引用本文： 伍剛, 鄭波, 黃銳, 楊訓. HBx 下調 miR-16 家族表達促進肝癌細胞惡性轉化. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(4): 412-419. doi: 10.7507/1007-9424.201611043 復制
慢性乙肝病毒感染是亞洲及西非地區肝細胞癌（簡稱肝癌）的主要病因，而乙肝病毒陽性的肝癌相比于陰性者在臨床進程中表現出更為激進的生物學特點[1]。乙型肝炎病毒 X（hepatitis B virus X protein，HBx）蛋白是由 HBV 所編碼的一種反式激活多功能蛋白，高表達于大部分肝癌組織中，其能在體外促進肝細胞惡性轉化，且能導致小鼠 HCC 發生[2]。miRNA 作為基因組的轉錄產物，雖不編碼蛋白，但通過沉默靶標蛋白表達而廣泛參與人類各種疾病尤其是腫瘤的發生和進展。根據 miRNA 在特定腫瘤組織中的高/低表達相應地將其稱之為促/抑癌 miRNA[3]。基因組中位置變化如斷裂/重排，轉錄水平的表觀遺傳修飾如甲基化（轉錄因子調控）以及 miRNA 加工過程變化均可導致 miRNA 自身的表達變化[4]。因此，miRNA 與轉錄因子等可形成復雜的調控網絡進而參與腫瘤的發生及進展。
本研究將肝癌的始動因素 HBx 和 miRNA 聯系在一起，將 HBx 的多功能調控作用拓展到非編碼 RNA 領域，從 miRNA 這一重要的表觀遺傳分子來探討 HBx 促進肝癌發生和進展的分子機制，為臨床治療乙肝相關肝癌提供新思路。
1 材料和方法
1.1 主要試劑和材料
PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒（Takara 生物科技公司，大連，中國）。HBx 和 β-actin 的實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）實驗利用 SYBR PrimeScript RT-PCR 試劑盒完成（Takara 生物科技公司）。U6、miR-15a、miR-15b 和 miR-16 的 qRT-PCR 檢測盒購自上海吉瑪公司（GenePharma，上海）。Western blot 所用的抗體分別是 HBx（sc-71239；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），β-actin（sc-130301；Santa Cruz），c-myc〔9402；Cell Signaling Technology，Boston，MA，USA〕，CCND1（2926；Cell Signaling Technology），and GAPDH （BA2913；博士德，武漢）。miR-16 抑制物、miR-15a/-16 的模擬物、c-myc 特異的 siRNA 及所有的陰性對照（negative control，NC）參照均購自上海吉瑪公司。
1.2 細胞培養
人肝癌細胞系 HepG2、SK-HEP-1 和 Huh7 購自 ATCC 細胞庫并培養于添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中。空載體對照 HepG2-vc 細胞、單克隆篩選穩定表達 HBx 的 HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 細胞除常規培養外額外添加 500 ng/mL G418（Geneticin，遺傳霉素，默克公司），HepG2.2.15 細胞（穩定轉染整個 HBV 基因組的 HepG2 細胞，國外建系）常規培養外添加 380 ng/mL 的 G418。
1.3 siRNA 和質粒信息
將 HBx 開放閱讀框（Adr 亞型，AB299858，按 NCBI 序列由上海生工全序列合成）克隆到 PCDNA3.1 質粒中得到 PCDNA3.1-hbx 質粒。所有 RNA 核苷酸包括 miR-15a/16 的模擬物和抑制物、c-myc 特異的小干擾 RNA（si-myc）和相應的陰性對照均購自上海吉瑪公司。
1.4 細胞轉染
細胞轉染均按照 Lipo2000 試劑盒（invitrogen，美國）說明書進行。除 miR-16 抑制物（200 nmol/L），所有轉染濃度均為 50 nmol/L。
1.4.1 HBx 質粒瞬時轉染 分別取 1×106 個 HepG2、SK-HEP-1 和 Huh7 細胞置于 6 孔板中，利用 Lipo2000 轉染 2 μg PCDNA3.1 和 PCDNA3.1-hbx 質粒，48 h 收集細胞 RNA。
1.4.2 HBx 穩定表達的 HepG2 細胞單克隆挑選 HepG2 細胞轉染 PCDNA3.1-hbx 質粒和空載體 24 h 后，加入 900 ng/mL 的 G418 進行抗性篩選，挑選存活的單克隆細胞擴大培養（整合了 PCDNA3.1-hbx 質粒）。通過 qRT-PCR 和 Western blot 對多個單克隆細胞系進行 HBx mRNA 和蛋白表達檢測，最終獲得 HBx 穩定表達的 HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 細胞以及載體對照細胞 HepG2-vc。
