。本研究通過體外模型證實，抑制胰腺癌細胞 AsPC-1 中 CXCR7 的表達，可以抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力，誘導細胞休眠于 G0/G1 期，并且促進細胞凋亡。總之，這些研究數據表明，CXCR7 在調節 AsPC-1 細胞的增殖和侵襲能力中扮演著重要的角色，CXCR7 可能成為胰腺癌治療新的靶點。
胰腺癌是常見的嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤之一，其對放化療不敏感，手術是最有效的治療手段，但其特點是早期局部播散和遠處轉移，大部分患者在確診的時候已屬晚期，無法手術切除，僅 20% 左右的患者可行手術治療，總體 5 年生存率<5%。近年來，胰腺癌發病率在世界范圍內逐年攀升，迫切需要新的治療策略和手段。對胰腺癌生物學特性，尤其是侵襲和轉移的相關分子機制進行深入研究非常重要。
趨化因子受體是一類介導趨化因子行使功能的 G 蛋白偶聯跨膜受體，通過與其配體結合而發揮作用，廣泛參與細胞的生長發育、增殖、凋亡等多種生理功能。趨化因子受體與其配體構成生物學軸，其激活的特殊信號傳導途徑，對癌細胞在轉移部位的種植，存活和增殖起關鍵的作用[1-2]。CXCR7 是新近發現的與腫瘤發生有關的趨化因子受體，它能與配體 SDF-1α 結合，參與介導很多細胞功能，比如增殖、遷移等[3-4]，從而打破了 SDF-1α 只能與 CXCR4 這個唯一的受體結合的傳統觀點[5-6]。越來越多的研究[7-10]證實了 CXCR7 在腫瘤增殖、侵襲和轉移中的重要作用。在我們之前的研究[11]中發現，胰腺癌中 CXCR7 的表達率較正常胰腺組織明顯升高，并且 CXCR7 的陽性表達與淋巴結轉移相關。本研究探討 CXCR7 在人胰腺癌發生發展中的作用，通過構建 CXCR7-shRNA 序列的表達載體，運用 RNA 干擾技術沉默 CXCR7 的表達，探討沉默 CXCR7 對人胰腺癌細胞增殖、細胞周期、凋亡及侵襲的影響。
1 材料與方法
1.1 細胞系和細胞培養
人胰腺癌細胞高轉移株 AsPC-1，由中國醫科大學附屬盛京醫院譚曉東教授惠贈，用包含 10% 胎牛血清（Gibco，USA）和 100 U/mL 青霉素及 100 μg/mL 鏈霉素的 RPMI 1640 培養基（Gibco，USA），在 37 ℃、 5%CO2 的細胞培養箱中常規培養，當細胞生長狀態良好，處于對數生長期時，用于轉染。
1.2 轉染
本研究應用 short hairpin RNA（以下簡稱 shRNA）以下調 AsPC-1 細胞中 CXCR7 的表達。將 CXCR7-shRNA 慢病毒表達載體（上海凱基公司設計和合成）轉染 AsPC-1 細胞作為實驗組（CXCR7-shRNA 組），使用慢病毒表達載體陰性無關對照序列轉染 AsPC-1 細胞作為陰性對照組（NC 組），然后使用 G418（2 μg/mL）篩選穩定轉染的細胞株；未經任何轉染處理的 AsPC-1 細胞作為為空白對照組（BC 組）。采用 RT-PCR 和 Western blot 法檢測各組 AsPC-1 細胞中 CXCR7 的表達。
1.3 CXCR7 mRNA 表達的檢測
按照 Trizol 試劑盒（TaKaRa Bio Inc，Japan）說明從 AsPC-1 細胞中提取總 RNA，應用逆轉錄試劑盒（TaKaRa Bio Inc，Japan）合成 cDNA。實時 PCR 在 ABI7500 Real-time PCR 儀（Applied Biosystems，USA） 中進行。擴增條件：95 ℃、30 s，1 個循環；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個循環。目的基因 CXCR7 上游引物為 5′-AGCATCAAGGAGTGGCTGAT-3′，下游引物為 5′-TGTGCTTCTCCTGGTCACTG-3′；內參照基因 GAPDH 上游引物為 5′-ACAGTCAGCCGCTTCTT-3′，下游引物為 5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′[12-13]。根據熒光信號，檢測出每個反應體系中待測基因的 Ct 值。每個樣本均設 3 個復孔，結果應用 2–ΔΔCt法[12]進行分析。
1.4 CXCR7 蛋白表達的檢測
收獲各組細胞，用 PBS 液洗滌，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，勻漿裂解，12 000 r/min、4℃、離心 10 min 后，取上清液測定蛋白濃度。取蛋白樣本加入上樣緩沖液，煮沸變性 5 min，用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，蛋白通過濕轉轉移到 PVDF 膜（Millipore，USA），用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 溶液封閉 60 min，用 1∶400 的兔抗人 CXCR7 單克隆抗體（Proteintech Group Inc，USA）于 4℃ 孵育過夜，另用 1∶15 000 的鼠抗人 GAPDH 單克隆抗體（Proteintech Group Inc，USA）作為內參照。加入 1∶2 000 的山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗（ZSGB-BIO，China），室溫下孵育 90 min。底物化學發光 ECL 呈色（Beyotime Biotechnology，China）。采用 IPP 圖像分析系統（FluorChemo，USA）分析目的蛋白及內參蛋白的積分光密度（integral optical density，IOD）值，以 IOD 的比值（CXCR7 的 IOD 值/GAPDH 的 IOD 值）作為 CXCR7 蛋白的相對表達量。
