引用本文： 邵軍, 王志鑫, 王虎, 李衍飛, 張靈強, 任利, 侯立朝, 周瀛, 王海久, 樊海寧. 抗體芯片檢測泡型包蟲病肝組織凋亡因子的表達. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(4): 426-431. doi: 10.7507/1007-9424.201608097 復制
肝泡型包蟲病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）是危害極大的人畜共患的寄生蟲病，與肝癌有著相似的生物學行為。HAE 患者臨床癥狀出現較晚，待癥狀出現時已經到了晚期，目前治療手段及效果有限，成為臨床醫生面臨的一大挑戰。因此對泡型包蟲病的早期診治至關重要[1-2]。近年來對于細胞因子與疾病的關系的研究頗為深入，細胞因子在泡型包蟲病發生發展中的作用引起了越來越多的關注。抗體芯片是蛋白組學新興的一門技術，擁有高通量、特異性高及平行性分析的特點，在腫瘤標志物發現、藥物發展、毒素檢測、細胞因子研究等領域已有廣泛的應用[3]。本研究利用抗體芯片技術檢測泡型包蟲病患者肝組織中凋亡因子的表達水平，為進一步探索凋亡因子在泡型包蟲病疾病進展中的作用及新的泡型包蟲病診斷及治療策略奠定研究基礎。
1 材料與方法
1.1 標本來源及處理
選取 2015 年 3–10 月期間青海大學附屬醫院 6 例肝泡型包蟲病患者的手術切除標本。所有患者術前診斷均參照《WS257-2006 包蟲病診斷標準》，術前均簽署知情同意書。選取的標本均留取病變邊緣帶肝組織及正常肝組織，邊緣帶肝組織距病灶邊緣 0.5 cm；正常肝組織距病灶邊緣 5 cm。所有標本均于手術后 1 h 內處理完畢并置入–80 ℃ 冰箱保存備檢。
1.2 主要試劑、材料及設備
1.2.1 AAH-APO-G1 試劑盒 試劑盒購自廣州瑞博奧生物科技公司，包括：① 玻片芯片（RayBio?Human Apoptosis G1 Microarray slides，1 個玻片上有 4 個或者 8 個陣列）；② 生物素標記抗體（Biotin-Conjμgated Anti-cytokines，4 個陣列配 1 管，8 個陣列配 2 管）；③ 1 500×熒光標記鏈霉親和素（Cy3 equivalent，1 管）；④ 1×封閉緩沖液（Blocking Buffer，30 mL）；⑤ 20×洗液 Ⅰ（20×Wash Buffer Ⅰ，30 mL）；⑥ 20×洗液 Ⅱ（20×Wash Buffer Ⅱ，30 mL）；⑦ 2×細胞裂解液（2×Cell Lysis Buffer，10 mL）。
1.2.2 主要儀器 ① Genepix 熒光掃描儀，型號：MoLecμLar Devices，LLC；1311 OrLeans Drive SunnyvaLe，CA 94089-1136 ；United States。掃描參數：波長 532 nm。解析度：10 μm。② Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板機（編號：5165010WellwashVersa，100～240 V，50/60 Hz，THERMOUSA/USA）。③ 冷凍離心機（Sigma 1-16K 小型臺式冷凍離心機，1-16K，230 V/50；60 Hz，460 W，24×2.0 mL，15 000 r/min≈20 627×g，100 r/min，Sigma/Germany）。
1.3 組織樣品的準備
