引用本文： 郭強, 魏璦琳, 龔姝. TWEAK/Fn14 通路在胰腺癌細胞增殖中的作用研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(4): 432-437. doi: 10.7507/1007-9424.201609015 復制
胰腺癌是一種預后較差的消化系統惡性腫瘤，從歷年的癌癥數據來看，胰腺癌的預后在近 20 年來均未明顯改善[1]。由于藥物治療的效果非常不理想，早期手術仍是胰腺癌治療的首選[2]。然而，大概只有 20% 的患者能有機會行手術切除，而無法行手術切除的患者其中位生存時間僅為 6 個月，5 年生存率僅為 3%～5%[3-4]。目前，對胰腺癌相關基因及分子信號通路研究的在不斷深入，以此為基礎針對惡性腫瘤細胞內特定分子位點的靶向治療的抗腫瘤藥物研發已經成為治療胰腺癌新的方向。早在 1997 年，Chicheportiche 等[5]就首次描述了腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員—腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導劑（TNF-related weak inducer of apoptosis，TWEAK）。它也是唯一能與人成纖維細胞生長因子誘導型 14（fibroblast growth factor-inducible 14，Fn14）結合的 TNF 超家族成員[6]。TWEAK 可以刺激腫瘤細胞的增殖、遷移和定植，它還是潛在的腫瘤血管生成因子[7-9]。目前，國內外關于 TWEAK/Fn14 在胰腺癌中的作用研究較少，其對胰腺癌生物學行為的影響以及具體機制較少報道。因此，本研究擬分析和探討 TWEAK/Fn14 在胰腺癌細胞增殖及成瘤過程中的作用。
1 材料和方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
PANC-1 胰腺癌細胞系來自四川大學華西醫院移植免疫實驗室。兔抗人 TWEAK 多克隆抗體（abcam，ab37170）、DMEM 培養基（Gibco）、胰酶（Gibco）、小牛血清（Gibco）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）、Opti-MEM（Invitrogen）、CCK-8 試劑盒（上海博谷生物）、低溫冰箱（SANYO）、高速離心機（Thermo）、恒溫水浴箱（湘儀醫療器械廠）、圖像分析儀（Alpha Innotech）、凝膠成像系統（Bio-Rad）、酶標儀（Bio-Rad）、紫外分光光度計（Thermo）及 CO2 恒溫培養箱（Sanyo）。
1.2 方法
1.2.1 預實驗 從液氮中取出凍存的 PANC-1 細胞進行復蘇、傳代。按照短發夾 RNA（short hairpin RNA，shRNA）設計原則，GenBank 查找 Fn14 基因的 mRNA 序列，分別設計了 3 對 shRNA（hTNFRSF12A）。shRNA 由 VectorBuilder 公司制作。shRNA 及其引物序列見表 1。構建質粒轉染人胰腺癌 PANC-1 細胞時分為 5 組：空白對照組即無血清培養液組、陰性對照組、沉默Ⅰ組（pLV-Fn14shRNA Ⅰ組）、沉默Ⅱ組（pLV-Fn14shRNA Ⅱ組）和沉默Ⅲ組（pLV-Fn14shRNA Ⅲ組），沉默組設計為 3 組，是便于重復操作，以排除操作過程中的干擾。采用免疫熒光法檢測空白對照組 PANC-1 細胞中的 Fn14 表達。采用 Western blotting 法檢測質粒轉染后陰性對照組和沉默組 3 組 PANC-1 細胞中 Fn14 蛋白的表達情況；采用流式細胞術評估空載組和沉默組 3 組中 Fn14 沉默效率；最終確定轉染效率最高的 Fn14 shRNA 及其最適轉染濃度。
表1
shRNA 序列
