引用本文： 孫丹, 陶利平, 李驍, 盧靜, 耿沖, 王春暉. 塞來昔布對 SGC-7901 人胃癌細胞 NHE1 表達及細胞內 pH 的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(4): 420-425. doi: 10.7507/1007-9424.201611052 復制
胃癌（gastric carcinoma）為胃上皮細胞來源的惡性腫瘤，是最常見的惡性腫瘤之一，居癌癥發病率第 4 位，位居全球癌癥死亡原因第 2 位[1]。環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）因為通過促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡、促進新生血管形成和加速基質降解，在腫瘤的發生、發展及轉移方面發揮作用而成為腫瘤研究的熱點。現有研究[2-3]已證實，選擇性 COX-2 抑制劑可有效抑制胃癌的進展。
鈉氫交換體（Na+-H+exchanger，NHE）是存在于所有脊椎動物細胞的跨膜蛋白，主要作用為調節細胞內 pH 值（pHi）、穩定細胞容量及影響細胞離子轉運，NHE1 為目前研究最為透徹的一個亞型。生理情況下，NHE 發揮的作用很小，但是在缺血缺氧情況下或在腫瘤細胞內，因細胞內大量 H+ 潴留導致多種信號通路上調而激活 NHE 系統。所以，盡管腫瘤細胞本身存在糖酵解優勢，導致腫瘤細胞內產生大量乳酸和 H+，但是核磁共振波譜技術證明腫瘤細胞的 pHi 為中性或偏堿性。本研究旨在觀察塞來昔布對細胞增殖的影響，并測定不同濃度的塞來昔布干預后 NHE1 表達和 pHi 改變情況，以明確塞來昔布是否通過影響 pHi 水平而抑制胃癌細胞的生長。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞株
人胃腺癌細胞株 SGC-7901 由四川大學華西醫院多肽實驗室惠贈。
1.2 主要材料及設備
主要材料包括 BCECF-AM 及 MTT（碧云天公司），塞來昔布及尼日利亞菌素（Sigma 公司），0.25% 胰酶、雙抗（青霉素+鏈霉素）及 RPMI 1640 培養基（Hyclone 公司），DMSO（Amresco 公司），兔抗人 NHE1 抗體（Abcam 公司），β-actin 抗體（北京博奧森公司），山羊抗兔抗體及 ECL 化學發光試劑盒（中山金橋公司），標準胎牛血清（FBS，上海復蒙公司）。主要儀器包括臺式離心機（Heraeus 公司），CO2 培養箱（SANYO 公司），酶標儀（BIO-RAD 公司），倒置顯微鏡、普通光學顯微鏡及共聚焦熒光顯微鏡（Olympus 公司），Western blot 成像系統（BIO-RAD 公司）。
1.3 實驗分組及方案設計
1.3.1 塞來昔布對人胃癌細胞 SGC-7901 生長的影響 SGC-7901 細胞用 RPMI 1640 完全培養基，在含 5% CO2、37 ℃ 孵箱中培養至 80% 以上融合，胰酶消化、完全培養基制成細胞懸液后接種于 96 孔板中，每孔（2～3）×103 個細胞。接種好的 96 孔板放于孵箱中繼續培養 24 h 后，使用無血清 RPMI 1640 培養基饑餓 24 h 后，換用事先配置的含不同濃度（5、12.5、25、50、75 及 100 μmol/L）塞來昔布的培養基繼續培養，每濃度設 5 個復孔，分別培養 24 h、48 h 和 72 h 后使用 MTT 法測定塞來昔布對 SGC-7901 細胞增殖的影響。實驗同時設置無水 DMSO 對照組（1 μL/100 μL）和 5 個空白孔。每組進行 MTT 測定前均于倒置顯微鏡下觀察細胞形態并攝片。