1.5 qRT-PCR
細胞總 RNA 提取采用 TRIzol 試劑并經 DNase Ⅰ（Takara，大連） 處理，利用 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒合成 c-myc 的 cDNA，利用 SYBR PrimeScript RT-PCR 試劑盒檢測 c-myc 在 HepG2-hbx 細胞、HepG2-2.1 細胞和 HepG2.2.15 細胞中的表達情況，以 HepG2-vc 細胞作為對照。
將 si-myc 瞬時轉染 HepG2-hbx 細胞，觀察轉染后 24、28、72 及 96 h 后 miR-15a、miR-16 和 c-myc 的表達情況，以 NC 轉染組作為對照。
miR-15a，miR-15b 和 miR-16 在肝癌細胞系中的表達均采用上海吉瑪公司提供的特定 qRT-PCR 檢測盒，U6 小分子 RNA 作為內參照。
1.6 免疫印跡
采用 RIPA 液（碧云天，海門）裂解提取肝癌細胞總蛋白，HBx、c-myc 和 CCND1 的 Western blot 檢測按相應試劑盒說明進行。
1.7 細胞增殖、細胞凋亡及細胞周期檢測
1.7.1 細胞增殖檢測 CCK-8 試劑盒（CCK-8，同仁化學，日本）用于細胞增殖檢測。① 球囊培養方法：取 1 000 個/mL 的 HepG2-vc 和 HepG2-hbx 細胞懸液培養于無血清的 DMEM-F12 中（添加 1∶50 的 B27 無血清培養基添加因子、20 ng/mL 表皮生長因子、0.4% 的牛血清白蛋白和 4 mg/mL 的胰島素），培養 10～14 d 后顯微鏡下觀察計數。② 克隆形成實驗：miR-15a 和 miR-16 模擬物轉染 24 h 后，分別取 500 個有活力的 HepG2-hbx 細胞和 1 000 個 HepG2.2.15 細胞置于添加 10 mL 完全培養基的 6 cm 培養皿中培養 2～3 周。③ 利用亞甲基藍進行克隆染色完成克隆形成實驗，NC 轉染組作為對照。
1.7.2 細胞凋亡檢測 NC 和 miR-15a/16 mimic 轉染后 48 h，采用 Annexin V-FITC 試劑盒（Bender MedSystems，維也納，奧地利）在流式細胞儀上完成細胞凋亡檢測。根據轉染后 24、48、72 及 96 h 的吸光度值（A 值）繪制細胞生長曲線。
1.7.3 細胞周期檢測 HepG2-hbx 肝癌細胞轉染 mimic 及 NC 24 h 后再加入 100 ng/mL 諾考達唑（nocodazole）處理 20 h，收集所有細胞，PBS 洗滌 1 次，70% 乙醇固定。細胞 DNA 含量由 KGA512 試劑盒（凱基生物科技公司，南京）處理后再于流式細胞儀上進行細胞周期分析。
1.8 螢光素酶報告實驗
pGL3cm-CCND1-3′UTR 野生型和 pGL3cm-CCND1-3′UTR 突變型載體由中山大學生命科學院莊詩美教授提供。取 1 000 個 HepG2-hbx 和 HepG2-vc 細胞培養于 48 孔培養皿并共轉染 2 ng pRL-TK 質粒（Promega，Madison，WI，USA）和 5 ng 野生型或突變體螢光素酶，48 h 后進行螢光素酶活性檢測。統計比較細胞中野生型和突變體 2 組之間的螢光素酶活性。
1.9 miRNA 芯片分析
HepG2-hbx 和 HepG2-vc 2 組細胞之間的 miRNA 差異交由深圳微芯公司分析（人 miRNA V3+探針，Invitrogen，美國）。
1.10 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差（ ）表示，2組間數據比較采用 Student’st 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 建立 HepG2-hbx、 HepG2-2.1 和 HepG2-vc 細胞系
為研究 HBx 對肝癌細胞內 miRNA 表達譜的影響，本研究通過 G418 抗生素篩選單克隆的方式建立了穩定表達 HBx 及相應空載體的細胞系（HepG2.2.15 細胞作為陽性對照）。qRT-PCR 及 Western blot 實驗結果證實各細胞中 HBx 的 mRNA 和蛋白表達情況（圖 1 和圖 2），HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 細胞能穩定表達 HBx 的 mRNA 和蛋白。其中，HepG2-2.10 細胞是挑選的克隆之一。接下來，球囊培養結果證實，HBx 穩定表達可促使 HepG2 細胞形成更大及更多的球囊（圖 3 和圖 4）。
圖1
示 RT-PCR 檢測結果，見 HepG2-hbx、 HepG2-2.1 和 HepG2.2.15 細胞中有 HBx mRNA 表達
圖2
Western blot 檢測結果，見 HepG2-2.1 和 HepG2-hbx 細胞中的 HBx 蛋白表達
圖3
HBx 穩定表達促使 HepG2 細胞形成更大的球囊體
圖4
HBx 穩定表達使得 HepG2 細胞形成更多的球囊體。 與 HepG2-vc 比較，***P<0.001