1.2.2 轉染 Fn14 shRNA 實驗分為 3 組，即空白對照（PANC-1 細胞未感染組）、陰性對照組（空病毒感染組）和 Fn14-shRNA 干擾組。使用轉染效率最高的 Fn14 shRNA 轉染 PANC-1 細胞。
1.2.3 采用 CCK8 法檢測抑制 TWEAK/Fn14 通路作用后對 PANC-1 細胞增殖的影響 在 96 孔板中接種轉染后的細胞（100 μL/孔），置于 37 ℃、5%CO2 的培養箱中培養 24 h 后，在孔板中加入 10 μL 的 CCK-8 試劑，避免在孔中生成氣泡；置于培養箱內孵育 1～4 h 后，用酶標儀在 450 nm 波長處測定吸光度值（A 值）并進行比較；再分別于 48 和 72 h 重復以上操作。每組細胞每個時間點重復實驗 3 次。
1.2.4 采用 Western blotting 免疫印跡法檢測 TWEAK/Fn14 信號通路 NF-κB 及凋亡因子 caspase-3 和活化的 caspase-3 蛋白的表達 采用常規的免疫印跡方法通過制備蛋白樣品并測定蛋白含量，SDS-PAGE 凝膠電泳將蛋白轉移到膜上利用抗體進行檢測。本研究檢測了陰性對照組和沉默組 PANC-1 細胞中 TWEAK 蛋白、Fn14 蛋白、信號通路下游因子 NF-κB 蛋白和凋亡相關蛋白 caspase-3 及活化 caspase-3 蛋白的表達情況。
1.2.5 采用 Annexin V-PI 雙染法檢測細胞凋亡情況 收集細胞，添加適量 4 ℃ 預冷 PBS，混勻、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清；4 ℃ 預冷 PBS 重懸細胞并計數，細胞密度為 5×105～1×106個/mL，取 100 μL 細胞（5～10 萬個細胞）懸液，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，加入 195 μL 結合緩沖液輕輕重懸細胞，加入 5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻；室溫（20～25 ℃）避光孵育 10 min；1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，190 μL 結合緩沖液輕輕重懸細胞，10 μL 20 ng/mL 的碘化丙啶溶液，輕輕混勻，冰浴室溫避光放置，機行（FACSCalibur，BD 公司）流式細胞儀分析細胞凋亡情況。
1.3 統計學方法
CCK8 細胞增殖實驗和 Western blotting 方法檢測 Fn14 靶基因蛋白表達實驗結果采用單因素方差分析 ANOVA 進行檢驗；連續性變量數據結果以均數±標準差（ ）表示。統計軟件采用 SPSS 17.0。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 慢病毒包裝重組質粒轉染 PANC-1 細胞及轉染后受體 Fn14 沉默效率檢測結果
2.1.1 免疫熒光法檢測空白對照組 PANC-1 細胞中 Fn14 表達 通過免疫熒光的方式檢測空白對照組中 PANC-1 細胞株中受體 Fn14 的表達（圖 1），證實在自然狀態條件下，PANC-1 細胞株胰腺癌細胞中 Fn14 表達是存在的。為下一步繼續做細胞株中的研究提供理論依據。
圖1
示同一視野不同熒光標記的受體 Fn14 在空白對照組 PANC-1 細胞中的表達情況。 a：為白光下細胞視野；b：細胞核標記；c：Fn14 陽性表達；d：系 a、b、c 3 幅圖的融合圖
2.1.2 Western blotting 法檢測重組質粒轉染的 PANC-1 細胞中 Fn14 蛋白的表達結果 其結果顯示，沉默Ⅰ組、沉默Ⅱ組和沉默Ⅲ組的 Fn14 蛋白表達明顯低于陰性對照組（P<0.05），而沉默組 3 組之間 Fn14 蛋白表達量差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
示 Western blotting 法檢測重組慢病毒包裝質粒轉染 PANC-1 細胞后 Fn14 蛋白表達檢測結果。 a：Fn14 蛋白表達電泳圖；b：Fn14 蛋白表達水平，與陰性對照組比較，*P<0.05
