引用本文： 柏龍, 孟慶輝, 李龍. 循環腫瘤細胞標志物檢測及臨床應用新進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(7): 890-894. doi: 10.7507/1007-9424.201609065 復制
目前腫瘤轉移理論認為，腫瘤細胞首先需要從原發灶脫離，然后進入血液或淋巴循環，才能在遠處形成轉移灶，腫瘤轉移成為導致患者死亡的首要原因。依據目前腫瘤轉移理論，外周血中的腫瘤細胞即循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）與腫瘤的血行或淋巴轉移可能有直接關系。CTCs 吸引了越來越多研究者的注意，而且 CTCs 的檢測可以使我們收集反映各期腫瘤轉移過程的信息，并有可能幫助臨床醫生較為準確地進行腫瘤的早期診斷、預測轉移或復發，CTCs 標志物的檢測對于 CTCs 的研究具有重要意義。由于上皮-間質化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）在腫瘤轉移中的作用，也成為 CTCs 標志。現就 CTCs 標志物的檢測及其臨床應用進展作一綜述。
1 外周血中的上皮細胞及其標志物的檢測及臨床應用
在外周血中，大部分上皮細胞被認為是來源于上皮惡性腫瘤細胞，通過上皮細胞腫瘤標志物可以有效地檢測 CTCs。通過檢測上皮細胞腫瘤標志物檢測 CTCs 的方式主要有：免疫組化技術（immunocy-tology）、逆轉錄多聚酶鏈反應（RT-PCR）技術和寡核苷酸適配子技術。
1.1 免疫組化技術及其臨床應用
在 2002 年，開發了一個自動化富集 CTCs 和免疫細胞化學檢測 CTCs 的系統，即 CellSearch 系統（Veridex，Warren，NJ，USA）[1]。該系統是通過檢測上皮特異性黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）或細胞因子（cytokines，CKs）等上皮細胞腫瘤標志物來檢測 CTCs 的一種常用手段，其已被美國 FDA 批準唯一一個可應用于臨床的 CTCs 檢測系統，2004 年被 FDA 批準用于評估復發轉移性乳腺癌的臨床預后，現在已被作為轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌患者的臨床檢測手段[2]。
有臨床研究[3]在 1 944 例符合條件的轉移性乳腺癌患者中，檢出 911 例患者的 7.5 mL 外周血中存在多于 5 個的 CTCs，CTCs 的存在與腫瘤無進展生存率（progression-free survival，PFS）和總生存率（overall survival，OS）的降低有關。另外，Rack 等[4]指出，CTCs 在早期乳腺癌中可作為一種獨立的預后因子。Hiraiwa 等[5]的研究表明，CTCs 在消化道惡性腫瘤患者中可以預測疾病的進展和化療效果。在胃癌患者中有 18.4% 的患者 CTCs 檢測為陽性，CTCs 的檢測能夠預測晚期胃癌患者的 PFS[6]。在結直腸癌中，術前 CTCs 檢測也可以作為一種預后指標[7]。因此，使用 CellSearch 系統檢測 CTCs 具有重要的臨床意義。
1.2 RT-PCR 技術及其臨床應用
RT-PCR 技術是一種檢測上皮細胞某種特異性 mRNA（如 EpCAM 或 CKs）的具有代表性的檢測方法[8]。已經證實，在胃癌、結直腸癌和乳腺癌患者中，通過使用 RT-PCR 技術檢測上皮細胞標志物 CEA、CK-7、CK-19 等，來檢測血液中的 CTCs 具有重要臨床意義[9]。然而，由于在良性細胞中的假基因或轉錄產物的存在，可能出現假陽性結果。多重聚合酶鏈反應（如 AdnaGen AG）可以克服這一缺陷，這一系統以主要檢測 3 種與腫瘤有關的轉錄產物，包括雌激素受體（estrogen receptor，ER）、人類表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和免疫組化基因，通過 RT-PCR 磁免疫后富集癌細胞[10]。