2.2 HBx 在肝癌細胞中下調 miR-16 家族表達
miRNA 芯片分析結果顯示，相比于 HepG2-vc 細胞，HBx-hbx 細胞內 miR-16 家族包括 miR-15a、miR-15b 和 miR-16 顯著低表達（>2 倍），經典的促癌 miRNA miR-21 高表達（>2 倍）。qRT-PCR 結果證實，HBx 穩定（圖 5）或瞬時（圖 6）轉染均可顯著抑制 miR-16 家族在 HepG2 細胞中的表達，這也驗證了芯片結果的可靠性。同樣，HBx 瞬時轉染還能在 Huh7（圖 7）和 SK-HEP-1（圖 8）肝癌細胞中下調 miR-16 家族表達，提示 HBx 對于 miR-16 家族的抑制在不同肝癌細胞株中具有普遍性。
圖5
HBx 穩定轉染在 HepG2 細胞中顯著下調 miR-16 家族的表達。與 HepG2-vc 細胞比較，**P<0.01；***P<0.001
圖6
HBx 瞬時轉染在 HepG2 細胞中顯著下調 miR-16 家族表達。 與載體比較，***P<0.001
圖7
HBx 瞬時轉染在 Huh7 肝癌細胞中顯著下調 miR-16 家族表達。 與載體比較，*P<0.05；***P<0.001
圖8
HBx 瞬時轉染在 SK-HEP-1 肝癌細胞中顯著下調 miR-16 家族表達。 與載體比較，*P<0.05；**P<0.01
本研究進一步檢測了 HBx 對于 CCND1（miR-16 家族靶基因之一）表達量及活性的影響，后者作用于細胞周期 G1/S 檢查點，能促進細胞增殖。熒光素酶報告系統檢測結果顯示：相比對照組，HBx 可顯著升高 HepG2 細胞中 CCND1 的活性〔（38±5）%，圖 9〕。此外，Western blot 實驗證實，在 HBx 穩定表達的 HepG2 細胞中，CCND1 表達出現明顯上調（圖 10）。該結果提示，HBx 可在體外導致肝癌細胞中 miR-16 家族低表達，并上調其靶基因 CCND1 的表達及活性。
圖9
HBx 穩定表達在 HepG2 細胞中顯著上調 CCND1 的活性。 與突變體 CCND1 比較，***P<0.001
圖10
HBx 穩定表達在 HepG2 細胞中顯著上調 CCND1 蛋白表達
2.3 沉默 c-myc 表達可恢復 HepG2-hbx 細胞中 miR-15a/16 的表達
qRT-PCR（圖 11）及 Western blot（圖 12）實驗結果顯示，相比于載體對照細胞，HBx 穩定轉染可顯著上調 HepG2 細胞中 c-myc 的 mRNA 和蛋白表達。此外，Western blot 結果也驗證了 si-myc 的有效性，相比于 si-NC，si-myc 可在轉染后 48 和 72 h 顯著下調 c-myc 的表達（圖 12）。進一步的 qRT-PCR 結果證實：在轉染 si-myc（即沉默 c-myc 表達）后不同時間點（24、28、72 及 96 h）miR-15a 和 miR-16 的表達明顯上調（圖 13），其中以 miR-15a 更為明顯。該結果提示，HBx 在 HepG2 細胞中下調 miR-16 家族的表達，可能在一定程度上由 c-myc 介導。
圖11
HBx 穩定表達在 HepG2 細胞中顯著上調 c-myc 的 mRNA 表達。 與 HepG2-vc 細胞比較，*P<0.05；**P<0.01
圖12
HBx 穩定表達在 HepG2 細胞中顯著上調 c-myc 的蛋白表達，si-myc 能顯著下調 c-myc 的蛋白表達
圖13
si-myc 瞬時轉染 HepG2-hbx 細胞后明顯上調了 miR-15a 和 miR-16 的表達，下調 c-myc 表達。 與 NC 組相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
2.4 沉默 miR-16 表達可促進 HepG2 細胞的周期進展和增殖
CCK-8 實驗結果顯示，相比于 NC 轉染組，轉染 miR-16 抑制物后 48、72 和 96 h 可明顯促進 HepG2 細胞的增殖（圖 14）。相對應的是，miR-16 抑制物可加速 HepG2 細胞的 G1/S 期進展（圖 15）。
圖14
miR-16 抑制物可顯著促進 HepG2 細胞的生長。 與 NC 轉染組相比，***P<0.001
圖15
miR-16 抑制物可使 HepG2 細胞快速通過 G1/S 期。 與 NC 組相比，**P<0.01；***P<0.001
2.5 外源表達的 miR-15a/16 可以通過阻滯細胞周期的進展和誘導凋亡以抑制 HepG2-hbx 細胞的生存
CCK-8 實驗結果顯示，miR-15a 和 miR-16 模擬物均能在轉染 72 及 96 h 后顯著抑制 HepG2-hbx 細胞的增殖（圖 16）。克隆形成（圖 17）及球囊培養實驗（圖 18）結果證實，miR-15a 和 miR-16 模擬物可明顯降低 HepG2-hbx 細胞的生存能力。相比于 miR-15a 和 miR-16 轉染組，NC 組能形成更大和更多的球囊和克隆（圖 19）。
圖16
miR-15a/16 的模擬物瞬時轉染可顯著抑制 HepG2-hbx 細胞的增殖。 與 NC 組相比，*P<0.05；***P<0.001
