引用本文： 陳建榮, 朱光輝. CDKL5 在胃癌中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(5): 587-592. doi: 10.7507/1007-9424.201608033 復制
胃癌是世界上最常見且死亡率較高的惡性腫瘤之一[1]。現代醫學已經發展到分子生物學時代甚至基因組學時代，針對胃癌發生、發展的分子生物學研究也如火如荼[2-4]。周期素依賴性激酶樣-5（cyclin-dependent kinase-like 5，CDKL5）基因最早在 1998 年被發現[5]，主要參與細胞周期的調控，并在哺乳動物的中樞神經中參與信號傳導，因此，CDKL5 在腫瘤發生、發展中的作用逐漸受到重視。研究[6]發現，當神經瘤細胞中 CDKL5 的表達被上游 MYCN 基因抑制后，神經瘤細胞的增殖有所減慢，在成人 T 淋巴細胞白血病腫瘤細胞中也得到了類似的結果。然而，針對 CDKL5 在胃癌中的功能及機制的研究仍鳳毛麟角。本研究應用熒光實時定量 PCR 法和 Western blot 法分別檢測胃癌及其相應的癌旁組織中 CDKL5 mRNA 和蛋白表達情況，分析 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者的臨床病理特征之間的關系，并采用免疫熒光方法檢測胃癌細胞株中 CDKL5 蛋白的表達情況。
1 資料與方法
1.1 病例資料和組織樣本來源
收集我院普外科 2014 年 1 月至 2015 年 12 月期間收治并隨訪的 45 例胃癌患者的臨床病理資料，其中男 28 例，女 17 例；年齡 27～85 歲，中位年齡 60 歲。腺癌 43 例，其他類型胃癌 2 例；低分化胃癌 33 例，中高分化胃癌 12 例；腫瘤直徑≥5 cm 者 25 例，<5 cm 者 20 例；有血管浸潤者 28 例，無血管浸潤者 17 例；有淋巴結轉移者 37 例，無淋巴結轉移者 8 例；TNM 分期（根據日本胃癌學會胃癌治療規范第 14 版標準進行綜合評估）Ⅰ 期和 Ⅱ 期者 8 例，Ⅲ 期和 Ⅳ 期者 37 例。新鮮標本獲取經患者及其家屬同意，取自手術切除的胃癌標本及其對應的癌旁組織（距原發灶 3 cm 并獲得病理學證實）。新鮮組織標本一部分置于 4% 多聚甲醛固定 48 h，隨后常規石蠟包埋切片，常溫保存備用。另一部分保存于液氮中備用。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑 Trizol，Invitrogen 公司；氯仿、異丙醇、RT M-MLV 反轉錄試劑盒，Promega 公司；SYBR Premix ExTaq 試劑盒，Takara 公司；BCA 蛋白濃度試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，碧云天公司；30% 丙烯酰胺、Tris-HCl、10% SDS、10% APS、TEMED、PVDF 膜、TBS、彩色預染蛋白分子量標志物（26616），Thermo Scientific 公司；GAPDH 抗體，CST 公司；CDKL5 抗體，Abcam 公司；4% 多聚甲醛、3% 牛血清球蛋白（BSA），雙向西巴斯公司；0.1% Triton-100、Tween-20，上海生工公司；Alexa Fluor 488，Invitrogen 公司；DAPI，碧云天公司。胃癌細胞株 AGS 和 MKN-45 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。
1.2.2 熒光實時定量 PCR 方法 使用 Trizol 裂解組織和細胞，按 Trizol 法提取總 RNA。再用 RT M-MLV 反轉錄試劑盒把總 RNA 反轉錄為 cDNA。使用 SYBR Premix ExTaq 試劑盒進行熒光定量 PCR。使用的引物對為 5′-GGCTTGGATGGAA-GCTTGA-3′和 5′-TCAGACTTCTGGCGTGTATGGA-3′。GAPDH 為內參基因，以內參基因的表達值標準化各處理組的表達值，使用 2–ΔΔCt 法分析 CDKL5 mRNA 的相對表達量。
1.2.3 Western blot 方法 使用蛋白抽提液提取組織和細胞中的總蛋白，用 BCA 蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。使用 SDS-PAGE 分離蛋白，蛋白轉印到 PVDF 膜上，脫脂奶粉溶液 4 ℃ 封閉過夜。膜分別按相應比例稀釋的 CDKL5 和 GAPDH 抗體，一抗孵育，4 ℃ 過夜，二抗孵育 2 h，最后經顯影、定影后觀察結果。分析蛋白條帶的相對水平時，使用 Adobe Photoshop 軟件分析目的蛋白條帶和對應內參蛋白條帶的灰度值（平均灰度×像素），目的蛋白條帶/內參蛋白條帶的灰度比值即為蛋白的相對表達水平。
1.2.4 免疫熒光方法 ①石蠟切片常規脫水，抗原熱修復 20 min 后 3% BSA 封閉 5 h，加入 CDKL5 抗體，滴度 1∶100，室溫孵育 16 h，洗去一抗，用封閉液稀釋 Alexa Fluor 488 山羊抗兔綠色熒光二抗和 DAPI（細胞核染色），室溫下孵育 3 h，洗去二抗，甘油封片。②6 孔板中培養細胞 24 h，使細胞附著在玻璃片上。于 4 ℃ 用 4% 多聚甲醛固定 15 min。37 ℃ 用封閉液孵育 1 h。用 3% BSA 封閉液稀釋 CDKL5 抗體，將玻璃片夾至濕盒中，在表面滴加抗體稀釋液，4 ℃ 孵育 12～16 h。用封閉液稀釋 Alexa Fluor 488 山羊抗兔綠色熒光二抗和 DAPI（細胞核染色），室溫避光孵育 2 h。用 75% 甘油封片。激光共聚焦顯微鏡采集熒光圖像，采用專業圖像分析軟件 Image-pro Plus 6.0 對采集到的熒光染色圖像做半定量分析。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。計量資料采用t 檢驗，多因素分析采用多重逐步回歸分析模型進行。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 熒光實時定量 PCR 法檢測胃癌及其相應癌旁組織中 CDKL5 mRNA 的表達結果