1.3 寡核苷酸適配子及其臨床應用
適配子是人工合成的有 RNA 或 DNA 組成的單鏈寡核苷酸，與非核苷酸靶目標物質進行高親和力、高特異性的結合。由于它們的寡核苷酸特性，與抗體相比，具有獨特的化學和生物學特性。因此它們將比上面提到的常規檢測技術更加適合應用于新的臨床發展[11]。Zamay 等[12]的研究表明，寡核苷酸適配子可以和 CK 陽性和 CK 陰性的肺腺癌與肺鱗狀細胞癌患者血液中的腫瘤分子結合。
盡管還存在一些不足之處，但通過檢測上皮細胞標志物來檢測 CTCs 對于臨床診斷是非常有用的[13]。然而，由于上皮細胞標志物的敏感性和特異性存在問題，CTCs 在不同的腫瘤患者的臨床實踐中用于指導治療尚未完全被接受[14]。正如下面所討論的，需要進一步的研究來證明 CTCs 對于臨床應用的重要性。
2 描述 CTCs 惡性表型的其他標志物及其臨床應用
上皮細胞標志物在理論上是可以檢測所有 CTCs，然而并不是所有檢測到的 CTCs 都會導致轉移病變[15]。有的標志物只出現在只有轉移能力的 CTCs，這類標志物可以更好地在臨床中應用。下面所敘述的是這些標志物能夠在惡性腫瘤患者的 CTCs 中被檢測到。
2.1 HER2
HER2 是人表皮生長因子受體。HER2 的過度表達在某些侵襲性乳腺癌或胃癌中起著非常重要的作用。在大約 30% 的乳腺癌或胃癌患者中，HER2 作為生物標志物和分子治療靶點已應用于臨床中[16]。有研究[17]表明，在乳腺癌患者中 HER2 陽性 CTCs 有重要的預后意義，檢出 HER2 陽性的 CTCs 的乳腺癌患者比檢出 HER2 陰性的 CTCs 的患者具有較差的 PFS。Riethdorf 等[18]在 58 例 CTCs 陽性的乳腺癌患者中，有 14 例患者 CTCs 的 HER2 呈陽性表達，其中有 8 例是原發腫瘤 HER2 表達陰性的患者，這些都是應用 CellSearch 技術進行檢測的。Fehm 等[19]也發現，在原發腫瘤 HER2 表達陰性的患者中也可檢測到 HER2 表達陽性的 CTCs，使用 CellSearch 技術檢測的概率是 32%，使用 AdnaTest 技術檢測的概率是 49%。因此，檢測 CTCs 中 HER2 陽性表達水平可以幫助乳腺癌患者確定合適的治療方案，同時也能幫助判斷乳腺癌患者治療的療效[20]。
2.2 ER
ER 在大約 70% 的乳腺癌患者中表達，這些病例被稱為 ER 陽性的乳腺癌患者。ER 水平是通過對癌組織進行免疫組織化學分析得到的。有兩個假設提出了雌激素誘導腫瘤發生的可能機制。首先，雌激素與 ER 結合可以刺激乳腺細胞增生，導致細胞分裂和 DNA 復制增加，從而導致突變。其次，雌激素代謝產生基因毒性廢物。值得注意的是，ER 陽性的乳腺癌患者具有較好的預后[20]，ER 陽性的腫瘤患者通常采用內分泌治療。然而，大約 20% ER 陽性的患者在疾病治療和腫瘤轉移進展預測方面與 ER 陰的患者相比并沒有優勢。在 ER 陽性的轉移性乳腺癌患者中的 CTCs 往往缺乏ER的表達。有研究[21]發現，多種標志物（ER、bcl-2、HER2 和 Ki67）表達的 CTCs 可以預測內分泌治療的抵抗性。因此，在 CTCs 中 ER 表達水平對于患者是否使用內分泌治療，是一個非常有用的決定性指標。
2.3 程序性死亡分子配體（PD-L1）
免疫應答可以通過調節腫瘤浸潤性淋巴細胞活化劑途徑和抑制劑途徑，使其達到一種平衡。PD-L1 與 PD-1 的結合能夠誘導 T 淋巴細胞耐受從而減少細胞免疫應答，有助于防止自身免疫的發生[22]。PD-L1 可以促進腫瘤進展。對 196 例腎癌患者的樣本分析表明，高表達 PD-L1 不僅可以增加腫瘤的侵襲性，也可以增高 4.5 倍的死亡風險[23]。高表達 PD-L1 的卵巢癌患者的預后比低表達 PD-L1 患者的預后差很多，而 PD-L1 的表達與上皮內 CD8 T 淋巴細胞計數呈負相關，表明 PD-L1 可抑制有抗癌作用的 CD8 T 淋巴細胞的產生[24]。