2.1.3 流式細胞術檢測轉染效率結果 根據流式細胞術能夠檢測細胞表面分子表達量的方式，來檢測細胞膜表面 Fn14 表達情況，用以評估 Fn14 的沉默效率。干擾質粒轉染 PANC-1 細胞 24 h 后，流式細胞儀檢測的各組細胞 Fn14 表達陽性率陰性對照組、沉默Ⅰ組、沉默Ⅱ組和沉默Ⅲ組分別為 96%、9%、25% 和 18%（圖 3），并據此計算出各組 Fn14 沉默率分別為 4%、91%、75% 和 82%，沉默Ⅰ組、沉默Ⅱ組和沉默Ⅲ組均高于陰性對照組，其中沉默Ⅰ組的 Fn14 沉默效果最好，故本研究選擇沉默Ⅰ組作為后續實驗步驟的沉默組。
圖3
示流式細胞術檢測重組質粒轉染 PANC-1 細胞 24 h 后各組 Fn14 表達陽性率。 圖中橫坐標為紅色熒光，縱坐標為細胞數量，E 為陽性率；a：陰性對照組；b：沉默Ⅰ組；c：沉默Ⅱ組；d：沉默Ⅲ組；
2.2 CCK8 檢測 PANC-1 細胞增殖情況
為了研究 TWEAK/Fn14 信號通路中干擾了受體 Fn14 基因的表達后對胰腺癌 PANC-1 細胞增殖的影響，本研究采用 CCK-8 法分別對空白對照組、陰性對照組及沉默Ⅰ組胰腺癌 PANC-1 細胞的增殖情況進行檢測，結果見表 2。由表 2 可見，隨著轉染時間的延長，各組腫瘤細胞均有不同程度的增殖，同時相各組間比較差異均有統計學意義（P<0.000 1），且沉默Ⅰ組各時相的細胞數量均明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.000 1）。該結果提示，沉默受體 Fn14 基因抑制 TWEAK/Fn14 信號通路后在一定程度上減緩了胰腺癌細胞的增殖，反推之，TWEAK/Fn14 在胰腺癌 PANC-1 細胞株中能夠促進細胞的增殖。
表2
轉染后不同時相各組 PANC-1 細胞增殖情況檢測結果（A 值，
）
2.3 Western blotting 法檢測 TWEAK/Fn14 細胞通路下游因子 NF-κB 蛋白及細胞凋亡蛋白 caspase-3 表達情況
本實驗檢測了陰性對照組和沉默Ⅰ組 PANC-1 細胞中 NF-κB 的蛋白 P50 和 P65 的表達情況。Western blotting 法檢測結果顯示，沉默受體 Fn14 基因后 TWEAK/Fn14 信號通路中 Fn14 蛋白表達明顯下調，沉默Ⅰ組 PANC-1 細胞中 TWEAK 蛋白的表達明顯低于陰性對照組，其差異有統計學意義（P<0.05）；同時，代表 NF-κB 信號通路的 P50 和 P65 蛋白表達也均明顯下調（P<0.05）。沉默Ⅰ組中凋亡因子 caspase-3 蛋白的表達與陰性對照組相比差異無統計學意義（P>0.05），而活化的 caspase-3 蛋白表達則明顯增高（P<0.05）。見圖 4。
圖4
示 Fn14 沉默對 PANC-1 細胞中 TWEAK、NF-κB P50、NF-κB P65 及 caspase-3 蛋白表達的影響。 NS：差異無統計學意義；***P<0.05
2.4 流式細胞術檢測 PANC-1 細胞凋亡情況
結果見圖 5。圖 5 的散點圖中，每個小點代表 1 個細胞。圖像的 4 個象限代表的意義分別是：右上象限為處于晚期凋亡細胞或者已經發生壞死的細胞；右下象限為早期凋亡的細胞；左上象限為機械作用損傷的細胞；左下象限為正常生長的細胞。陰性對照組的 PANC-1 細胞多處于正常生長狀態，而沉默Ⅰ組的 PANC-1 細胞多處于凋亡狀態。該結果提示，未予干擾的 PANC-1 細胞株中細胞凋亡能力減弱，而抑制了 TWEAK/Fn14 信號通路后的細胞多處于凋亡狀態。
圖5
示流式細胞術檢測 PANC-1 細胞凋亡結果
3 討論
本實驗首先以 Fn14 為靶目標，針對 Fn14 基因設計了 3 條 shRNA，并成功構建了靶向 Fn14 受體的 shRNA 表達質粒載體，通過制備攜帶有效干擾序列的慢病毒載體轉染 PANC-1 細胞，使其能夠穩定表達并有效抑制 Fn14 的合成，經 Western blotting 法檢測提示成功抑制了 Fn14 蛋白的表達。本研究在 3 種 Fn14 沉默序列中選擇了沉默效果最好的沉默Ⅰ組 shRNA 序列作為后續實驗步驟的沉默組。