圖17
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 可顯著降低 HepG2-hbx 和 HepG2.2.15 細胞的平板克隆形成能力
圖18
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 導致 HepG2-hbx 細胞形成較小的球囊體
圖19
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 導致 HepG2-hbx 細胞形成更少的球囊體。 與 NC 組相比，***P<0.001
細胞周期實驗結果顯示，外源表達的 miR-15a 和 miR-16 可將 HepG2-hbx 細胞周期阻滯于 G1 期，NC 轉染組處于 G1 期的細胞數量顯著少于其他轉染組（圖 20）。此外，流式細胞儀檢測結果顯示，miR-15a 和 miR-16 模擬物可誘導 HepG2-hbx 細胞發生明顯的早期凋亡（圖 21）。
圖20
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 阻滯 HepG2-hbx 細胞于 G1 期
圖21
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 導致 HepG2-hbx 細胞發生明顯的早期凋亡
3 討論
HBx 具有協轉錄激活功能，可通過調控蛋白編碼基因表達而激活細胞內多個腫瘤相關信號通路來參與肝癌的起始和進展。然而，人基因組大部分轉錄產物為非編碼 RNA，包括 siRNA、miRNA 及 lncRNA（長鏈非編碼 RNA），它們均能調控基因表達[5]。miRNA 廣泛參與了人類疾病進程包括腫瘤的發生和進展[6]。本研究將 HBx 的調控功能拓展到非編碼 RNA 領域以明確 miRNAs 在 HBV 相關肝癌發生進展中所扮演的角色。
HBx 在 HepG2 細胞內導致大量的 miRNAs 低表達包括 miR-16 家族，只上調少數 miRNAs 包括 miR-21 這一公認的促癌 miRNA。這種 miRNA 表達模式被認為是腫瘤所特有的[4]。Liu 等[6]利用 miRNA 芯片及 Northern blot 比較了 HepG2.2.15 細胞（整合了整個 HBV 基因組，可分泌乙肝表面抗原）和父系 HepG2 細胞之間的 miRNA 表達差異，其中 miR-15a、miR-16、miR-338 和 miR-422a 在 HepG2.2.15 細胞中的低表達與本研究結果是一致的。本研究直接將 HBx 轉入 HepG2 細胞并發現 miR-16 家族顯著低表達于 HepG2-hbx 和 HepG2.2.15 細胞中。盡管如此，HepG2.2.15 細胞仍然不能模擬 HBV 在肝臟內的自然感染過程，miR-16 家族在 HBV 感染導致肝臟病變中的表達和作用仍有待進一步的研究。
miR-16 家族包括 miR-15a/16-1 和 miR-15b/16-2，分別位于人 13q14 和 3 號染色體，且與 DLEU2/SMC4 共轉錄[7]。該家族通過靶向調控 CCND1-3、CCNE1 和 CDK6 而成為細胞周期 G1/S 檢查點的關鍵調控者[8-9]。該家族在多種實體和血液腫瘤中低表達并能靶向沉默多個癌基因包括 c-myb、Bmi-1、bcl-2、WNT3A 和 Wip1[10]。此外，該家族還與腫瘤化療敏感性相關[11]。相應地，13q14 染色體（miR-15a/16-1）的缺失與分化肝癌的細胞周期進展和增殖有關[12]，也和惡性程度高的肝細胞癌生物學特點相關[13]。具體到肝癌，miR-15a/16-1 參與預測肝癌患者靜脈轉移和總體生存[14]，miR-15b 高表達與肝癌切除術后的低復發率有關[15]。此外，miR-15b 和 miR-16 在鼠肝星狀細胞激活過程中低表達[16]，后者還能促進星狀細胞凋亡[17]。值得注意的是，HBx 能在人和鼠肝中激活肝星狀細胞并促其生長[18]。因此，上述報道及本研究結果均提示 miR-16 家族的異常表達參與了 HBV 感染相關的肝纖維化、肝硬變及肝癌的發生進展。
除能靶向沉默上述癌基因外，miR-16 家族自身也是腫瘤相關信號通路的下游靶點。P53 能促進 miR-15a/16-1 的轉錄后加工成熟過程[19]，E2F1 和 E2F3 能在 G1/S 檢查點直接誘導 miR-15b/16-2 表達[20]。射線照射能在人腦膠質瘤和內皮細胞中誘導 miR-15a/-16 的表達[21-22]。相反，c-myc 和 Lin28B 能在人 B 細胞淋巴瘤中抑制 miR-16 家族表達>1.5 倍[23]，這也與本研究發現的 HBx-c-myc-miR-16 通路相呼應。 重要的是，c-myc 在肝癌的發生中被認為占據中心地位[24]。因此，本研究發現的 HBx 能上調 c-myc 表達充分說明了 HBV 感染在肝癌發生中的重要性。