通過對乳腺癌患者 PD-L1 表達的臨床分析發現，PD-L1 僅在 1.7%（66/3 916）乳腺癌患者及 7.9%（24/302）三陰性乳腺癌患者中表達[25]。通過流式細胞儀和免疫細胞化學分析表明，PD-L1 多在 ER 陽性患者及 HER2 陰性乳腺癌患者的 CTCs 中表達；此外，68.8%（11/16）的腫瘤患者 CTCs 中 PD-L1 呈陽性[26]。因此，PD-L1 可作為 CTCs 的重要標志物。
3 循環 CSCs
CSCs 是能夠自我更新并能分化成不同類型腫瘤細胞的細胞。CSCs 被認為作為一種特定的細胞種類在腫瘤中持續存在，并能導致腫瘤的復發和轉移。CSCs 標志物有望在 CTCs 檢測中發揮非常重要的作用。這類細胞我們稱之為循環腫瘤干細胞（CTSCs）[27]。
3.1 醛脫氫酶 1（ALDH1）
Kasimir-Bauer 等[28]應用 AdnaTest 技術評估了原發乳腺癌患者 CTCs 中的干細胞標志物 ALDH1 的表達。該研究發現，5% 的 CTCs 陰性患者的 ALDH1 呈陽性表達，其結果提示，CTCs 的存在和 ALDH1 陽性表達與乳腺癌的預后無關。ALDH1 陽性表達對于三陰乳腺癌是一個獨立的預后因素[29]。研究[30]表明，結直腸癌腫瘤組織中的 ALDH1 明顯高于正常結直腸組織，ALDH1 表達水平與結直腸癌腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和總生存率密切相關。
3.2 EpCAM+/CD44+/CD47+/MET+ 細胞
通過流式細胞技術檢測發現，腫瘤轉移細胞中的 CTCs 細胞能夠表達上皮細胞黏附分子 EpCAM、CD44 及 CD47 和原癌基因（c-met proto-oncogene，MET）[31]。MET 被證實能夠激發腫瘤的轉移和侵襲[32]。在部分轉移癌患者中，EpCAM+/CD44+/CD47+/MET+ 的 CTCs 的數量（并不是EpCAM+ 的 CTCs）與患者較低的總體生存率及有較多的腫瘤轉移部位有關[31]。然而，在肝癌患者，EpCAM+ 的 CTCs 有腫瘤干細胞特性，這些細胞與腫瘤較高的復發率有一定的關系[33]。
3.3 CEA/CK/CD133 mRNA 陽性細胞
在結直腸癌的 CSCs 中，CD133 是一個重要標志物[34]。研究[35]發現，通過 RT-PCR 技術檢測血液中 CEA、CK 及 CD133 mRNA 表達水平，是確定結直腸癌患者復發及預后的有效手段。另外，在 Dukes B 和 C 期的結直腸癌患者，CEA/CK/CD133 mRNA 具有重要的預后價值[35]。
4 循環腫瘤間充質細胞
上皮細胞間充質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞失去細胞極性和細胞間的黏附，獲得了較高的遷移和侵襲、轉化為間充質細胞。引發腫瘤轉移需要腫瘤細胞的侵襲，這需要通過 EMT 來實現。然而，EMT 并不總是需要腫瘤細胞活動[36]。近年有文獻[37]報道表明，EMT 對于腫瘤轉移并不是很重要的，但對于腫瘤的化學耐藥有一定的作用。間充質細胞標志是 CTCs 的潛在標志物。Bitting 等[38]已經開發了一種使用 CellSearch 系統用間充質細胞捕獲 CTCs 的方法，這些細胞都是 OB 蛋白陽性細胞。
通過分析不表達 CK 或 EpCAM 的乳腺癌、卵巢癌或結直腸癌患者的復雜非整倍體 CTCs 發現，在捕獲的細胞中有一個 EMT 表型轉化[39]。有研究[40]表明，間充質 CTCs 以單一細胞或細胞簇形式存在，通過 EMT 調節，包括轉化生長因子（TGF）-β 通路和 FOXC1 基因轉錄因子。此外，EMT 在乳腺癌的血液轉移中起著重要的作用[40]。以上研究結果提示，EMT 導致上皮細胞特性消失，獲得了間充質細胞的特性，因此這可能妨礙使用上皮細胞標志物來檢測 CTCs。