NF-κB 信號通路是腫瘤發展過程中一個重要通路[10]。NF-κB 含有 5 個家族：P65（Rel A）、P105/P50、Rel B、P100/P52 和 c-Rel[11]。本研究通過 Western blotting 方法檢測了 NF-κB 中 P50 和 P65 蛋白的表達，其目的是為了驗證 TWEAK/Fn14 在胰腺癌 PANC-1 細胞系中是否通過 NF-κB 這一信號通路介導下游生物學作用。Western blotting 結果提示，在沉默了 Fn14 受體基因表達后，抑制 TWEAK/Fn14 信號通路表達，NF-κB（P50、P65）蛋白表達明顯下調，從而提示 TWEAK/Fn14 可能是通過 NF-κB 信號通路介導的。這一研究結果與一些 TWEAK/Fn14 信號通路研究[12-13]報道結果相符。
caspase-3 在細胞凋亡中起著重要作用，在細胞毒性淋巴細胞的殺傷作用中，通過 Fas/FasL 途徑和顆粒酶B途徑活化引起細胞凋亡，因此，這個指標也在腫瘤相關研究中作為評估腫瘤細胞系或相關細胞消亡的評價指標[14-15]。caspase 活性檢測常用來作為檢測腫瘤細胞凋亡情況的指標[16]。活化的 caspase-3 作為有活性的 caspase-3 用于評估腫瘤細胞凋亡的主要因子。沉默組細胞在抑制 TWEAK/Fn14 信號通路表達后，活化的 caspase-3 凋亡因子較陰性對照組表達上調，而 caspase-3 表達差異無統計學意義。其結果提示，抑制 TWEAK/Fn14 信號通路后，caspase-3 轉變成有活性的 caspase-3 的能力增強，細胞凋亡能力隨之增加。相反，在胰腺癌腫瘤環境中，有活性的 caspase 表達量少或功能減弱，抑制了細胞凋亡功能，腫瘤發生成為可能。而抑制 TWEAK/Fn14 信號通路能夠促進細胞的凋亡。CCK-8 實驗結果從宏觀上說明了抑制 TWEAK/Fn14 通路表達，PANC-1 細胞系細胞增殖能力下調。
從流式細胞術分析轉染后 PANC-1 細胞凋亡結果來看，在沉默了受體 Fn14 基因表達影響 TWEAK/Fn14 信號通路表達后，PANC-1 細胞系中腫瘤細胞多處于凋亡狀態（早期和晚期），而正常表達的細胞系中腫瘤細胞多處于正常生長狀態，細胞凋亡能力明顯下調。該結果提示，在胰腺癌細胞中，TWEAK 和 Fn14 是通過抑制細胞凋亡能力或通過某種機制“逃避”凋亡，細胞處于過增殖或“不死”狀態，腫瘤發生成為可能。
該實驗結果從分子層面上分析 TWEAK/Fn14 在胰腺癌細胞系促細胞增殖中的作用機制，與神經母細胞瘤、原發性肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等腫瘤中該信號通路的分子機制研究結果基本一致[17-20]。然而，該信號通路在一些惡性腫瘤、炎癥微環境中表現出了促細胞凋亡及低表達的情況[16,21-25]。因此，該信號通路對細胞增殖和凋亡的雙面作用值得進一步研究。
TWEAK 和 Fn14 可以高親和力特異性結合，目前就這種結合有兩種假設式：① 配體依賴的相互作用，即高濃度的三聚體 TWEAK 和低濃度的 Fn14 組成一個復合體；② 配體非依賴性相互作用，即配體 TWEAK 的濃度遠低于受體 Fn14 的濃度。在這種情況下，游離的受體 Fn14 激活下游通路發揮生物學作用[23]。因此檢測 PANC-1 細胞株細胞凋亡情況的實驗結果也可以解釋為：在 Fn14 低表達、TWEAK 正常表達存在的情況下，通過高配體濃度、低受體濃度的作用模式，介導細胞凋亡。
綜上所述，從以往的研究來看，TWEAK/Fn14 通路在胰腺癌發病過程中的作用尚未被闡述。本實驗初步證實了 TWEAK/Fn14 信號通路在胰腺癌細胞的凋亡方面具有一定的促進作用；可以通過抑制腫瘤細胞中 Fn14 的表達、利用 TWEAK 介導細胞凋亡的作用靶向抑制腫瘤細胞的增殖。該實驗也為下一步進行 TWEAK/Fn14 通路功能研究打下了基礎。