1.3.2 NHE1 蛋白表達及 pHi 變化干預分組設計 用不同濃度（5、12.5、25、50 及 75 μmol/L）的塞來昔布干預 SGC-7901 細胞 24 h，每組 3 個獨立樣本。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 MTT 法測定 SGC-7901 細胞活力 向 96 孔板中相應孔內加入 MTT 溶液（5 mg/mL） 10 μL/孔，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱孵育 4 h 后，每孔加入 100 μL Formazan 溶解液（Formazan dissolving solution）。孵箱中繼續孵育 4 h 后，上酶標儀檢測，選擇 570 nm 波長讀取吸光度值（A 值），計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）=（1–實驗組A 值/對照組A 值）×100%。每組實驗重復 3 次，取均值。
1.4.2 Western blot 法測定 SGC-7901 細胞的 NHE1 表達 采用 BCA 試劑盒提取總蛋白并測定蛋白質濃度，取 30 μg/孔蛋白質上樣，在 100 V 電壓下電泳至溴酚藍遷移到分離膠底部；清水洗滌之后進行轉膜；轉膜結束后，用含 5% 脫脂奶粉的 TBST（Tris Buffered Saline and Tween 20）溶液封閉 2 h 后，將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于 TBST 溶液中洗滌，然后分別放入 1∶200 稀釋的兔抗人 NHE1 抗體和 1∶2 000 稀釋的 β-actin 抗體 4 ℃ 過夜；將 PVDF 膜用 TBST 洗滌 3 次，然后同 1∶5 000 稀釋的山羊抗兔二抗共同孵育 2 h；將 PVDF 膜用 TBST 洗滌 4 次后進行顯色；采用凝膠分析軟件 Quantity One 進行結果分析。
1.4.3 pHi 測定 將細胞懸液接種在 24 孔板〔（0.5～1.0）×104 個細胞/孔〕及 6 孔板〔（2～4） ×104 個細胞/孔〕中培養過夜（棄去外周一圈不用）；實驗前用羥乙基哌嗪乙硫磺酸〔2-[4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid，HEPES〕緩沖液（NaCl 142 mmol/L；KCl 3 mmol/L；MgSO4 1 mmol/L；HEPES 20 mmol/L；葡萄糖 10 mmol/L；0.2% 白蛋白，調節 pH 至 7.4）漂洗 2 次；用 HEPES 緩沖液配制濃度為 2 mmol/L 的 BCECF-AM 熒光染料，加入 24 孔板內，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱內孵育 30 min；吸出 HEPES 緩沖液，使用 3-嗎啉基丙磺酸〔3-（morpho-lino）propanesulfonic acid，MOPS〕緩沖液（KCl 130 mmol/L；NaCl 10 mmol/L；MgSO4 1 mmol/L；MOPS 10 mmol/L）漂洗 2 次；加入含有尼日利亞菌素但 pH 值不同的 MOPS 緩沖液，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱內孵育 5 min；在共聚焦熒光顯微鏡下選擇細胞分布和熒光染料均勻的視野，以 488 nm 為激發波長，發射波長為 530 nm，每孔拍攝 5 個視野，每個視野內以 3 個較獨立細胞為一組，每個視野計算 3 組，計算其平均熒光強度；將檢測出的熒光強度與相應緩沖液的 pH 值進行相關性分析，制定出標準曲線，測得不同 pH 值對應的細胞內熒光強度。
對照組及塞來昔布干預組細胞的準備同標準曲線制備，僅將含尼日利亞菌素的 MOPS 緩沖液換為 HEPES 緩沖液，上機檢測。根據測得的熒光強度在標準曲線上計算出相應的 pH 值。重復 3 次實驗。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料采用均數+標準差（ ）表示，對各組數據先進行正態性檢驗與方差齊性檢驗，采用單因素方差分析的方法，兩兩比較采用q 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MTT 法測定塞來昔布對 SGC-7901 細胞增殖的抑制作用