近年檢測到了一種新型 CTCs 標志物，絲束蛋白 3（PLS3），該標志物在上皮癌細胞和間充質癌細胞表型都有表達[41-42]。PLS3 在 EpCAM 陽性的上皮表型和 EpCAM 陰性的間充質細胞表型的 CTCs 中都有表達[42]。在不同腫瘤患者的血液中 PLS3 mRNA 表達是具有臨床意義的，如結直腸癌和乳腺癌[41]。PLS3 基因編碼的是一種蛋白集束調控蛋白因子，它可能是促使腫瘤細胞形成轉移的重要因素，像逃避失巢凋亡、抗化學治療、增加腫瘤干細胞和 EMT 的誘導[42]。有分析表明，CTCs 中 PLS3 表達陽性的腫瘤患者相比 PLS3 表達陰性的腫瘤患者預后越差；CTCs 中 PLS3 表達陽性率和腫瘤患者的預后有著密切的關系，尤其在 Dukes B 和 C 期患者[42]。這對 Dukes B 期結直腸癌患者是否使用輔助化療有著非常重要的作用，因為超過 10% 的 Dukes B 期結直腸癌患者在沒有輔助化療的情況下出現復發。
乳腺癌干細胞（BCSCs）以不同的間充質樣（CD24-/CD44+）和上皮樣細胞（ALDH+）存在，間充質樣和上皮樣 BCSCs 主要集中在腫瘤侵襲前[43]。此外，他們[43]認為，BCSCs 的可塑性賦予了這些細胞浸潤轉移的能力。有目標的選擇 CSCs 有助于檢測和清除 CTCs，這在臨床上是很重要的，也可能是很有必要的。
5 小結與展望
綜上所述，近年來隨著對 CTCs 研究的不斷深入，越來越多的 CTCs 標志物被發現并應用于臨床工作中。CTCs 在臨床上是非常重要并能夠方便進行早期的檢測和轉移癌的治療。但是，由于腫瘤生物特性的異質性，不同腫瘤表面抗原的表達差異很大，目前尚沒有統一的用于臨床判斷腫瘤 CTCs 的分析靶標。但隨著檢測技術的不斷改進，靈敏度和特異度的不斷提高，CTCs 分子檢測在尋找新的腫瘤標志物用于腫瘤診治和判斷預后以及開發新的腫瘤靶向藥物中具有巨大的應用價值。
目前腫瘤轉移理論認為，腫瘤細胞首先需要從原發灶脫離，然后進入血液或淋巴循環，才能在遠處形成轉移灶，腫瘤轉移成為導致患者死亡的首要原因。依據目前腫瘤轉移理論，外周血中的腫瘤細胞即循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）與腫瘤的血行或淋巴轉移可能有直接關系。CTCs 吸引了越來越多研究者的注意，而且 CTCs 的檢測可以使我們收集反映各期腫瘤轉移過程的信息，并有可能幫助臨床醫生較為準確地進行腫瘤的早期診斷、預測轉移或復發，CTCs 標志物的檢測對于 CTCs 的研究具有重要意義。由于上皮-間質化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）在腫瘤轉移中的作用，也成為 CTCs 標志。現就 CTCs 標志物的檢測及其臨床應用進展作一綜述。
1 外周血中的上皮細胞及其標志物的檢測及臨床應用
在外周血中，大部分上皮細胞被認為是來源于上皮惡性腫瘤細胞，通過上皮細胞腫瘤標志物可以有效地檢測 CTCs。通過檢測上皮細胞腫瘤標志物檢測 CTCs 的方式主要有：免疫組化技術（immunocy-tology）、逆轉錄多聚酶鏈反應（RT-PCR）技術和寡核苷酸適配子技術。
1.1 免疫組化技術及其臨床應用
在 2002 年，開發了一個自動化富集 CTCs 和免疫細胞化學檢測 CTCs 的系統，即 CellSearch 系統（Veridex，Warren，NJ，USA）[1]。該系統是通過檢測上皮特異性黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）或細胞因子（cytokines，CKs）等上皮細胞腫瘤標志物來檢測 CTCs 的一種常用手段，其已被美國 FDA 批準唯一一個可應用于臨床的 CTCs 檢測系統，2004 年被 FDA 批準用于評估復發轉移性乳腺癌的臨床預后，現在已被作為轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌患者的臨床檢測手段[2]。