胰腺癌是一種預后較差的消化系統惡性腫瘤，從歷年的癌癥數據來看，胰腺癌的預后在近 20 年來均未明顯改善[1]。由于藥物治療的效果非常不理想，早期手術仍是胰腺癌治療的首選[2]。然而，大概只有 20% 的患者能有機會行手術切除，而無法行手術切除的患者其中位生存時間僅為 6 個月，5 年生存率僅為 3%～5%[3-4]。目前，對胰腺癌相關基因及分子信號通路研究的在不斷深入，以此為基礎針對惡性腫瘤細胞內特定分子位點的靶向治療的抗腫瘤藥物研發已經成為治療胰腺癌新的方向。早在 1997 年，Chicheportiche 等[5]就首次描述了腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員—腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導劑（TNF-related weak inducer of apoptosis，TWEAK）。它也是唯一能與人成纖維細胞生長因子誘導型 14（fibroblast growth factor-inducible 14，Fn14）結合的 TNF 超家族成員[6]。TWEAK 可以刺激腫瘤細胞的增殖、遷移和定植，它還是潛在的腫瘤血管生成因子[7-9]。目前，國內外關于 TWEAK/Fn14 在胰腺癌中的作用研究較少，其對胰腺癌生物學行為的影響以及具體機制較少報道。因此，本研究擬分析和探討 TWEAK/Fn14 在胰腺癌細胞增殖及成瘤過程中的作用。
1 材料和方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
PANC-1 胰腺癌細胞系來自四川大學華西醫院移植免疫實驗室。兔抗人 TWEAK 多克隆抗體（abcam，ab37170）、DMEM 培養基（Gibco）、胰酶（Gibco）、小牛血清（Gibco）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）、Opti-MEM（Invitrogen）、CCK-8 試劑盒（上海博谷生物）、低溫冰箱（SANYO）、高速離心機（Thermo）、恒溫水浴箱（湘儀醫療器械廠）、圖像分析儀（Alpha Innotech）、凝膠成像系統（Bio-Rad）、酶標儀（Bio-Rad）、紫外分光光度計（Thermo）及 CO2 恒溫培養箱（Sanyo）。
1.2 方法
1.2.1 預實驗 從液氮中取出凍存的 PANC-1 細胞進行復蘇、傳代。按照短發夾 RNA（short hairpin RNA，shRNA）設計原則，GenBank 查找 Fn14 基因的 mRNA 序列，分別設計了 3 對 shRNA（hTNFRSF12A）。shRNA 由 VectorBuilder 公司制作。shRNA 及其引物序列見表 1。構建質粒轉染人胰腺癌 PANC-1 細胞時分為 5 組：空白對照組即無血清培養液組、陰性對照組、沉默Ⅰ組（pLV-Fn14shRNA Ⅰ組）、沉默Ⅱ組（pLV-Fn14shRNA Ⅱ組）和沉默Ⅲ組（pLV-Fn14shRNA Ⅲ組），沉默組設計為 3 組，是便于重復操作，以排除操作過程中的干擾。采用免疫熒光法檢測空白對照組 PANC-1 細胞中的 Fn14 表達。采用 Western blotting 法檢測質粒轉染后陰性對照組和沉默組 3 組 PANC-1 細胞中 Fn14 蛋白的表達情況；采用流式細胞術評估空載組和沉默組 3 組中 Fn14 沉默效率；最終確定轉染效率最高的 Fn14 shRNA 及其最適轉染濃度。
表1
shRNA 序列
1.2.2 轉染 Fn14 shRNA 實驗分為 3 組，即空白對照（PANC-1 細胞未感染組）、陰性對照組（空病毒感染組）和 Fn14-shRNA 干擾組。使用轉染效率最高的 Fn14 shRNA 轉染 PANC-1 細胞。