綜上，本研究發現 HBx 能在體外導致人肝癌細胞內 miRNA 異常表達，包括 c-myc 介導的 miR-16 家族低表達。外源表達的 miR-15a/-16 能通過誘導細胞周期阻滯和誘導凋亡而抑制 HepG2-hbx 的增殖、克隆形成和非貼壁生長能力。因此，本實驗結果也展示了 miR-16 家族在治療人肝臟 HBV 慢性感染疾病中的前景。
慢性乙肝病毒感染是亞洲及西非地區肝細胞癌（簡稱肝癌）的主要病因，而乙肝病毒陽性的肝癌相比于陰性者在臨床進程中表現出更為激進的生物學特點[1]。乙型肝炎病毒 X（hepatitis B virus X protein，HBx）蛋白是由 HBV 所編碼的一種反式激活多功能蛋白，高表達于大部分肝癌組織中，其能在體外促進肝細胞惡性轉化，且能導致小鼠 HCC 發生[2]。miRNA 作為基因組的轉錄產物，雖不編碼蛋白，但通過沉默靶標蛋白表達而廣泛參與人類各種疾病尤其是腫瘤的發生和進展。根據 miRNA 在特定腫瘤組織中的高/低表達相應地將其稱之為促/抑癌 miRNA[3]。基因組中位置變化如斷裂/重排，轉錄水平的表觀遺傳修飾如甲基化（轉錄因子調控）以及 miRNA 加工過程變化均可導致 miRNA 自身的表達變化[4]。因此，miRNA 與轉錄因子等可形成復雜的調控網絡進而參與腫瘤的發生及進展。
本研究將肝癌的始動因素 HBx 和 miRNA 聯系在一起，將 HBx 的多功能調控作用拓展到非編碼 RNA 領域，從 miRNA 這一重要的表觀遺傳分子來探討 HBx 促進肝癌發生和進展的分子機制，為臨床治療乙肝相關肝癌提供新思路。
1 材料和方法
1.1 主要試劑和材料
PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒（Takara 生物科技公司，大連，中國）。HBx 和 β-actin 的實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）實驗利用 SYBR PrimeScript RT-PCR 試劑盒完成（Takara 生物科技公司）。U6、miR-15a、miR-15b 和 miR-16 的 qRT-PCR 檢測盒購自上海吉瑪公司（GenePharma，上海）。Western blot 所用的抗體分別是 HBx（sc-71239；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），β-actin（sc-130301；Santa Cruz），c-myc〔9402；Cell Signaling Technology，Boston，MA，USA〕，CCND1（2926；Cell Signaling Technology），and GAPDH （BA2913；博士德，武漢）。miR-16 抑制物、miR-15a/-16 的模擬物、c-myc 特異的 siRNA 及所有的陰性對照（negative control，NC）參照均購自上海吉瑪公司。
1.2 細胞培養
人肝癌細胞系 HepG2、SK-HEP-1 和 Huh7 購自 ATCC 細胞庫并培養于添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中。空載體對照 HepG2-vc 細胞、單克隆篩選穩定表達 HBx 的 HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 細胞除常規培養外額外添加 500 ng/mL G418（Geneticin，遺傳霉素，默克公司），HepG2.2.15 細胞（穩定轉染整個 HBV 基因組的 HepG2 細胞，國外建系）常規培養外添加 380 ng/mL 的 G418。
1.3 siRNA 和質粒信息
將 HBx 開放閱讀框（Adr 亞型，AB299858，按 NCBI 序列由上海生工全序列合成）克隆到 PCDNA3.1 質粒中得到 PCDNA3.1-hbx 質粒。所有 RNA 核苷酸包括 miR-15a/16 的模擬物和抑制物、c-myc 特異的小干擾 RNA（si-myc）和相應的陰性對照均購自上海吉瑪公司。
1.4 細胞轉染
細胞轉染均按照 Lipo2000 試劑盒（invitrogen，美國）說明書進行。除 miR-16 抑制物（200 nmol/L），所有轉染濃度均為 50 nmol/L。
1.4.1 HBx 質粒瞬時轉染 分別取 1×106 個 HepG2、SK-HEP-1 和 Huh7 細胞置于 6 孔板中，利用 Lipo2000 轉染 2 μg PCDNA3.1 和 PCDNA3.1-hbx 質粒，48 h 收集細胞 RNA。
1.4.2 HBx 穩定表達的 HepG2 細胞單克隆挑選 HepG2 細胞轉染 PCDNA3.1-hbx 質粒和空載體 24 h 后，加入 900 ng/mL 的 G418 進行抗性篩選，挑選存活的單克隆細胞擴大培養（整合了 PCDNA3.1-hbx 質粒）。通過 qRT-PCR 和 Western blot 對多個單克隆細胞系進行 HBx mRNA 和蛋白表達檢測，最終獲得 HBx 穩定表達的 HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 細胞以及載體對照細胞 HepG2-vc。
1.5 qRT-PCR