有臨床研究[3]在 1 944 例符合條件的轉移性乳腺癌患者中，檢出 911 例患者的 7.5 mL 外周血中存在多于 5 個的 CTCs，CTCs 的存在與腫瘤無進展生存率（progression-free survival，PFS）和總生存率（overall survival，OS）的降低有關。另外，Rack 等[4]指出，CTCs 在早期乳腺癌中可作為一種獨立的預后因子。Hiraiwa 等[5]的研究表明，CTCs 在消化道惡性腫瘤患者中可以預測疾病的進展和化療效果。在胃癌患者中有 18.4% 的患者 CTCs 檢測為陽性，CTCs 的檢測能夠預測晚期胃癌患者的 PFS[6]。在結直腸癌中，術前 CTCs 檢測也可以作為一種預后指標[7]。因此，使用 CellSearch 系統檢測 CTCs 具有重要的臨床意義。
1.2 RT-PCR 技術及其臨床應用
RT-PCR 技術是一種檢測上皮細胞某種特異性 mRNA（如 EpCAM 或 CKs）的具有代表性的檢測方法[8]。已經證實，在胃癌、結直腸癌和乳腺癌患者中，通過使用 RT-PCR 技術檢測上皮細胞標志物 CEA、CK-7、CK-19 等，來檢測血液中的 CTCs 具有重要臨床意義[9]。然而，由于在良性細胞中的假基因或轉錄產物的存在，可能出現假陽性結果。多重聚合酶鏈反應（如 AdnaGen AG）可以克服這一缺陷，這一系統以主要檢測 3 種與腫瘤有關的轉錄產物，包括雌激素受體（estrogen receptor，ER）、人類表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和免疫組化基因，通過 RT-PCR 磁免疫后富集癌細胞[10]。
1.3 寡核苷酸適配子及其臨床應用
適配子是人工合成的有 RNA 或 DNA 組成的單鏈寡核苷酸，與非核苷酸靶目標物質進行高親和力、高特異性的結合。由于它們的寡核苷酸特性，與抗體相比，具有獨特的化學和生物學特性。因此它們將比上面提到的常規檢測技術更加適合應用于新的臨床發展[11]。Zamay 等[12]的研究表明，寡核苷酸適配子可以和 CK 陽性和 CK 陰性的肺腺癌與肺鱗狀細胞癌患者血液中的腫瘤分子結合。
盡管還存在一些不足之處，但通過檢測上皮細胞標志物來檢測 CTCs 對于臨床診斷是非常有用的[13]。然而，由于上皮細胞標志物的敏感性和特異性存在問題，CTCs 在不同的腫瘤患者的臨床實踐中用于指導治療尚未完全被接受[14]。正如下面所討論的，需要進一步的研究來證明 CTCs 對于臨床應用的重要性。
2 描述 CTCs 惡性表型的其他標志物及其臨床應用
上皮細胞標志物在理論上是可以檢測所有 CTCs，然而并不是所有檢測到的 CTCs 都會導致轉移病變[15]。有的標志物只出現在只有轉移能力的 CTCs，這類標志物可以更好地在臨床中應用。下面所敘述的是這些標志物能夠在惡性腫瘤患者的 CTCs 中被檢測到。
2.1 HER2
HER2 是人表皮生長因子受體。HER2 的過度表達在某些侵襲性乳腺癌或胃癌中起著非常重要的作用。在大約 30% 的乳腺癌或胃癌患者中，HER2 作為生物標志物和分子治療靶點已應用于臨床中[16]。有研究[17]表明，在乳腺癌患者中 HER2 陽性 CTCs 有重要的預后意義，檢出 HER2 陽性的 CTCs 的乳腺癌患者比檢出 HER2 陰性的 CTCs 的患者具有較差的 PFS。Riethdorf 等[18]在 58 例 CTCs 陽性的乳腺癌患者中，有 14 例患者 CTCs 的 HER2 呈陽性表達，其中有 8 例是原發腫瘤 HER2 表達陰性的患者，這些都是應用 CellSearch 技術進行檢測的。Fehm 等[19]也發現，在原發腫瘤 HER2 表達陰性的患者中也可檢測到 HER2 表達陽性的 CTCs，使用 CellSearch 技術檢測的概率是 32%，使用 AdnaTest 技術檢測的概率是 49%。因此，檢測 CTCs 中 HER2 陽性表達水平可以幫助乳腺癌患者確定合適的治療方案，同時也能幫助判斷乳腺癌患者治療的療效[20]。