1.2.3 采用 CCK8 法檢測抑制 TWEAK/Fn14 通路作用后對 PANC-1 細胞增殖的影響 在 96 孔板中接種轉染后的細胞（100 μL/孔），置于 37 ℃、5%CO2 的培養箱中培養 24 h 后，在孔板中加入 10 μL 的 CCK-8 試劑，避免在孔中生成氣泡；置于培養箱內孵育 1～4 h 后，用酶標儀在 450 nm 波長處測定吸光度值（A 值）并進行比較；再分別于 48 和 72 h 重復以上操作。每組細胞每個時間點重復實驗 3 次。
1.2.4 采用 Western blotting 免疫印跡法檢測 TWEAK/Fn14 信號通路 NF-κB 及凋亡因子 caspase-3 和活化的 caspase-3 蛋白的表達 采用常規的免疫印跡方法通過制備蛋白樣品并測定蛋白含量，SDS-PAGE 凝膠電泳將蛋白轉移到膜上利用抗體進行檢測。本研究檢測了陰性對照組和沉默組 PANC-1 細胞中 TWEAK 蛋白、Fn14 蛋白、信號通路下游因子 NF-κB 蛋白和凋亡相關蛋白 caspase-3 及活化 caspase-3 蛋白的表達情況。
1.2.5 采用 Annexin V-PI 雙染法檢測細胞凋亡情況 收集細胞，添加適量 4 ℃ 預冷 PBS，混勻、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清；4 ℃ 預冷 PBS 重懸細胞并計數，細胞密度為 5×105～1×106個/mL，取 100 μL 細胞（5～10 萬個細胞）懸液，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，加入 195 μL 結合緩沖液輕輕重懸細胞，加入 5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻；室溫（20～25 ℃）避光孵育 10 min；1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，190 μL 結合緩沖液輕輕重懸細胞，10 μL 20 ng/mL 的碘化丙啶溶液，輕輕混勻，冰浴室溫避光放置，機行（FACSCalibur，BD 公司）流式細胞儀分析細胞凋亡情況。
1.3 統計學方法
CCK8 細胞增殖實驗和 Western blotting 方法檢測 Fn14 靶基因蛋白表達實驗結果采用單因素方差分析 ANOVA 進行檢驗；連續性變量數據結果以均數±標準差（ ）表示。統計軟件采用 SPSS 17.0。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 慢病毒包裝重組質粒轉染 PANC-1 細胞及轉染后受體 Fn14 沉默效率檢測結果
2.1.1 免疫熒光法檢測空白對照組 PANC-1 細胞中 Fn14 表達 通過免疫熒光的方式檢測空白對照組中 PANC-1 細胞株中受體 Fn14 的表達（圖 1），證實在自然狀態條件下，PANC-1 細胞株胰腺癌細胞中 Fn14 表達是存在的。為下一步繼續做細胞株中的研究提供理論依據。
圖1
示同一視野不同熒光標記的受體 Fn14 在空白對照組 PANC-1 細胞中的表達情況。 a：為白光下細胞視野；b：細胞核標記；c：Fn14 陽性表達；d：系 a、b、c 3 幅圖的融合圖
2.1.2 Western blotting 法檢測重組質粒轉染的 PANC-1 細胞中 Fn14 蛋白的表達結果 其結果顯示，沉默Ⅰ組、沉默Ⅱ組和沉默Ⅲ組的 Fn14 蛋白表達明顯低于陰性對照組（P<0.05），而沉默組 3 組之間 Fn14 蛋白表達量差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
示 Western blotting 法檢測重組慢病毒包裝質粒轉染 PANC-1 細胞后 Fn14 蛋白表達檢測結果。 a：Fn14 蛋白表達電泳圖；b：Fn14 蛋白表達水平，與陰性對照組比較，*P<0.05