細胞總 RNA 提取采用 TRIzol 試劑并經 DNase Ⅰ（Takara，大連） 處理，利用 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒合成 c-myc 的 cDNA，利用 SYBR PrimeScript RT-PCR 試劑盒檢測 c-myc 在 HepG2-hbx 細胞、HepG2-2.1 細胞和 HepG2.2.15 細胞中的表達情況，以 HepG2-vc 細胞作為對照。
將 si-myc 瞬時轉染 HepG2-hbx 細胞，觀察轉染后 24、28、72 及 96 h 后 miR-15a、miR-16 和 c-myc 的表達情況，以 NC 轉染組作為對照。
miR-15a，miR-15b 和 miR-16 在肝癌細胞系中的表達均采用上海吉瑪公司提供的特定 qRT-PCR 檢測盒，U6 小分子 RNA 作為內參照。
1.6 免疫印跡
采用 RIPA 液（碧云天，海門）裂解提取肝癌細胞總蛋白，HBx、c-myc 和 CCND1 的 Western blot 檢測按相應試劑盒說明進行。
1.7 細胞增殖、細胞凋亡及細胞周期檢測
1.7.1 細胞增殖檢測 CCK-8 試劑盒（CCK-8，同仁化學，日本）用于細胞增殖檢測。① 球囊培養方法：取 1 000 個/mL 的 HepG2-vc 和 HepG2-hbx 細胞懸液培養于無血清的 DMEM-F12 中（添加 1∶50 的 B27 無血清培養基添加因子、20 ng/mL 表皮生長因子、0.4% 的牛血清白蛋白和 4 mg/mL 的胰島素），培養 10～14 d 后顯微鏡下觀察計數。② 克隆形成實驗：miR-15a 和 miR-16 模擬物轉染 24 h 后，分別取 500 個有活力的 HepG2-hbx 細胞和 1 000 個 HepG2.2.15 細胞置于添加 10 mL 完全培養基的 6 cm 培養皿中培養 2～3 周。③ 利用亞甲基藍進行克隆染色完成克隆形成實驗，NC 轉染組作為對照。
1.7.2 細胞凋亡檢測 NC 和 miR-15a/16 mimic 轉染后 48 h，采用 Annexin V-FITC 試劑盒（Bender MedSystems，維也納，奧地利）在流式細胞儀上完成細胞凋亡檢測。根據轉染后 24、48、72 及 96 h 的吸光度值（A 值）繪制細胞生長曲線。
1.7.3 細胞周期檢測 HepG2-hbx 肝癌細胞轉染 mimic 及 NC 24 h 后再加入 100 ng/mL 諾考達唑（nocodazole）處理 20 h，收集所有細胞，PBS 洗滌 1 次，70% 乙醇固定。細胞 DNA 含量由 KGA512 試劑盒（凱基生物科技公司，南京）處理后再于流式細胞儀上進行細胞周期分析。
1.8 螢光素酶報告實驗
pGL3cm-CCND1-3′UTR 野生型和 pGL3cm-CCND1-3′UTR 突變型載體由中山大學生命科學院莊詩美教授提供。取 1 000 個 HepG2-hbx 和 HepG2-vc 細胞培養于 48 孔培養皿并共轉染 2 ng pRL-TK 質粒（Promega，Madison，WI，USA）和 5 ng 野生型或突變體螢光素酶，48 h 后進行螢光素酶活性檢測。統計比較細胞中野生型和突變體 2 組之間的螢光素酶活性。
1.9 miRNA 芯片分析
HepG2-hbx 和 HepG2-vc 2 組細胞之間的 miRNA 差異交由深圳微芯公司分析（人 miRNA V3+探針，Invitrogen，美國）。
1.10 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差（ ）表示，2組間數據比較采用 Student’st 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 建立 HepG2-hbx、 HepG2-2.1 和 HepG2-vc 細胞系
為研究 HBx 對肝癌細胞內 miRNA 表達譜的影響，本研究通過 G418 抗生素篩選單克隆的方式建立了穩定表達 HBx 及相應空載體的細胞系（HepG2.2.15 細胞作為陽性對照）。qRT-PCR 及 Western blot 實驗結果證實各細胞中 HBx 的 mRNA 和蛋白表達情況（圖 1 和圖 2），HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 細胞能穩定表達 HBx 的 mRNA 和蛋白。其中，HepG2-2.10 細胞是挑選的克隆之一。接下來，球囊培養結果證實，HBx 穩定表達可促使 HepG2 細胞形成更大及更多的球囊（圖 3 和圖 4）。
圖1
示 RT-PCR 檢測結果，見 HepG2-hbx、 HepG2-2.1 和 HepG2.2.15 細胞中有 HBx mRNA 表達
圖2
Western blot 檢測結果，見 HepG2-2.1 和 HepG2-hbx 細胞中的 HBx 蛋白表達
圖3
HBx 穩定表達促使 HepG2 細胞形成更大的球囊體
圖4
HBx 穩定表達使得 HepG2 細胞形成更多的球囊體。 與 HepG2-vc 比較，***P<0.001
2.2 HBx 在肝癌細胞中下調 miR-16 家族表達