2.2 ER
ER 在大約 70% 的乳腺癌患者中表達，這些病例被稱為 ER 陽性的乳腺癌患者。ER 水平是通過對癌組織進行免疫組織化學分析得到的。有兩個假設提出了雌激素誘導腫瘤發生的可能機制。首先，雌激素與 ER 結合可以刺激乳腺細胞增生，導致細胞分裂和 DNA 復制增加，從而導致突變。其次，雌激素代謝產生基因毒性廢物。值得注意的是，ER 陽性的乳腺癌患者具有較好的預后[20]，ER 陽性的腫瘤患者通常采用內分泌治療。然而，大約 20% ER 陽性的患者在疾病治療和腫瘤轉移進展預測方面與 ER 陰的患者相比并沒有優勢。在 ER 陽性的轉移性乳腺癌患者中的 CTCs 往往缺乏ER的表達。有研究[21]發現，多種標志物（ER、bcl-2、HER2 和 Ki67）表達的 CTCs 可以預測內分泌治療的抵抗性。因此，在 CTCs 中 ER 表達水平對于患者是否使用內分泌治療，是一個非常有用的決定性指標。
2.3 程序性死亡分子配體（PD-L1）
免疫應答可以通過調節腫瘤浸潤性淋巴細胞活化劑途徑和抑制劑途徑，使其達到一種平衡。PD-L1 與 PD-1 的結合能夠誘導 T 淋巴細胞耐受從而減少細胞免疫應答，有助于防止自身免疫的發生[22]。PD-L1 可以促進腫瘤進展。對 196 例腎癌患者的樣本分析表明，高表達 PD-L1 不僅可以增加腫瘤的侵襲性，也可以增高 4.5 倍的死亡風險[23]。高表達 PD-L1 的卵巢癌患者的預后比低表達 PD-L1 患者的預后差很多，而 PD-L1 的表達與上皮內 CD8 T 淋巴細胞計數呈負相關，表明 PD-L1 可抑制有抗癌作用的 CD8 T 淋巴細胞的產生[24]。
通過對乳腺癌患者 PD-L1 表達的臨床分析發現，PD-L1 僅在 1.7%（66/3 916）乳腺癌患者及 7.9%（24/302）三陰性乳腺癌患者中表達[25]。通過流式細胞儀和免疫細胞化學分析表明，PD-L1 多在 ER 陽性患者及 HER2 陰性乳腺癌患者的 CTCs 中表達；此外，68.8%（11/16）的腫瘤患者 CTCs 中 PD-L1 呈陽性[26]。因此，PD-L1 可作為 CTCs 的重要標志物。
3 循環 CSCs
CSCs 是能夠自我更新并能分化成不同類型腫瘤細胞的細胞。CSCs 被認為作為一種特定的細胞種類在腫瘤中持續存在，并能導致腫瘤的復發和轉移。CSCs 標志物有望在 CTCs 檢測中發揮非常重要的作用。這類細胞我們稱之為循環腫瘤干細胞（CTSCs）[27]。
3.1 醛脫氫酶 1（ALDH1）
Kasimir-Bauer 等[28]應用 AdnaTest 技術評估了原發乳腺癌患者 CTCs 中的干細胞標志物 ALDH1 的表達。該研究發現，5% 的 CTCs 陰性患者的 ALDH1 呈陽性表達，其結果提示，CTCs 的存在和 ALDH1 陽性表達與乳腺癌的預后無關。ALDH1 陽性表達對于三陰乳腺癌是一個獨立的預后因素[29]。研究[30]表明，結直腸癌腫瘤組織中的 ALDH1 明顯高于正常結直腸組織，ALDH1 表達水平與結直腸癌腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和總生存率密切相關。
3.2 EpCAM+/CD44+/CD47+/MET+ 細胞