2.1.3 流式細胞術檢測轉染效率結果 根據流式細胞術能夠檢測細胞表面分子表達量的方式，來檢測細胞膜表面 Fn14 表達情況，用以評估 Fn14 的沉默效率。干擾質粒轉染 PANC-1 細胞 24 h 后，流式細胞儀檢測的各組細胞 Fn14 表達陽性率陰性對照組、沉默Ⅰ組、沉默Ⅱ組和沉默Ⅲ組分別為 96%、9%、25% 和 18%（圖 3），并據此計算出各組 Fn14 沉默率分別為 4%、91%、75% 和 82%，沉默Ⅰ組、沉默Ⅱ組和沉默Ⅲ組均高于陰性對照組，其中沉默Ⅰ組的 Fn14 沉默效果最好，故本研究選擇沉默Ⅰ組作為后續實驗步驟的沉默組。
圖3
示流式細胞術檢測重組質粒轉染 PANC-1 細胞 24 h 后各組 Fn14 表達陽性率。 圖中橫坐標為紅色熒光，縱坐標為細胞數量，E 為陽性率；a：陰性對照組；b：沉默Ⅰ組；c：沉默Ⅱ組；d：沉默Ⅲ組；
2.2 CCK8 檢測 PANC-1 細胞增殖情況
為了研究 TWEAK/Fn14 信號通路中干擾了受體 Fn14 基因的表達后對胰腺癌 PANC-1 細胞增殖的影響，本研究采用 CCK-8 法分別對空白對照組、陰性對照組及沉默Ⅰ組胰腺癌 PANC-1 細胞的增殖情況進行檢測，結果見表 2。由表 2 可見，隨著轉染時間的延長，各組腫瘤細胞均有不同程度的增殖，同時相各組間比較差異均有統計學意義（P<0.000 1），且沉默Ⅰ組各時相的細胞數量均明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.000 1）。該結果提示，沉默受體 Fn14 基因抑制 TWEAK/Fn14 信號通路后在一定程度上減緩了胰腺癌細胞的增殖，反推之，TWEAK/Fn14 在胰腺癌 PANC-1 細胞株中能夠促進細胞的增殖。
表2
轉染后不同時相各組 PANC-1 細胞增殖情況檢測結果（A 值，
）
2.3 Western blotting 法檢測 TWEAK/Fn14 細胞通路下游因子 NF-κB 蛋白及細胞凋亡蛋白 caspase-3 表達情況
本實驗檢測了陰性對照組和沉默Ⅰ組 PANC-1 細胞中 NF-κB 的蛋白 P50 和 P65 的表達情況。Western blotting 法檢測結果顯示，沉默受體 Fn14 基因后 TWEAK/Fn14 信號通路中 Fn14 蛋白表達明顯下調，沉默Ⅰ組 PANC-1 細胞中 TWEAK 蛋白的表達明顯低于陰性對照組，其差異有統計學意義（P<0.05）；同時，代表 NF-κB 信號通路的 P50 和 P65 蛋白表達也均明顯下調（P<0.05）。沉默Ⅰ組中凋亡因子 caspase-3 蛋白的表達與陰性對照組相比差異無統計學意義（P>0.05），而活化的 caspase-3 蛋白表達則明顯增高（P<0.05）。見圖 4。
圖4
示 Fn14 沉默對 PANC-1 細胞中 TWEAK、NF-κB P50、NF-κB P65 及 caspase-3 蛋白表達的影響。 NS：差異無統計學意義；***P<0.05
2.4 流式細胞術檢測 PANC-1 細胞凋亡情況
結果見圖 5。圖 5 的散點圖中，每個小點代表 1 個細胞。圖像的 4 個象限代表的意義分別是：右上象限為處于晚期凋亡細胞或者已經發生壞死的細胞；右下象限為早期凋亡的細胞；左上象限為機械作用損傷的細胞；左下象限為正常生長的細胞。陰性對照組的 PANC-1 細胞多處于正常生長狀態，而沉默Ⅰ組的 PANC-1 細胞多處于凋亡狀態。該結果提示，未予干擾的 PANC-1 細胞株中細胞凋亡能力減弱，而抑制了 TWEAK/Fn14 信號通路后的細胞多處于凋亡狀態。
圖5
示流式細胞術檢測 PANC-1 細胞凋亡結果
3 討論
本實驗首先以 Fn14 為靶目標，針對 Fn14 基因設計了 3 條 shRNA，并成功構建了靶向 Fn14 受體的 shRNA 表達質粒載體，通過制備攜帶有效干擾序列的慢病毒載體轉染 PANC-1 細胞，使其能夠穩定表達并有效抑制 Fn14 的合成，經 Western blotting 法檢測提示成功抑制了 Fn14 蛋白的表達。本研究在 3 種 Fn14 沉默序列中選擇了沉默效果最好的沉默Ⅰ組 shRNA 序列作為后續實驗步驟的沉默組。