① 將 2×細胞裂解液稀釋 2 倍備用，用蒸餾水或者雙蒸水稀釋。② 配制蛋白酶抑制劑：將 Protease Inhibitor Cocktail 小管簡單離心一下，然后將蓋子打開，加入 60 μL 稀釋好的 1×細胞裂解液在小管中，混勻溶解蛋白酶抑制劑；配制蛋白磷酸酶抑制劑混合物：將磷酸酶抑制劑小管簡單離心一下，然后將蓋子打開，加入 180 μL 稀釋好的 1×細胞裂解液在小管中，混勻溶解蛋白酶抑制劑。③ 分別取 50 μL 和 200 μL 配制好的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，加入到 4 750 μL 的 1×細胞裂解液中，混勻，即配制好的已添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的組織裂解液，備用。④ 往肝臟組織中加入細胞裂解液，在冰上用高速分散切割機進行組織破碎。⑤ 冰上裂解 0.5 h，每 5 min 振蕩 1 次。⑥ 冷凍離心機離心（13 000 r/mim）20 min。
1.4 蛋白濃度測定
組織裂解后采用 BCA 法測定其蛋白濃度，測定結果見圖 1。
圖1
示組織標本裂解后測定的蛋白濃度
1.5 抗體芯片檢測方法
采用 AAH-APO-G1 試劑盒進行凋亡因子檢測，實驗步驟如下。
1.5.1 玻片芯片的完全干燥 將玻片芯片（RayBio?Human Apoptosis G1 Microarray slides）從盒子中取出來，在室溫下平衡 20～30 min 后，將包裝袋打開，揭開密封條，然后將芯片放在室溫干燥 1～2 h。
1.5.2 封閉和孵育 ① 每個芯片孔中加入 100 μL 的 1×封閉液，室溫搖床上孵育 1 h，避免產生氣泡。② 抽去封閉液，每個孔中添加 100 μL 樣品（組織樣品配制濃度為 500 μg/mL 的上樣），1 個陣列 1 個樣品〔4 ℃ 振蕩過夜孵育，樣品離心 10 min （13 000 r/mim）〕。③ 使用賽默飛芯片洗板機清洗玻片，分為兩步：首先用 1×洗液 Ⅰ 進行清洗，每孔 250 μL 的 1×洗液 Ⅰ，清洗 8 次，每次震蕩 10 s，震蕩強度選擇高，用去離子水稀釋 20×洗液 Ⅰ；然后換用 1×洗液 Ⅱ 進行清洗，每孔 250 μL 的 1×洗液 Ⅱ，清洗 5 次，每次震蕩 10 s，震蕩強度選擇高，用去離子水稀釋 20×洗液 Ⅱ。④ 配制生物素標記抗體，快速離心生物素標記抗體的小管，每個小管加入 300 μL 的 1×封閉液，混合均勻；每孔加入 70 μL 生物素標記抗體；室溫孵育 2 h。⑤ 清洗，同步驟 3。⑥ 每孔加入 70 μL 1 500 倍稀釋的熒光劑-鏈霉親和素，快速離心后加入 1.5 mL 的封閉液到熒光劑-鏈霉親和素的小管，用密封條貼住玻片，然后用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育 1～2 h；此步也可在 4 ℃ 過夜孵育。⑦ 清洗，同步驟 3。
1.5.3 芯片熒光檢測 采用 Genepix 熒光掃描儀檢測芯片信號，獲取芯片上各點的熒光強度。
1.6 統計學方法
采用 AAH-APO-G1 軟件來進行數據分析。計量資料用均數±標準差（ ）表示，2 組間均數比較采用t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 6 例患者的一般資料
本研究納入的肝泡型包蟲病手術患者肝組織標本 6 例，其中男 3 例，女 3 例；年齡 19～47 歲，平均年齡 34 歲；均為藏族，牧民 4 例；未婚者 4 例。手術方式：行右半肝切除術 4 例，肝左三葉切除術 1 例，全離體自體肝移植術 1 例。
2.2 抗體芯片檢測情況