miRNA 芯片分析結果顯示，相比于 HepG2-vc 細胞，HBx-hbx 細胞內 miR-16 家族包括 miR-15a、miR-15b 和 miR-16 顯著低表達（>2 倍），經典的促癌 miRNA miR-21 高表達（>2 倍）。qRT-PCR 結果證實，HBx 穩定（圖 5）或瞬時（圖 6）轉染均可顯著抑制 miR-16 家族在 HepG2 細胞中的表達，這也驗證了芯片結果的可靠性。同樣，HBx 瞬時轉染還能在 Huh7（圖 7）和 SK-HEP-1（圖 8）肝癌細胞中下調 miR-16 家族表達，提示 HBx 對于 miR-16 家族的抑制在不同肝癌細胞株中具有普遍性。
圖5
HBx 穩定轉染在 HepG2 細胞中顯著下調 miR-16 家族的表達。與 HepG2-vc 細胞比較，**P<0.01；***P<0.001
圖6
HBx 瞬時轉染在 HepG2 細胞中顯著下調 miR-16 家族表達。 與載體比較，***P<0.001
圖7
HBx 瞬時轉染在 Huh7 肝癌細胞中顯著下調 miR-16 家族表達。 與載體比較，*P<0.05；***P<0.001
圖8
HBx 瞬時轉染在 SK-HEP-1 肝癌細胞中顯著下調 miR-16 家族表達。 與載體比較，*P<0.05；**P<0.01
本研究進一步檢測了 HBx 對于 CCND1（miR-16 家族靶基因之一）表達量及活性的影響，后者作用于細胞周期 G1/S 檢查點，能促進細胞增殖。熒光素酶報告系統檢測結果顯示：相比對照組，HBx 可顯著升高 HepG2 細胞中 CCND1 的活性〔（38±5）%，圖 9〕。此外，Western blot 實驗證實，在 HBx 穩定表達的 HepG2 細胞中，CCND1 表達出現明顯上調（圖 10）。該結果提示，HBx 可在體外導致肝癌細胞中 miR-16 家族低表達，并上調其靶基因 CCND1 的表達及活性。
圖9
HBx 穩定表達在 HepG2 細胞中顯著上調 CCND1 的活性。 與突變體 CCND1 比較，***P<0.001
圖10
HBx 穩定表達在 HepG2 細胞中顯著上調 CCND1 蛋白表達
2.3 沉默 c-myc 表達可恢復 HepG2-hbx 細胞中 miR-15a/16 的表達
qRT-PCR（圖 11）及 Western blot（圖 12）實驗結果顯示，相比于載體對照細胞，HBx 穩定轉染可顯著上調 HepG2 細胞中 c-myc 的 mRNA 和蛋白表達。此外，Western blot 結果也驗證了 si-myc 的有效性，相比于 si-NC，si-myc 可在轉染后 48 和 72 h 顯著下調 c-myc 的表達（圖 12）。進一步的 qRT-PCR 結果證實：在轉染 si-myc（即沉默 c-myc 表達）后不同時間點（24、28、72 及 96 h）miR-15a 和 miR-16 的表達明顯上調（圖 13），其中以 miR-15a 更為明顯。該結果提示，HBx 在 HepG2 細胞中下調 miR-16 家族的表達，可能在一定程度上由 c-myc 介導。
圖11
HBx 穩定表達在 HepG2 細胞中顯著上調 c-myc 的 mRNA 表達。 與 HepG2-vc 細胞比較，*P<0.05；**P<0.01
圖12
HBx 穩定表達在 HepG2 細胞中顯著上調 c-myc 的蛋白表達，si-myc 能顯著下調 c-myc 的蛋白表達
圖13
si-myc 瞬時轉染 HepG2-hbx 細胞后明顯上調了 miR-15a 和 miR-16 的表達，下調 c-myc 表達。 與 NC 組相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
2.4 沉默 miR-16 表達可促進 HepG2 細胞的周期進展和增殖
CCK-8 實驗結果顯示，相比于 NC 轉染組，轉染 miR-16 抑制物后 48、72 和 96 h 可明顯促進 HepG2 細胞的增殖（圖 14）。相對應的是，miR-16 抑制物可加速 HepG2 細胞的 G1/S 期進展（圖 15）。
圖14
miR-16 抑制物可顯著促進 HepG2 細胞的生長。 與 NC 轉染組相比，***P<0.001
圖15
miR-16 抑制物可使 HepG2 細胞快速通過 G1/S 期。 與 NC 組相比，**P<0.01；***P<0.001
2.5 外源表達的 miR-15a/16 可以通過阻滯細胞周期的進展和誘導凋亡以抑制 HepG2-hbx 細胞的生存
CCK-8 實驗結果顯示，miR-15a 和 miR-16 模擬物均能在轉染 72 及 96 h 后顯著抑制 HepG2-hbx 細胞的增殖（圖 16）。克隆形成（圖 17）及球囊培養實驗（圖 18）結果證實，miR-15a 和 miR-16 模擬物可明顯降低 HepG2-hbx 細胞的生存能力。相比于 miR-15a 和 miR-16 轉染組，NC 組能形成更大和更多的球囊和克隆（圖 19）。
圖16
miR-15a/16 的模擬物瞬時轉染可顯著抑制 HepG2-hbx 細胞的增殖。 與 NC 組相比，*P<0.05；***P<0.001
圖17