1.5 細胞增殖能力的檢測
將各組細胞培養至對數生長期后制成單細胞懸液，按 1 000 個/孔分別接種于 96 孔培養板，每孔 200 μL 培養基，分別于 1 d、2 d、3 d、4 d 和 5 d 加入 MTT 溶液（5 mg/mL，Biosharp，China） 20 μL，繼續孵育 4 h 后，吸棄孔內培養液，加入 DMSO 150 μL，置搖床上低速振蕩 10 min，應用酶聯免疫檢測儀（Spectra Max 190，USA）測量各孔 570 nm 處的吸光度值（A 值），每組設 3 個復孔，取各組值的均數表示細胞的增殖能力。
1.6 細胞周期檢測
細胞在 6 孔板中培養，無血清培養基饑餓 24 h 后回收各組細胞，制成單細胞懸液（1×105個/mL），70% 冰乙醇固定，–20℃ 過夜，重懸細胞，加入 500 μL PBS：含 5 mg/mL 溴化乙錠（Sigmae-Aldrich，USA），100 g/mL RNaseA，4 ℃ 避光染色 30 min，在流式細胞儀上進行檢測，每組實驗重復 3 次。
1.7 細胞凋亡檢測
收集各組細胞，PBS 洗滌細胞 2 遍，離心（1 000 r/min、5 min）后加入 5 μL 7-AAD 染液（KeyGen Biotech，China），混勻；室溫、避光、反應 5～15 min；加入 500 μL 的 1×分析緩沖液懸浮細胞；1 h 內，在流式細胞儀上檢測，每組實驗重復 3 次。
1.8 細胞侵襲能力檢測
首先將基質膠（BD Biosciences，USA）加入到 Transwell 小室（孔徑 8 μm，Corning Costar Corp，USA）的上室，然后置于 37 ℃ 孵箱中靜止 4 h，使其成膠，然后加入無血清培養基水化基底膜。細胞饑餓 24 h 去除血清影響，收獲各組對數生長期的細胞，用無血清的 RPMI 1640 培養基懸浮細胞，調整細胞密度。將 200 μL 的細胞懸液（約 5×105 個/mL）加入上室，下室加入 0.5 mL 含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 完全培養基，37 ℃、5%CO2 條件下孵育 24 h 后取出 Transwell 小室，用棉簽輕輕擦去濾膜上室面的細胞，濾膜下室面的細胞用 4% 多聚甲醛固定，結晶紫染色。顯微鏡下（200 倍） 直接觀察穿過膜的細胞數，隨機取 5 個視野，計數每個視野內的細胞數，重復 3 次，取均值。
1.9 統計學方法
應用 SPSS 17.0 軟件（SPSS Inc.，USA） 進行數據分析，結果以均值±標準差（ ±s）表示，對 Western blot 和 RT-PCR 檢測的結果采用 t 檢驗分析，其余實驗結果則采用單因素方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 AsPC-1 細胞中 CXCR7 表達檢測結果
為了進一步研究 CXCR7 在胰腺癌中的作用，本研究利用 shRNA 敲除 AsPC-1 細胞中的 CXCR7 表達，采用 RT-PCR 和 Western blot 法來判定 CXCR7 是否穩定敲除。結果：與 BC 組相比，CXCR7-shRNA 組 AsPC-1 細胞中 CXCR7 在 mRNA 及蛋白水平的表達均顯著下調（P<0.05），而 NC 組 AsPC-1 細胞中 CXCR7 mRNA 及蛋白表達水平無明顯變化（P>0.05）。見圖 1。
圖1
示各組 AsPC-1 細胞中 CXCR7 表達檢測結果。 a：各組細胞中 CXCR7 mRNA 表達；b：各組細胞中 CXCR7 蛋白表達電泳圖；c：各組細胞中 CXCR7 蛋白表達； 與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
2.2 沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞增殖的影響
結果見圖 2。由圖 2 可看出，CXCR7-shRNA 組細胞的增殖能力于培養 2～5 d 均明顯低于 NC 組和 BC 組（P<0.05）；而 NC 組與 BC 組各時相細胞增殖能力的差異均無統計學意義（P>0.05）。該結果提示，沉默 CXCR7 可以抑制 AsPC-1 細胞的增殖能力。
圖2
示沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞增殖的影響。 與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
2.3 沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞周期的影響
結果見圖 3。由圖 3 可見，與 BC 組及 NC 組相比，CXCR7-shRNA 組 G0/G1 期細胞明顯增多，S 期及 G2/M 期的細胞顯著減少（P<0.05），提示細胞明顯被阻滯于 G0/G1 期。NC 組細胞周期較 BC 組無明顯變化（P>0.05）。