低濃度塞來昔布（5 μmol/L）對 SGC-7901 細胞增殖無明顯抑制作用（P>0.05），塞來昔布濃度越高（12.5～100 μmol/L），其對 SGC-7901 細胞增殖的抑制作用越明顯（P<0.05），且各濃度組之間差異具有統計學意義（P<0.05）。干預 24 h、48 h 及 72 h 后，同一藥物濃度其增殖抑制作用逐漸增強（圖 1）。100 μmol/L 塞來昔布干預 72 h 后 SGS-7901 細胞增殖抑制率達 97%（圖 1）。
圖1
示不同濃度的塞來昔布干預 24 h、48 h 及 72 h 后 SGC-7901 細胞增殖抑制率檢測結果
2.2 塞來昔布對 SGC-7901 細胞 NHE1 表達的影響
5 μmol/L 組塞來昔布干預 SGC-7901 細胞 24 h 后，其 NHE1 表達與 DMSO 對照組相比差異無統計學意義（P>0.05）；12.5、25、50 及 75 μmol/L 塞來昔布干預 SGC-7901 細胞 24 h 后與 DMSO 對照組比較，其 NHE1 表達均下調，其中 75 μmol/L 組 NHE1 表達下調最明顯，其差異具有統計學意義（P<0.05），且各濃度組之間比較差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖 2～圖 3。該結果提示，隨著塞來昔布濃度的逐漸增加，其對 SGC-7901細胞 NHE1 表達的抑制作用逐漸增強。
圖2
示 Western blot 法檢測 SGC-7901 細胞 NHE1 表達電泳圖。 1：DMSO 對照組；2：5 μmol/L 組；3：12.5 μmol/L 組；4：25 μmol/L 組；5：50 μmol/L 組；6：75 μmol/L 組
圖3
示 Western blot 法檢測不同濃度塞來昔布干預 24 h 后 SGC-7901 細胞 NHE1 表達檢測結果。 與 DMSO 對照組（0 μmol/L）比較，*P<0.05
2.3 塞來昔布干預前后 SGC-7901 細胞 pHi 的變化
2.3.1 pHi 標準曲線 不同 pH 值緩沖液培育后的 SGC-7901 細胞，通過共聚焦顯微鏡在激發波長為 488 nm 處檢測出的平均熒光強度，與其對應 pH 值緩沖液的 BCECF-AM 熒光強度進行相關性分析，繪制出 SGC-7901 細胞 pHi 的標準曲線見圖 4。其結果提示，pHi（X）與細胞熒光強度（Y）之間呈線性相關，其回歸方程為 X=（Y+4057.8）/987.5（R2=0.9718）。
圖4
示 pHi 的標準曲線圖
2.3.2 塞來昔布對 SGC-7901 細胞 pHi 的影響 使用共聚焦熒光顯微鏡檢測各濃度組細胞的 BCECF-AM 熒光強度（圖 5），根據標準曲線方程，求得其對應的 pHi 值（圖 6）。結果表明，5 μmol/L 濃度組與 DMSO 對照組的 pHi 比較，差異無統計學意義（P>0.05），12.5 μmol/L 組、25 μmol/L 組、50 μmol/L 組及 75 μmol/L 組其 pHi 值逐漸下降，與 DMSO 對照組比較，差異具有統計學意義（P<0.05），同時各濃度組之間比較，差異亦有統計學意義（P<0.05）。
圖5
示不同濃度組細胞的 BCECF-AM 熒光強度。 a：DMSO 對照組；b：5 μmol/L 組；c：12.5 μmol/L 組；d：25 μmol/L 組；e：50 μmol/L 組；f：75 μmol/L 組
圖6
示不同濃度塞來昔布干預 24 h 后 SGC-7901 細胞 pHi 檢測結果。 與 DMSO 對照組（0 μmol/L）比較，*P<0.05；各濃度組間比較，#P<0.05