通過流式細胞技術檢測發現，腫瘤轉移細胞中的 CTCs 細胞能夠表達上皮細胞黏附分子 EpCAM、CD44 及 CD47 和原癌基因（c-met proto-oncogene，MET）[31]。MET 被證實能夠激發腫瘤的轉移和侵襲[32]。在部分轉移癌患者中，EpCAM+/CD44+/CD47+/MET+ 的 CTCs 的數量（并不是EpCAM+ 的 CTCs）與患者較低的總體生存率及有較多的腫瘤轉移部位有關[31]。然而，在肝癌患者，EpCAM+ 的 CTCs 有腫瘤干細胞特性，這些細胞與腫瘤較高的復發率有一定的關系[33]。
3.3 CEA/CK/CD133 mRNA 陽性細胞
在結直腸癌的 CSCs 中，CD133 是一個重要標志物[34]。研究[35]發現，通過 RT-PCR 技術檢測血液中 CEA、CK 及 CD133 mRNA 表達水平，是確定結直腸癌患者復發及預后的有效手段。另外，在 Dukes B 和 C 期的結直腸癌患者，CEA/CK/CD133 mRNA 具有重要的預后價值[35]。
4 循環腫瘤間充質細胞
上皮細胞間充質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞失去細胞極性和細胞間的黏附，獲得了較高的遷移和侵襲、轉化為間充質細胞。引發腫瘤轉移需要腫瘤細胞的侵襲，這需要通過 EMT 來實現。然而，EMT 并不總是需要腫瘤細胞活動[36]。近年有文獻[37]報道表明，EMT 對于腫瘤轉移并不是很重要的，但對于腫瘤的化學耐藥有一定的作用。間充質細胞標志是 CTCs 的潛在標志物。Bitting 等[38]已經開發了一種使用 CellSearch 系統用間充質細胞捕獲 CTCs 的方法，這些細胞都是 OB 蛋白陽性細胞。
通過分析不表達 CK 或 EpCAM 的乳腺癌、卵巢癌或結直腸癌患者的復雜非整倍體 CTCs 發現，在捕獲的細胞中有一個 EMT 表型轉化[39]。有研究[40]表明，間充質 CTCs 以單一細胞或細胞簇形式存在，通過 EMT 調節，包括轉化生長因子（TGF）-β 通路和 FOXC1 基因轉錄因子。此外，EMT 在乳腺癌的血液轉移中起著重要的作用[40]。以上研究結果提示，EMT 導致上皮細胞特性消失，獲得了間充質細胞的特性，因此這可能妨礙使用上皮細胞標志物來檢測 CTCs。
近年檢測到了一種新型 CTCs 標志物，絲束蛋白 3（PLS3），該標志物在上皮癌細胞和間充質癌細胞表型都有表達[41-42]。PLS3 在 EpCAM 陽性的上皮表型和 EpCAM 陰性的間充質細胞表型的 CTCs 中都有表達[42]。在不同腫瘤患者的血液中 PLS3 mRNA 表達是具有臨床意義的，如結直腸癌和乳腺癌[41]。PLS3 基因編碼的是一種蛋白集束調控蛋白因子，它可能是促使腫瘤細胞形成轉移的重要因素，像逃避失巢凋亡、抗化學治療、增加腫瘤干細胞和 EMT 的誘導[42]。有分析表明，CTCs 中 PLS3 表達陽性的腫瘤患者相比 PLS3 表達陰性的腫瘤患者預后越差；CTCs 中 PLS3 表達陽性率和腫瘤患者的預后有著密切的關系，尤其在 Dukes B 和 C 期患者[42]。這對 Dukes B 期結直腸癌患者是否使用輔助化療有著非常重要的作用，因為超過 10% 的 Dukes B 期結直腸癌患者在沒有輔助化療的情況下出現復發。
乳腺癌干細胞（BCSCs）以不同的間充質樣（CD24-/CD44+）和上皮樣細胞（ALDH+）存在，間充質樣和上皮樣 BCSCs 主要集中在腫瘤侵襲前[43]。此外，他們[43]認為，BCSCs 的可塑性賦予了這些細胞浸潤轉移的能力。有目標的選擇 CSCs 有助于檢測和清除 CTCs，這在臨床上是很重要的，也可能是很有必要的。
5 小結與展望
綜上所述，近年來隨著對 CTCs 研究的不斷深入，越來越多的 CTCs 標志物被發現并應用于臨床工作中。CTCs 在臨床上是非常重要并能夠方便進行早期的檢測和轉移癌的治療。但是，由于腫瘤生物特性的異質性，不同腫瘤表面抗原的表達差異很大，目前尚沒有統一的用于臨床判斷腫瘤 CTCs 的分析靶標。但隨著檢測技術的不斷改進，靈敏度和特異度的不斷提高，CTCs 分子檢測在尋找新的腫瘤標志物用于腫瘤診治和判斷預后以及開發新的腫瘤靶向藥物中具有巨大的應用價值。