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 可顯著降低 HepG2-hbx 和 HepG2.2.15 細胞的平板克隆形成能力
圖18
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 導致 HepG2-hbx 細胞形成較小的球囊體
圖19
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 導致 HepG2-hbx 細胞形成更少的球囊體。 與 NC 組相比，***P<0.001
細胞周期實驗結果顯示，外源表達的 miR-15a 和 miR-16 可將 HepG2-hbx 細胞周期阻滯于 G1 期，NC 轉染組處于 G1 期的細胞數量顯著少于其他轉染組（圖 20）。此外，流式細胞儀檢測結果顯示，miR-15a 和 miR-16 模擬物可誘導 HepG2-hbx 細胞發生明顯的早期凋亡（圖 21）。
圖20
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 阻滯 HepG2-hbx 細胞于 G1 期
圖21
外源表達的 miR-15a 和 miR-16 導致 HepG2-hbx 細胞發生明顯的早期凋亡
3 討論
HBx 具有協轉錄激活功能，可通過調控蛋白編碼基因表達而激活細胞內多個腫瘤相關信號通路來參與肝癌的起始和進展。然而，人基因組大部分轉錄產物為非編碼 RNA，包括 siRNA、miRNA 及 lncRNA（長鏈非編碼 RNA），它們均能調控基因表達[5]。miRNA 廣泛參與了人類疾病進程包括腫瘤的發生和進展[6]。本研究將 HBx 的調控功能拓展到非編碼 RNA 領域以明確 miRNAs 在 HBV 相關肝癌發生進展中所扮演的角色。
HBx 在 HepG2 細胞內導致大量的 miRNAs 低表達包括 miR-16 家族，只上調少數 miRNAs 包括 miR-21 這一公認的促癌 miRNA。這種 miRNA 表達模式被認為是腫瘤所特有的[4]。Liu 等[6]利用 miRNA 芯片及 Northern blot 比較了 HepG2.2.15 細胞（整合了整個 HBV 基因組，可分泌乙肝表面抗原）和父系 HepG2 細胞之間的 miRNA 表達差異，其中 miR-15a、miR-16、miR-338 和 miR-422a 在 HepG2.2.15 細胞中的低表達與本研究結果是一致的。本研究直接將 HBx 轉入 HepG2 細胞并發現 miR-16 家族顯著低表達于 HepG2-hbx 和 HepG2.2.15 細胞中。盡管如此，HepG2.2.15 細胞仍然不能模擬 HBV 在肝臟內的自然感染過程，miR-16 家族在 HBV 感染導致肝臟病變中的表達和作用仍有待進一步的研究。
miR-16 家族包括 miR-15a/16-1 和 miR-15b/16-2，分別位于人 13q14 和 3 號染色體，且與 DLEU2/SMC4 共轉錄[7]。該家族通過靶向調控 CCND1-3、CCNE1 和 CDK6 而成為細胞周期 G1/S 檢查點的關鍵調控者[8-9]。該家族在多種實體和血液腫瘤中低表達并能靶向沉默多個癌基因包括 c-myb、Bmi-1、bcl-2、WNT3A 和 Wip1[10]。此外，該家族還與腫瘤化療敏感性相關[11]。相應地，13q14 染色體（miR-15a/16-1）的缺失與分化肝癌的細胞周期進展和增殖有關[12]，也和惡性程度高的肝細胞癌生物學特點相關[13]。具體到肝癌，miR-15a/16-1 參與預測肝癌患者靜脈轉移和總體生存[14]，miR-15b 高表達與肝癌切除術后的低復發率有關[15]。此外，miR-15b 和 miR-16 在鼠肝星狀細胞激活過程中低表達[16]，后者還能促進星狀細胞凋亡[17]。值得注意的是，HBx 能在人和鼠肝中激活肝星狀細胞并促其生長[18]。因此，上述報道及本研究結果均提示 miR-16 家族的異常表達參與了 HBV 感染相關的肝纖維化、肝硬變及肝癌的發生進展。
除能靶向沉默上述癌基因外，miR-16 家族自身也是腫瘤相關信號通路的下游靶點。P53 能促進 miR-15a/16-1 的轉錄后加工成熟過程[19]，E2F1 和 E2F3 能在 G1/S 檢查點直接誘導 miR-15b/16-2 表達[20]。射線照射能在人腦膠質瘤和內皮細胞中誘導 miR-15a/-16 的表達[21-22]。相反，c-myc 和 Lin28B 能在人 B 細胞淋巴瘤中抑制 miR-16 家族表達>1.5 倍[23]，這也與本研究發現的 HBx-c-myc-miR-16 通路相呼應。 重要的是，c-myc 在肝癌的發生中被認為占據中心地位[24]。因此，本研究發現的 HBx 能上調 c-myc 表達充分說明了 HBV 感染在肝癌發生中的重要性。
綜上，本研究發現 HBx 能在體外導致人肝癌細胞內 miRNA 異常表達，包括 c-myc 介導的 miR-16 家族低表達。外源表達的 miR-15a/-16 能通過誘導細胞周期阻滯和誘導凋亡而抑制 HepG2-hbx 的增殖、克隆形成和非貼壁生長能力。因此，本實驗結果也展示了 miR-16 家族在治療人肝臟 HBV 慢性感染疾病中的前景。