3 討論
pHi 穩態對于維持細胞的正常生理功能至關重要。細胞內酶的活性及細胞生長分化速度都與 pHi 密切相關。人體細胞的 pHi 值受到多種離子轉運蛋白的調控，主要包括：Na+-H+ 交換體（NHE）、生電性的 Na+-HCO3– 共同轉運通道、Na+ 依賴的與 Na+ 非依賴的 Cl–-HCO3– 交換泵、H+-乳酸通道和 H+-ATP 酶通道，它們彼此之間相互作用，共同維持著 pHi 的平衡狀態。在生理情況下，NHE 作用較小，而在缺血缺氧的情況下或腫瘤細胞內，由于細胞內大量 H+ 的潴留，從而導致多種信號通路上調并激活 NHE 系統，將細胞內的H+ 泵出細胞外，使得腫瘤細胞內呈特殊的堿性環境，有利于腫瘤細胞的惡性增殖[4]。
已有研究[5-7]證實，靶向 COX-2 途徑在預防和治療實體腫瘤方面有非常重要的意義。COX-2 抑制劑的抗腫瘤作用可能通過本身環氧合酶的作用實現，并且對其下游效應物也存在著調節作用[8]。癌基因、生長因子、細胞因子、化學治療、腫瘤誘發因素等均可通過激活蛋白激酶 C（PKC）增加 COX-2 轉錄。已有研究[9]發現，惡性腫瘤或癌前期病變中的 COX-2 呈高表達現象。COX-2 的高表達預示了在這些組織中轉錄 mRNA 的穩定增加狀態[10-11]。在惡性腫瘤的發生、發展過程中，COX-2 可以促進基質代謝、抑制凋亡、加速細胞增生、促進血管生成，增加其腫瘤侵襲性及抑制機體免疫。塞來昔布作為 COX-2 抑制劑，主要通過抑制 COX-2 的表達和活性達到抗腫瘤的目的。非甾體類抗炎藥物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）抗腫瘤作用的可能機制有：① 抑制 COX-2 活性及前列腺素（PG）的合成，發揮抗腫瘤作用[12]；② 影響細胞的增殖周期、促進腫瘤細胞凋亡[13-14]；③ 通過血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制腫瘤血管生成[15-17]；④ 通過調節上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）抑制腫瘤的侵襲及轉移[18-19]。盡管如此，COX-2 抑制劑抑制腫瘤細胞生長的機制仍然沒有完全闡明。
本研究發現，塞來昔布干預后，胃癌 SGC-7901 細胞增殖明顯被抑制。此外，Western blot 技術檢測還發現，塞來昔布干預后 SGC-7901 細胞 NHE1 蛋白表達下調，其作用與藥物呈濃度依賴性。使用 BCECF-AM 熒光探針，采用激光共聚焦熒光顯微鏡測定 pHi，其結果顯示，塞來昔布能影響 SGC-7901 細胞的 pHi 水平，說明塞來昔布不僅影響 NHE1 表達，也影響其功能。從而進一步證實，在腫瘤細胞中，對 pHi 調節起到關鍵作用的為 NHE1。結合文獻[20]報道，NHE1 在胃癌細胞生長中發揮調節作用，抑制 NHE1 表達可抑制胃癌細胞生長。塞來昔布作用于結腸癌細胞以及小鼠結腸癌模型后，NHE1 表達明顯下降，pHi 亦明顯下降，存在腫瘤細胞內酸化現象[21-22]。推測塞來昔布可能通過抑制 Na+-H+ 交換功能，使得腫瘤細胞因糖酵解產生的大量氫離子無法正常排出，本來堿性的細胞內液酸化，從而改變了胃癌細胞內微環境，使大部分胃癌細胞停止增殖。塞來昔布對 SGC-7901 細胞 NHE1 蛋白表達的影響是通過 COX-2 依賴性還是 COX-2 非依賴性途徑實現，尚需進一步研究證明。
本實驗結果提示，酸化細胞內微環境的藥物可能有助于腫瘤治療。目前，針對調節 pH 的膜轉運蛋白的相關藥物取得了一些可喜的結果，比如 NHE1 反向交換體，這可能是治療腫瘤的有力工具[23]。多種藥物與細胞的結合是 pH 依賴的，親脂性的抗癌藥物在腫瘤細胞中的分布與累積劑量受到細胞膜內外 pH 梯度的影響。因此，細胞內的 pH 梯度可為化療藥物的選擇提供基礎[24]，并且和腫瘤選擇性化療相關[25]。這些結果均說明，通過調節腫瘤細胞內的 pH 有助于腫瘤的治療。隨著對腫瘤生物學的深入認識，將化學治療和分子靶向治療有機結合，胃癌的治療前景會更加廣闊。