本研究利用抗體芯片技術檢測泡型包蟲病患者肝組織中的 47 種凋亡因子（表 1），通過抗體芯片檢測陣列圖并對比熒光掃描圖片，結果發現，邊緣帶肝組織中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 凋亡因子抗體芯片陣列位置標記點熒光強度明顯，提示這些凋亡因子在邊緣帶肝組織中表達水平上調；正常肝組織中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 以及 XIAP 凋亡因子抗體芯片陣列位置標記點熒光強度也存在變化，提示這些凋亡因子在正常組織中也有相應表達（圖 2）。
表1
芯片膜上凋亡因子位置列表
圖2
示抗體芯片熒光掃描結果。 a：邊緣帶肝組織；b：正常肝組織；矩形框：顯著差異性因子位置
抗體芯片檢測后一般選取信號值>400，倍性變化閾值大于 1.2 或小于 0.8 及統計學分析P<0.05 為顯著性細胞因子。通過數據對比發現，Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 因子在邊緣帶肝組織中的檢測信號值>400，且滿足倍性變化閾值大于 1.2 或小于 0.8；泡型包蟲病邊緣帶肝組織與正常肝組織相比 Bad（P=0.008）、Fas（P=0.007、IGFBP-3 （P=0.024）、P21（P=0.036）及 XIAP（P=0.034）凋亡因子的表達水平差異有統計學意義（表 2）。盡管發現正常肝組織和邊緣帶肝組織中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 因子信號值水平均>400，但在正常肝組織中 Bad、Fas、IGFBP-3 及 P21 因子信號值水平低于邊緣帶肝組織，而正常肝組織中 XIAP 因子的信號值水平高于邊緣帶肝組織（P<0.05），見圖 3。
表2
泡型包蟲病肝組織中顯著性表達因子的信號值
圖3
示泡型包蟲病肝組織中 5 種顯著性表達因子的信號值。 a：Bad；b：Fas；c：IGFBP-3；d：P21；e：XIAP
3 討論
泡型包蟲病是由多房棘球絳蟲引起的一種人畜共患病，呈全球性分布。泡型包蟲病以肝臟為主要寄生器官，如同腫瘤一樣呈惡性浸潤性生長[4-5]。泡型包蟲病可轉移到腹膜后和腦、肺、骨等遠處器官，因此有“蟲癌”之稱[6-9]。泡型包蟲病危害極大已成為威脅公眾健康的重大問題。
細胞凋亡是當前生物學研究領域中的最新課題之一[10]，對某些疾病的細胞凋亡機制進行研究，尋找在疾病的特異性并應用于疾病的防治已成為治療學的新領域[11]。細胞凋亡是調節生物體正常發育的重要機制[12]，同時也是細胞自穩中發揮重要作用的調控因子[13-14]。近年來，抗體芯片作為最常用的一種蛋白質芯片，已經逐漸發展成為平行性定性和定量檢測生物樣品中蛋白質分子的重要檢測手段[15-16]，在國內外就抗體芯片技術在腫瘤、一些罕見性疾病或感染性疾病中的應用已有相關文獻[17-20]報道。泡型包蟲病有著與腫瘤類似的特性，因此本研究利用抗體芯片技術檢測泡型包蟲病患者肝組織中凋亡因子的表達水平，以探索凋亡因子在泡型包蟲病疾病進程中的作用。本研究結果顯示：泡型包蟲病正常肝組織及邊緣帶肝組織中凋亡細胞因子均有不同程度的表達。但與正常肝組織比較，邊緣帶肝組織中多種凋亡因子（Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP）表達水平變化較為明顯（表達上調或下調在1倍以上），其差異均有統計學意義（P<0.05）。