圖3
示沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞周期的影響。 a：流式細胞儀檢測各組細胞周期示意圖；b：各組細胞周期檢測結果；與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
2.4 沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞凋亡的影響
流式細胞術檢測結果提示：CXCR7-shRNA 組細胞凋亡率明顯高于 BC 組及 NC 組（P<0.05），BC 組與 NC 組之間細胞凋亡率差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
示沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞凋亡率影響。 a：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡代表示意圖；b：各組細胞的凋亡率。與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
2.5 沉默 CXCR7 對 AsPC-1 細胞的離體侵襲能力影響
結果見圖 5。由圖 5 可見，與 NC 組和 BC 組比較，CXCR7-shRNA 組細胞的侵襲能力明顯下降（P<0.05），NC 組和 BC 組細胞的侵襲能力比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖5
示各組細胞侵襲情況檢測結果（結晶紫染色 ×200）。 a: BC 組；b：NC 組；c: CXCR7-shRNA 組；d：各組細胞侵襲細胞數情況，與 BC 組及 NC 組比較，*P<0.05
3 討論
腫瘤的生長和轉移受到多因素的調節，其中趨化因子及其受體成為最近研究的熱點，特別是 SDF-1α 及其受體。既往研究[14]認為，SDF-1α 是通過其唯一受體 CXCR4 而發揮作用的。但有研究[5]發現，SDF-1α 還有另一受體 CXCR7，其與 SDF-1α 的親和性還明顯高于 CXCR4，由于這一研究成果的報道，人們開始重新審視 SDF-1α 的作用機制。CXCR7 已經證實在多種惡性腫瘤中有表達，包括肺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌和肝細胞癌[7, 15-18]；并且有研究[19]認為，CXCR7 高表達的胰腺癌預后較差。CXCR7 與腫瘤分級相關，并且在腫瘤的進展和分化中起著潛在的作用[20]。在筆者所在團隊之前的研究[11]中，發現胰腺癌組織中 CXCR7 的表達陽性率較正常胰腺組織明顯升高，并且 CXCR7 的陽性表達與淋巴結轉移相關，提示 CXCR7 可能參與胰腺癌的侵襲和轉移過程。
目前的研究表明，CXCR7 在癌細胞趨化性中的作用仍然存在爭議。一些研究認為，CXCR7 不能通過 SDF-1α 介導趨化性[3, 21]，然而其他的一些報道則提示 CXCR7 能通過 SDF-1α 觸發癌細胞的趨化性[22-23]。Wang 等[16]研究發現，過表達 CXCR7 的前列腺癌細胞黏附于人真皮微血管內皮細胞的細胞數明顯高于對照組，并且在 SDF-1α 存在的條件下，過表達 CXCR7 細胞的侵襲能力也比對照組要高；CXCR7 通過調節細胞黏附分子 FN1、CDH11、CD44 及基質金屬蛋白酶從而增強腫瘤細胞的侵襲性和轉移能力。本研究發現，沉默 CXCR7 表達可抑制 AsPC-1 細胞的侵襲能力。總的來說，這些結果提示，SDF-1α 可通過 CXCR7 調節 AsPC-1 細胞的定向遷移和侵襲。
本研究通過 MTT 法分析敲除 CXCR7 后觀察 AsPC-1 細胞增殖能力的變化，結果發現，抑制 AsPC-1 細胞中 CXCR7 的表達后，AsPC-1 細胞的增殖能力明顯降低，提示 CXCR7 在促進 AsPC-1 增殖中發揮了重要作用，這與前期報道 CXCR7 促進乳腺癌[24]、前列腺癌[16] 及肝細胞癌[9]增殖基本一致。但也有人[25]報道，SDF-1α 的表達抑制人胰腺癌的增殖和轉移。目前關于 CXCR7 促進腫瘤增殖的作用機制尚不明確，在未來的研究中我們將進一步探討 SDF-1α/CXCR7 促進胰腺癌細胞增殖的作用機制。
本研究發現，AsPC-1 細胞在敲除 CXCR7 后休眠于 G0/G1 期，增殖受抑制且凋亡率增加。細胞周期由蛋白激酶復合物調節[26]，這些激酶功能的異常會導致細胞周期失調，從而導致細胞增殖及凋亡的異常。Liu 等[27]報道了甲狀腺癌細胞在敲除 CXCR7 后休眠于 S 期，并且與細胞周期蛋白 A-CDK2-PCNA 的減少和 P21 及 P57 表達水平增加有關。提示 CXCR7 可通過調節細胞周期蛋白來控制細胞周期。
綜上所述，CXCR7 與胰腺癌細胞的惡性行為密切相關。本研究通過體外模型證實，抑制胰腺癌細胞 AsPC-1 中 CXCR7 的表達，可以抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力，誘導細胞休眠于 G0/G1 期，并且促進細胞凋亡。總之，這些研究數據表明，CXCR7 在調節 AsPC-1 細胞的增殖和侵襲能力中扮演著重要的角色，CXCR7 可能成為胰腺癌治療新的靶點。