胃癌（gastric carcinoma）為胃上皮細胞來源的惡性腫瘤，是最常見的惡性腫瘤之一，居癌癥發病率第 4 位，位居全球癌癥死亡原因第 2 位[1]。環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）因為通過促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡、促進新生血管形成和加速基質降解，在腫瘤的發生、發展及轉移方面發揮作用而成為腫瘤研究的熱點。現有研究[2-3]已證實，選擇性 COX-2 抑制劑可有效抑制胃癌的進展。
鈉氫交換體（Na+-H+exchanger，NHE）是存在于所有脊椎動物細胞的跨膜蛋白，主要作用為調節細胞內 pH 值（pHi）、穩定細胞容量及影響細胞離子轉運，NHE1 為目前研究最為透徹的一個亞型。生理情況下，NHE 發揮的作用很小，但是在缺血缺氧情況下或在腫瘤細胞內，因細胞內大量 H+ 潴留導致多種信號通路上調而激活 NHE 系統。所以，盡管腫瘤細胞本身存在糖酵解優勢，導致腫瘤細胞內產生大量乳酸和 H+，但是核磁共振波譜技術證明腫瘤細胞的 pHi 為中性或偏堿性。本研究旨在觀察塞來昔布對細胞增殖的影響，并測定不同濃度的塞來昔布干預后 NHE1 表達和 pHi 改變情況，以明確塞來昔布是否通過影響 pHi 水平而抑制胃癌細胞的生長。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞株
人胃腺癌細胞株 SGC-7901 由四川大學華西醫院多肽實驗室惠贈。
1.2 主要材料及設備
主要材料包括 BCECF-AM 及 MTT（碧云天公司），塞來昔布及尼日利亞菌素（Sigma 公司），0.25% 胰酶、雙抗（青霉素+鏈霉素）及 RPMI 1640 培養基（Hyclone 公司），DMSO（Amresco 公司），兔抗人 NHE1 抗體（Abcam 公司），β-actin 抗體（北京博奧森公司），山羊抗兔抗體及 ECL 化學發光試劑盒（中山金橋公司），標準胎牛血清（FBS，上海復蒙公司）。主要儀器包括臺式離心機（Heraeus 公司），CO2 培養箱（SANYO 公司），酶標儀（BIO-RAD 公司），倒置顯微鏡、普通光學顯微鏡及共聚焦熒光顯微鏡（Olympus 公司），Western blot 成像系統（BIO-RAD 公司）。
1.3 實驗分組及方案設計
1.3.1 塞來昔布對人胃癌細胞 SGC-7901 生長的影響 SGC-7901 細胞用 RPMI 1640 完全培養基，在含 5% CO2、37 ℃ 孵箱中培養至 80% 以上融合，胰酶消化、完全培養基制成細胞懸液后接種于 96 孔板中，每孔（2～3）×103 個細胞。接種好的 96 孔板放于孵箱中繼續培養 24 h 后，使用無血清 RPMI 1640 培養基饑餓 24 h 后，換用事先配置的含不同濃度（5、12.5、25、50、75 及 100 μmol/L）塞來昔布的培養基繼續培養，每濃度設 5 個復孔，分別培養 24 h、48 h 和 72 h 后使用 MTT 法測定塞來昔布對 SGC-7901 細胞增殖的影響。實驗同時設置無水 DMSO 對照組（1 μL/100 μL）和 5 個空白孔。每組進行 MTT 測定前均于倒置顯微鏡下觀察細胞形態并攝片。