凋亡因子在泡型包蟲病的相關研究尚未有文獻報告，因此通過闡述本研究中表達顯著的凋亡因子的作用機制，推測這些因子與泡型包蟲病之間的聯系。其中 Bad 蛋白是僅含有 BH3 結構域的 B 細胞淋巴瘤-白血病基因家族的一員，是重要的促凋亡基因之一[21]。有研究[22]表明，Bad 能促進凋亡依賴于細胞信號轉導通路和天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族成員的作用。而 Fas 也稱“死亡分子”，是腫瘤壞死因子受體和神經生長因子受體超家族一員[23]。在生理狀況下，Fas 抗原可廣泛表達于胸腺細胞、活化的T淋巴細胞等免疫細胞表面，也可表達于肝、肺等組織細胞表面[24]。Fas/FasL 在維持機體免疫自穩和腫瘤發生發展過程扮演重要角色，能夠在腫瘤逃避機體免疫系統的監視中發揮直接或間接促進作用，從而有利于腫瘤細胞的侵襲和轉移，但這也為腫瘤的治療提供了可能的途徑[25-26]。近年的研究[27]表明，Fas/FasL 系統就像一把“雙刃劍”，在促進腫瘤增殖及凋亡中發揮著不同的作用。IGFBP-3 是血液中一種重要的 IGF 載體蛋白，其水平變化可作為多種腫瘤診斷和預警的指標[28]；此外，IGFBP-3 還可能介導 P53 的對癌細胞的生長抑制和細胞凋亡，因此 IGFBP-3 在癌癥治療方面前景廣闊[29-31]。P21 是目前最具 CDK 抑制活性的細胞抑制蛋白，其與腫瘤的分化、浸潤深度、增生和轉移有關且具有判斷預后的價值，同時參與細胞的多種功能活動并對細胞周期具有負性調控作用[32-33]；P21 可以通過調控 P21 基因可抑制腫瘤增長，激活 P21 基因可抑制肝癌細胞增殖[34-36]。XIAP 與上述凋亡因子作用相反，其屬于 IAP（凋亡抑制蛋白）家族是凋亡過程中的重要調節因子，是唯一能在起始階段和效應階段同時起抑制作用的蛋白[37]；XIAP 與腫瘤的發生發展和預后密切相關，許多腫瘤高表達通過抑制凋亡信號轉導通路中起核心作用的半胱天冬氨酸蛋白酶分子，對凋亡產生阻斷作用[38-39]。
綜上所述，Bad、Fas、IGFBP-3、P21 等凋亡因子能夠促進細胞的凋亡，而 X-相關凋亡抑制蛋白（XIAP）能夠抑制細胞的凋亡。本研究結果提示：凋亡相關因子在泡型包蟲病的慢性進程中發揮相應作用，可能參與泡型包蟲病的免疫逃逸，為泡型包蟲病的侵襲和轉移創造條件。而促凋亡因子與抑制性凋亡因子之間也可能存在功能失衡，兩者在泡型包蟲病的具體作用機制尚不確切。由于本研究樣本量較少，對于凋亡因子在泡型包蟲病的作用機制研究仍需進一步深入，為泡型包蟲病免疫療法方面的研究提供新思路及潛在靶點。
肝泡型包蟲病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）是危害極大的人畜共患的寄生蟲病，與肝癌有著相似的生物學行為。HAE 患者臨床癥狀出現較晚，待癥狀出現時已經到了晚期，目前治療手段及效果有限，成為臨床醫生面臨的一大挑戰。因此對泡型包蟲病的早期診治至關重要[1-2]。近年來對于細胞因子與疾病的關系的研究頗為深入，細胞因子在泡型包蟲病發生發展中的作用引起了越來越多的關注。抗體芯片是蛋白組學新興的一門技術，擁有高通量、特異性高及平行性分析的特點，在腫瘤標志物發現、藥物發展、毒素檢測、細胞因子研究等領域已有廣泛的應用[3]。本研究利用抗體芯片技術檢測泡型包蟲病患者肝組織中凋亡因子的表達水平，為進一步探索凋亡因子在泡型包蟲病疾病進展中的作用及新的泡型包蟲病診斷及治療策略奠定研究基礎。
1 材料與方法
1.1 標本來源及處理
選取 2015 年 3–10 月期間青海大學附屬醫院 6 例肝泡型包蟲病患者的手術切除標本。所有患者術前診斷均參照《WS257-2006 包蟲病診斷標準》，術前均簽署知情同意書。選取的標本均留取病變邊緣帶肝組織及正常肝組織，邊緣帶肝組織距病灶邊緣 0.5 cm；正常肝組織距病灶邊緣 5 cm。所有標本均于手術后 1 h 內處理完畢并置入–80 ℃ 冰箱保存備檢。
1.2 主要試劑、材料及設備