NF-κB 信號通路是腫瘤發展過程中一個重要通路[10]。NF-κB 含有 5 個家族：P65（Rel A）、P105/P50、Rel B、P100/P52 和 c-Rel[11]。本研究通過 Western blotting 方法檢測了 NF-κB 中 P50 和 P65 蛋白的表達，其目的是為了驗證 TWEAK/Fn14 在胰腺癌 PANC-1 細胞系中是否通過 NF-κB 這一信號通路介導下游生物學作用。Western blotting 結果提示，在沉默了 Fn14 受體基因表達后，抑制 TWEAK/Fn14 信號通路表達，NF-κB（P50、P65）蛋白表達明顯下調，從而提示 TWEAK/Fn14 可能是通過 NF-κB 信號通路介導的。這一研究結果與一些 TWEAK/Fn14 信號通路研究[12-13]報道結果相符。
caspase-3 在細胞凋亡中起著重要作用，在細胞毒性淋巴細胞的殺傷作用中，通過 Fas/FasL 途徑和顆粒酶B途徑活化引起細胞凋亡，因此，這個指標也在腫瘤相關研究中作為評估腫瘤細胞系或相關細胞消亡的評價指標[14-15]。caspase 活性檢測常用來作為檢測腫瘤細胞凋亡情況的指標[16]。活化的 caspase-3 作為有活性的 caspase-3 用于評估腫瘤細胞凋亡的主要因子。沉默組細胞在抑制 TWEAK/Fn14 信號通路表達后，活化的 caspase-3 凋亡因子較陰性對照組表達上調，而 caspase-3 表達差異無統計學意義。其結果提示，抑制 TWEAK/Fn14 信號通路后，caspase-3 轉變成有活性的 caspase-3 的能力增強，細胞凋亡能力隨之增加。相反，在胰腺癌腫瘤環境中，有活性的 caspase 表達量少或功能減弱，抑制了細胞凋亡功能，腫瘤發生成為可能。而抑制 TWEAK/Fn14 信號通路能夠促進細胞的凋亡。CCK-8 實驗結果從宏觀上說明了抑制 TWEAK/Fn14 通路表達，PANC-1 細胞系細胞增殖能力下調。
從流式細胞術分析轉染后 PANC-1 細胞凋亡結果來看，在沉默了受體 Fn14 基因表達影響 TWEAK/Fn14 信號通路表達后，PANC-1 細胞系中腫瘤細胞多處于凋亡狀態（早期和晚期），而正常表達的細胞系中腫瘤細胞多處于正常生長狀態，細胞凋亡能力明顯下調。該結果提示，在胰腺癌細胞中，TWEAK 和 Fn14 是通過抑制細胞凋亡能力或通過某種機制“逃避”凋亡，細胞處于過增殖或“不死”狀態，腫瘤發生成為可能。
該實驗結果從分子層面上分析 TWEAK/Fn14 在胰腺癌細胞系促細胞增殖中的作用機制，與神經母細胞瘤、原發性肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等腫瘤中該信號通路的分子機制研究結果基本一致[17-20]。然而，該信號通路在一些惡性腫瘤、炎癥微環境中表現出了促細胞凋亡及低表達的情況[16,21-25]。因此，該信號通路對細胞增殖和凋亡的雙面作用值得進一步研究。
TWEAK 和 Fn14 可以高親和力特異性結合，目前就這種結合有兩種假設式：① 配體依賴的相互作用，即高濃度的三聚體 TWEAK 和低濃度的 Fn14 組成一個復合體；② 配體非依賴性相互作用，即配體 TWEAK 的濃度遠低于受體 Fn14 的濃度。在這種情況下，游離的受體 Fn14 激活下游通路發揮生物學作用[23]。因此檢測 PANC-1 細胞株細胞凋亡情況的實驗結果也可以解釋為：在 Fn14 低表達、TWEAK 正常表達存在的情況下，通過高配體濃度、低受體濃度的作用模式，介導細胞凋亡。
綜上所述，從以往的研究來看，TWEAK/Fn14 通路在胰腺癌發病過程中的作用尚未被闡述。本實驗初步證實了 TWEAK/Fn14 信號通路在胰腺癌細胞的凋亡方面具有一定的促進作用；可以通過抑制腫瘤細胞中 Fn14 的表達、利用 TWEAK 介導細胞凋亡的作用靶向抑制腫瘤細胞的增殖。該實驗也為下一步進行 TWEAK/Fn14 通路功能研究打下了基礎。