1.3.2 NHE1 蛋白表達及 pHi 變化干預分組設計 用不同濃度（5、12.5、25、50 及 75 μmol/L）的塞來昔布干預 SGC-7901 細胞 24 h，每組 3 個獨立樣本。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 MTT 法測定 SGC-7901 細胞活力 向 96 孔板中相應孔內加入 MTT 溶液（5 mg/mL） 10 μL/孔，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱孵育 4 h 后，每孔加入 100 μL Formazan 溶解液（Formazan dissolving solution）。孵箱中繼續孵育 4 h 后，上酶標儀檢測，選擇 570 nm 波長讀取吸光度值（A 值），計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）=（1–實驗組A 值/對照組A 值）×100%。每組實驗重復 3 次，取均值。
1.4.2 Western blot 法測定 SGC-7901 細胞的 NHE1 表達 采用 BCA 試劑盒提取總蛋白并測定蛋白質濃度，取 30 μg/孔蛋白質上樣，在 100 V 電壓下電泳至溴酚藍遷移到分離膠底部；清水洗滌之后進行轉膜；轉膜結束后，用含 5% 脫脂奶粉的 TBST（Tris Buffered Saline and Tween 20）溶液封閉 2 h 后，將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于 TBST 溶液中洗滌，然后分別放入 1∶200 稀釋的兔抗人 NHE1 抗體和 1∶2 000 稀釋的 β-actin 抗體 4 ℃ 過夜；將 PVDF 膜用 TBST 洗滌 3 次，然后同 1∶5 000 稀釋的山羊抗兔二抗共同孵育 2 h；將 PVDF 膜用 TBST 洗滌 4 次后進行顯色；采用凝膠分析軟件 Quantity One 進行結果分析。
1.4.3 pHi 測定 將細胞懸液接種在 24 孔板〔（0.5～1.0）×104 個細胞/孔〕及 6 孔板〔（2～4） ×104 個細胞/孔〕中培養過夜（棄去外周一圈不用）；實驗前用羥乙基哌嗪乙硫磺酸〔2-[4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid，HEPES〕緩沖液（NaCl 142 mmol/L；KCl 3 mmol/L；MgSO4 1 mmol/L；HEPES 20 mmol/L；葡萄糖 10 mmol/L；0.2% 白蛋白，調節 pH 至 7.4）漂洗 2 次；用 HEPES 緩沖液配制濃度為 2 mmol/L 的 BCECF-AM 熒光染料，加入 24 孔板內，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱內孵育 30 min；吸出 HEPES 緩沖液，使用 3-嗎啉基丙磺酸〔3-（morpho-lino）propanesulfonic acid，MOPS〕緩沖液（KCl 130 mmol/L；NaCl 10 mmol/L；MgSO4 1 mmol/L；MOPS 10 mmol/L）漂洗 2 次；加入含有尼日利亞菌素但 pH 值不同的 MOPS 緩沖液，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱內孵育 5 min；在共聚焦熒光顯微鏡下選擇細胞分布和熒光染料均勻的視野，以 488 nm 為激發波長，發射波長為 530 nm，每孔拍攝 5 個視野，每個視野內以 3 個較獨立細胞為一組，每個視野計算 3 組，計算其平均熒光強度；將檢測出的熒光強度與相應緩沖液的 pH 值進行相關性分析，制定出標準曲線，測得不同 pH 值對應的細胞內熒光強度。
對照組及塞來昔布干預組細胞的準備同標準曲線制備，僅將含尼日利亞菌素的 MOPS 緩沖液換為 HEPES 緩沖液，上機檢測。根據測得的熒光強度在標準曲線上計算出相應的 pH 值。重復 3 次實驗。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料采用均數+標準差（ ）表示，對各組數據先進行正態性檢驗與方差齊性檢驗，采用單因素方差分析的方法，兩兩比較采用q 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MTT 法測定塞來昔布對 SGC-7901 細胞增殖的抑制作用