1.2.1 AAH-APO-G1 試劑盒 試劑盒購自廣州瑞博奧生物科技公司，包括：① 玻片芯片（RayBio?Human Apoptosis G1 Microarray slides，1 個玻片上有 4 個或者 8 個陣列）；② 生物素標記抗體（Biotin-Conjμgated Anti-cytokines，4 個陣列配 1 管，8 個陣列配 2 管）；③ 1 500×熒光標記鏈霉親和素（Cy3 equivalent，1 管）；④ 1×封閉緩沖液（Blocking Buffer，30 mL）；⑤ 20×洗液 Ⅰ（20×Wash Buffer Ⅰ，30 mL）；⑥ 20×洗液 Ⅱ（20×Wash Buffer Ⅱ，30 mL）；⑦ 2×細胞裂解液（2×Cell Lysis Buffer，10 mL）。
1.2.2 主要儀器 ① Genepix 熒光掃描儀，型號：MoLecμLar Devices，LLC；1311 OrLeans Drive SunnyvaLe，CA 94089-1136 ；United States。掃描參數：波長 532 nm。解析度：10 μm。② Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板機（編號：5165010WellwashVersa，100～240 V，50/60 Hz，THERMOUSA/USA）。③ 冷凍離心機（Sigma 1-16K 小型臺式冷凍離心機，1-16K，230 V/50；60 Hz，460 W，24×2.0 mL，15 000 r/min≈20 627×g，100 r/min，Sigma/Germany）。
1.3 組織樣品的準備
① 將 2×細胞裂解液稀釋 2 倍備用，用蒸餾水或者雙蒸水稀釋。② 配制蛋白酶抑制劑：將 Protease Inhibitor Cocktail 小管簡單離心一下，然后將蓋子打開，加入 60 μL 稀釋好的 1×細胞裂解液在小管中，混勻溶解蛋白酶抑制劑；配制蛋白磷酸酶抑制劑混合物：將磷酸酶抑制劑小管簡單離心一下，然后將蓋子打開，加入 180 μL 稀釋好的 1×細胞裂解液在小管中，混勻溶解蛋白酶抑制劑。③ 分別取 50 μL 和 200 μL 配制好的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，加入到 4 750 μL 的 1×細胞裂解液中，混勻，即配制好的已添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的組織裂解液，備用。④ 往肝臟組織中加入細胞裂解液，在冰上用高速分散切割機進行組織破碎。⑤ 冰上裂解 0.5 h，每 5 min 振蕩 1 次。⑥ 冷凍離心機離心（13 000 r/mim）20 min。
1.4 蛋白濃度測定
組織裂解后采用 BCA 法測定其蛋白濃度，測定結果見圖 1。
圖1
示組織標本裂解后測定的蛋白濃度
1.5 抗體芯片檢測方法
采用 AAH-APO-G1 試劑盒進行凋亡因子檢測，實驗步驟如下。
1.5.1 玻片芯片的完全干燥 將玻片芯片（RayBio?Human Apoptosis G1 Microarray slides）從盒子中取出來，在室溫下平衡 20～30 min 后，將包裝袋打開，揭開密封條，然后將芯片放在室溫干燥 1～2 h。
1.5.2 封閉和孵育 ① 每個芯片孔中加入 100 μL 的 1×封閉液，室溫搖床上孵育 1 h，避免產生氣泡。② 抽去封閉液，每個孔中添加 100 μL 樣品（組織樣品配制濃度為 500 μg/mL 的上樣），1 個陣列 1 個樣品〔4 ℃ 振蕩過夜孵育，樣品離心 10 min （13 000 r/mim）〕。③ 使用賽默飛芯片洗板機清洗玻片，分為兩步：首先用 1×洗液 Ⅰ 進行清洗，每孔 250 μL 的 1×洗液 Ⅰ，清洗 8 次，每次震蕩 10 s，震蕩強度選擇高，用去離子水稀釋 20×洗液 Ⅰ；然后換用 1×洗液 Ⅱ 進行清洗，每孔 250 μL 的 1×洗液 Ⅱ，清洗 5 次，每次震蕩 10 s，震蕩強度選擇高，用去離子水稀釋 20×洗液 Ⅱ。