低濃度塞來昔布（5 μmol/L）對 SGC-7901 細胞增殖無明顯抑制作用（P>0.05），塞來昔布濃度越高（12.5～100 μmol/L），其對 SGC-7901 細胞增殖的抑制作用越明顯（P<0.05），且各濃度組之間差異具有統計學意義（P<0.05）。干預 24 h、48 h 及 72 h 后，同一藥物濃度其增殖抑制作用逐漸增強（圖 1）。100 μmol/L 塞來昔布干預 72 h 后 SGS-7901 細胞增殖抑制率達 97%（圖 1）。
圖1
示不同濃度的塞來昔布干預 24 h、48 h 及 72 h 后 SGC-7901 細胞增殖抑制率檢測結果
2.2 塞來昔布對 SGC-7901 細胞 NHE1 表達的影響
5 μmol/L 組塞來昔布干預 SGC-7901 細胞 24 h 后，其 NHE1 表達與 DMSO 對照組相比差異無統計學意義（P>0.05）；12.5、25、50 及 75 μmol/L 塞來昔布干預 SGC-7901 細胞 24 h 后與 DMSO 對照組比較，其 NHE1 表達均下調，其中 75 μmol/L 組 NHE1 表達下調最明顯，其差異具有統計學意義（P<0.05），且各濃度組之間比較差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖 2～圖 3。該結果提示，隨著塞來昔布濃度的逐漸增加，其對 SGC-7901細胞 NHE1 表達的抑制作用逐漸增強。
圖2
示 Western blot 法檢測 SGC-7901 細胞 NHE1 表達電泳圖。 1：DMSO 對照組；2：5 μmol/L 組；3：12.5 μmol/L 組；4：25 μmol/L 組；5：50 μmol/L 組；6：75 μmol/L 組
圖3
示 Western blot 法檢測不同濃度塞來昔布干預 24 h 后 SGC-7901 細胞 NHE1 表達檢測結果。 與 DMSO 對照組（0 μmol/L）比較，*P<0.05
2.3 塞來昔布干預前后 SGC-7901 細胞 pHi 的變化
2.3.1 pHi 標準曲線 不同 pH 值緩沖液培育后的 SGC-7901 細胞，通過共聚焦顯微鏡在激發波長為 488 nm 處檢測出的平均熒光強度，與其對應 pH 值緩沖液的 BCECF-AM 熒光強度進行相關性分析，繪制出 SGC-7901 細胞 pHi 的標準曲線見圖 4。其結果提示，pHi（X）與細胞熒光強度（Y）之間呈線性相關，其回歸方程為 X=（Y+4057.8）/987.5（R2=0.9718）。
圖4
示 pHi 的標準曲線圖
2.3.2 塞來昔布對 SGC-7901 細胞 pHi 的影響 使用共聚焦熒光顯微鏡檢測各濃度組細胞的 BCECF-AM 熒光強度（圖 5），根據標準曲線方程，求得其對應的 pHi 值（圖 6）。結果表明，5 μmol/L 濃度組與 DMSO 對照組的 pHi 比較，差異無統計學意義（P>0.05），12.5 μmol/L 組、25 μmol/L 組、50 μmol/L 組及 75 μmol/L 組其 pHi 值逐漸下降，與 DMSO 對照組比較，差異具有統計學意義（P<0.05），同時各濃度組之間比較，差異亦有統計學意義（P<0.05）。
圖5
示不同濃度組細胞的 BCECF-AM 熒光強度。 a：DMSO 對照組；b：5 μmol/L 組；c：12.5 μmol/L 組；d：25 μmol/L 組；e：50 μmol/L 組；f：75 μmol/L 組
圖6
示不同濃度塞來昔布干預 24 h 后 SGC-7901 細胞 pHi 檢測結果。 與 DMSO 對照組（0 μmol/L）比較，*P<0.05；各濃度組間比較，#P<0.05
3 討論
pHi 穩態對于維持細胞的正常生理功能至關重要。細胞內酶的活性及細胞生長分化速度都與 pHi 密切相關。人體細胞的 pHi 值受到多種離子轉運蛋白的調控，主要包括：Na+-H+ 交換體（NHE）、生電性的 Na+-HCO3– 共同轉運通道、Na+ 依賴的與 Na+ 非依賴的 Cl–-HCO3– 交換泵、H+-乳酸通道和 H+-ATP 酶通道，它們彼此之間相互作用，共同維持著 pHi 的平衡狀態。在生理情況下，NHE 作用較小，而在缺血缺氧的情況下或腫瘤細胞內，由于細胞內大量 H+ 的潴留，從而導致多種信號通路上調并激活 NHE 系統，將細胞內的H+ 泵出細胞外，使得腫瘤細胞內呈特殊的堿性環境，有利于腫瘤細胞的惡性增殖[4]。
已有研究[5-7]證實，靶向 COX-2 途徑在預防和治療實體腫瘤方面有非常重要的意義。COX-2 抑制劑的抗腫瘤作用可能通過本身環氧合酶的作用實現，并且對其下游效應物也存在著調節作用[8]。癌基因、生長因子、細胞因子、化學治療、腫瘤誘發因素等均可通過激活蛋白激酶 C（PKC）增加 COX-2 轉錄。已有研究[9]發現，惡性腫瘤或癌前期病變中的 COX-2 呈高表達現象。COX-2 的高表達預示了在這些組織中轉錄 mRNA 的穩定增加狀態[10-11]。在惡性腫瘤的發生、發展過程中，COX-2 可以促進基質代謝、抑制凋亡、加速細胞增生、促進血管生成，增加其腫瘤侵襲性及抑制機體免疫。塞來昔布作為 COX-2 抑制劑，主要通過抑制 COX-2 的表達和活性達到抗腫瘤的目的。非甾體類抗炎藥物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）抗腫瘤作用的可能機制有：① 抑制 COX-2 活性及前列腺素（PG）的合成，發揮抗腫瘤作用[12]；② 影響細胞的增殖周期、促進腫瘤細胞凋亡[13-14]；③ 通過血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制腫瘤血管生成[15-17]；④ 通過調節上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）抑制腫瘤的侵襲及轉移[18-19]。盡管如此，COX-2 抑制劑抑制腫瘤細胞生長的機制仍然沒有完全闡明。
本研究發現，塞來昔布干預后，胃癌 SGC-7901 細胞增殖明顯被抑制。此外，Western blot 技術檢測還發現，塞來昔布干預后 SGC-7901 細胞 NHE1 蛋白表達下調，其作用與藥物呈濃度依賴性。使用 BCECF-AM 熒光探針，采用激光共聚焦熒光顯微鏡測定 pHi，其結果顯示，塞來昔布能影響 SGC-7901 細胞的 pHi 水平，說明塞來昔布不僅影響 NHE1 表達，也影響其功能。從而進一步證實，在腫瘤細胞中，對 pHi 調節起到關鍵作用的為 NHE1。結合文獻[20]報道，NHE1 在胃癌細胞生長中發揮調節作用，抑制 NHE1 表達可抑制胃癌細胞生長。塞來昔布作用于結腸癌細胞以及小鼠結腸癌模型后，NHE1 表達明顯下降，pHi 亦明顯下降，存在腫瘤細胞內酸化現象[21-22]。推測塞來昔布可能通過抑制 Na+-H+ 交換功能，使得腫瘤細胞因糖酵解產生的大量氫離子無法正常排出，本來堿性的細胞內液酸化，從而改變了胃癌細胞內微環境，使大部分胃癌細胞停止增殖。塞來昔布對 SGC-7901 細胞 NHE1 蛋白表達的影響是通過 COX-2 依賴性還是 COX-2 非依賴性途徑實現，尚需進一步研究證明。
本實驗結果提示，酸化細胞內微環境的藥物可能有助于腫瘤治療。目前，針對調節 pH 的膜轉運蛋白的相關藥物取得了一些可喜的結果，比如 NHE1 反向交換體，這可能是治療腫瘤的有力工具[23]。多種藥物與細胞的結合是 pH 依賴的，親脂性的抗癌藥物在腫瘤細胞中的分布與累積劑量受到細胞膜內外 pH 梯度的影響。因此，細胞內的 pH 梯度可為化療藥物的選擇提供基礎[24]，并且和腫瘤選擇性化療相關[25]。這些結果均說明，通過調節腫瘤細胞內的 pH 有助于腫瘤的治療。隨著對腫瘤生物學的深入認識，將化學治療和分子靶向治療有機結合，胃癌的治療前景會更加廣闊。