④ 配制生物素標記抗體，快速離心生物素標記抗體的小管，每個小管加入 300 μL 的 1×封閉液，混合均勻；每孔加入 70 μL 生物素標記抗體；室溫孵育 2 h。⑤ 清洗，同步驟 3。⑥ 每孔加入 70 μL 1 500 倍稀釋的熒光劑-鏈霉親和素，快速離心后加入 1.5 mL 的封閉液到熒光劑-鏈霉親和素的小管，用密封條貼住玻片，然后用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育 1～2 h；此步也可在 4 ℃ 過夜孵育。⑦ 清洗，同步驟 3。
1.5.3 芯片熒光檢測 采用 Genepix 熒光掃描儀檢測芯片信號，獲取芯片上各點的熒光強度。
1.6 統計學方法
采用 AAH-APO-G1 軟件來進行數據分析。計量資料用均數±標準差（ ）表示，2 組間均數比較采用t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 6 例患者的一般資料
本研究納入的肝泡型包蟲病手術患者肝組織標本 6 例，其中男 3 例，女 3 例；年齡 19～47 歲，平均年齡 34 歲；均為藏族，牧民 4 例；未婚者 4 例。手術方式：行右半肝切除術 4 例，肝左三葉切除術 1 例，全離體自體肝移植術 1 例。
2.2 抗體芯片檢測情況
本研究利用抗體芯片技術檢測泡型包蟲病患者肝組織中的 47 種凋亡因子（表 1），通過抗體芯片檢測陣列圖并對比熒光掃描圖片，結果發現，邊緣帶肝組織中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 凋亡因子抗體芯片陣列位置標記點熒光強度明顯，提示這些凋亡因子在邊緣帶肝組織中表達水平上調；正常肝組織中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 以及 XIAP 凋亡因子抗體芯片陣列位置標記點熒光強度也存在變化，提示這些凋亡因子在正常組織中也有相應表達（圖 2）。
表1
芯片膜上凋亡因子位置列表
圖2
示抗體芯片熒光掃描結果。 a：邊緣帶肝組織；b：正常肝組織；矩形框：顯著差異性因子位置
抗體芯片檢測后一般選取信號值>400，倍性變化閾值大于 1.2 或小于 0.8 及統計學分析P<0.05 為顯著性細胞因子。通過數據對比發現，Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 因子在邊緣帶肝組織中的檢測信號值>400，且滿足倍性變化閾值大于 1.2 或小于 0.8；泡型包蟲病邊緣帶肝組織與正常肝組織相比 Bad（P=0.008）、Fas（P=0.007、IGFBP-3 （P=0.024）、P21（P=0.036）及 XIAP（P=0.034）凋亡因子的表達水平差異有統計學意義（表 2）。盡管發現正常肝組織和邊緣帶肝組織中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 因子信號值水平均>400，但在正常肝組織中 Bad、Fas、IGFBP-3 及 P21 因子信號值水平低于邊緣帶肝組織，而正常肝組織中 XIAP 因子的信號值水平高于邊緣帶肝組織（P<0.05），見圖 3。
表2
泡型包蟲病肝組織中顯著性表達因子的信號值
圖3
示泡型包蟲病肝組織中 5 種顯著性表達因子的信號值。 a：Bad；b：Fas；c：IGFBP-3；d：P21；e：XIAP
3 討論
泡型包蟲病是由多房棘球絳蟲引起的一種人畜共患病，呈全球性分布。泡型包蟲病以肝臟為主要寄生器官，如同腫瘤一樣呈惡性浸潤性生長[4-5]。泡型包蟲病可轉移到腹膜后和腦、肺、骨等遠處器官，因此有“蟲癌”之稱[6-9]。泡型包蟲病危害極大已成為威脅公眾健康的重大問題。
細胞凋亡是當前生物學研究領域中的最新課題之一[10]，對某些疾病的細胞凋亡機制進行研究，尋找在疾病的特異性并應用于疾病的防治已成為治療學的新領域[11]。細胞凋亡是調節生物體正常發育的重要機制[12]，同時也是細胞自穩中發揮重要作用的調控因子[13-14]。近年來，抗體芯片作為最常用的一種蛋白質芯片，已經逐漸發展成為平行性定性和定量檢測生物樣品中蛋白質分子的重要檢測手段[15-16]，在國內外就抗體芯片技術在腫瘤、一些罕見性疾病或感染性疾病中的應用已有相關文獻[17-20]報道。泡型包蟲病有著與腫瘤類似的特性，因此本研究利用抗體芯片技術檢測泡型包蟲病患者肝組織中凋亡因子的表達水平，以探索凋亡因子在泡型包蟲病疾病進程中的作用。本研究結果顯示：泡型包蟲病正常肝組織及邊緣帶肝組織中凋亡細胞因子均有不同程度的表達。但與正常肝組織比較，邊緣帶肝組織中多種凋亡因子（Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP）表達水平變化較為明顯（表達上調或下調在1倍以上），其差異均有統計學意義（P<0.05）。
凋亡因子在泡型包蟲病的相關研究尚未有文獻報告，因此通過闡述本研究中表達顯著的凋亡因子的作用機制，推測這些因子與泡型包蟲病之間的聯系。其中 Bad 蛋白是僅含有 BH3 結構域的 B 細胞淋巴瘤-白血病基因家族的一員，是重要的促凋亡基因之一[21]。有研究[22]表明，Bad 能促進凋亡依賴于細胞信號轉導通路和天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族成員的作用。而 Fas 也稱“死亡分子”，是腫瘤壞死因子受體和神經生長因子受體超家族一員[23]。在生理狀況下，Fas 抗原可廣泛表達于胸腺細胞、活化的T淋巴細胞等免疫細胞表面，也可表達于肝、肺等組織細胞表面[24]。Fas/FasL 在維持機體免疫自穩和腫瘤發生發展過程扮演重要角色，能夠在腫瘤逃避機體免疫系統的監視中發揮直接或間接促進作用，從而有利于腫瘤細胞的侵襲和轉移，但這也為腫瘤的治療提供了可能的途徑[25-26]。近年的研究[27]表明，Fas/FasL 系統就像一把“雙刃劍”，在促進腫瘤增殖及凋亡中發揮著不同的作用。IGFBP-3 是血液中一種重要的 IGF 載體蛋白，其水平變化可作為多種腫瘤診斷和預警的指標[28]；此外，IGFBP-3 還可能介導 P53 的對癌細胞的生長抑制和細胞凋亡，因此 IGFBP-3 在癌癥治療方面前景廣闊[29-31]。P21 是目前最具 CDK 抑制活性的細胞抑制蛋白，其與腫瘤的分化、浸潤深度、增生和轉移有關且具有判斷預后的價值，同時參與細胞的多種功能活動并對細胞周期具有負性調控作用[32-33]；P21 可以通過調控 P21 基因可抑制腫瘤增長，激活 P21 基因可抑制肝癌細胞增殖[34-36]。XIAP 與上述凋亡因子作用相反，其屬于 IAP（凋亡抑制蛋白）家族是凋亡過程中的重要調節因子，是唯一能在起始階段和效應階段同時起抑制作用的蛋白[37]；XIAP 與腫瘤的發生發展和預后密切相關，許多腫瘤高表達通過抑制凋亡信號轉導通路中起核心作用的半胱天冬氨酸蛋白酶分子，對凋亡產生阻斷作用[38-39]。
綜上所述，Bad、Fas、IGFBP-3、P21 等凋亡因子能夠促進細胞的凋亡，而 X-相關凋亡抑制蛋白（XIAP）能夠抑制細胞的凋亡。本研究結果提示：凋亡相關因子在泡型包蟲病的慢性進程中發揮相應作用，可能參與泡型包蟲病的免疫逃逸，為泡型包蟲病的侵襲和轉移創造條件。而促凋亡因子與抑制性凋亡因子之間也可能存在功能失衡，兩者在泡型包蟲病的具體作用機制尚不確切。由于本研究樣本量較少，對于凋亡因子在泡型包蟲病的作用機制研究仍需進一步深入，為泡型包蟲病免疫療法方面的研究提供新思路及潛在靶點。