熒光實時定量 PCR 法檢測結果發現，在胃癌組織及其相應癌旁組織中均有 CDKL5 mRNA 表達，其在 45 例胃癌患者中有 44 例（97.8%）胃癌組織中的 CDKL5 mRNA 表達高于其在相應癌旁組織中的表達，只有 1 例（2.2%）其在胃癌組織中的表達低于其在相應癌旁組織中的表達，見圖 1。CDKL5 mRNA 在胃癌組織中的相對表達量明顯高于其在相應癌旁組織中的相對表達量（9.879±10.392 比 1.153±0.159，P=0.000）。
圖1
胃癌及其相應癌旁組織中 CDKL5 mRNA 相對表達量
2.2 Western blot 法檢測胃癌及其相應癌旁組織中 CDKL5 蛋白表達結果
CDKL5 蛋白在胃癌組織中均呈強表達，且在相對分子質量為 107×103 和 85×103 處均有顯影，而其在相應的癌旁組織中均呈弱表達。CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織及其相應癌旁組織中的定性表達結果見圖 2，半定量結果見圖 3。
圖2
CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織及其相應癌旁組織中的定性表達結果 C：胃癌組織；N：癌旁組織
圖3
CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織中的半定量表達結果 與胃癌臨床分期 Ⅰ～Ⅲ 期比較，*P<0.05
胃癌組織中 CDKL5 蛋白在相對分子質量為 85×103 處的相對表達量明顯高于其在相應癌旁組織中的相對表達量（1.154±0.322 比 0.334±0.158，P=0.000），在相對分子質量為 107×103 處的相對表達量也明顯高于其在相應癌旁組織中的相對表達量（0.832±0.225 比 0.264±0.182，P=0.000）。
在 Ⅳ 期胃癌組織中 CDKL5 蛋白在相對分子質量為 85×103 處的相對表達量明顯高于其在 Ⅰ～Ⅲ 期胃癌組織中的表達（1.285±0.107比0.954±0.122，P=0.000；1.285±0.107比0.824±0.105，P=0.000；1.285±0.107比1.008±0.082，P=0.000），在 Ⅳ 期胃癌組織中 CDKL5 蛋白在相對分子質量為 107×103 處的相對表達量明顯高于其在 Ⅰ～Ⅲ 期胃癌組織中的表達（1.038±0.095比0.857±0.093，P=0.000；1.038±0.095比0.342±0.114，P=0.000；1.038±0.095比0.905±0.111，P=0.000）。見圖3。
2.3 免疫熒光法檢測胃癌及其相應癌旁組織中 CDKL5 蛋白表達結果
免疫熒光法檢測 CDKL5 蛋白在胃癌組織中呈強陽性表達，其在相應的癌旁組織中呈弱陽性表達；CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織及其相應的癌旁組織中表達的定性結果見圖 4，半定量結果見圖 5。
圖4
免疫熒光法檢測 CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織及其相應癌旁組織中表達的定性結果（激光共聚焦顯微鏡 ×400）
圖5
免疫熒光法檢測 CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織中表達的半定量結果 與胃癌臨床分期 Ⅰ～Ⅲ 期比較，*P<0.05
CDKL5 蛋白在胃癌組織中的相對表達量明顯高于在其相應的癌旁組織中的相對表達量（270.135±32.758 比 40.672±6.802，P=0.000）；其在 Ⅳ 期胃癌組織中的相對表達量明顯高于其在 Ⅰ～Ⅲ 期胃癌組織中的相對表達量（285.108±10.107比258.394±8.936，P=0.000；285.108±10.107比261.849±12.175，P=0.000；285.108±10.107比268.763±6.738，P=0.000）。見圖 5。
2.4 胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達結果
2.4.1 免疫熒光法檢測胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達結果 在胃癌細胞株 AGS 和 MKN-45 中均有 CDKL5 蛋白表達，見圖 6。
圖6
免疫熒光法檢測胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達結果（激光共聚焦顯微鏡 ×400）
2.4.2 Western blot 法檢測胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達結果 在胃癌細胞株 AGS 和 MKN-45 中，CDKL5 蛋白在相對分子質量為 107×103 和 85×103 處均有顯影，提示 CDKL5 在蛋白水平可能有不同的修飾方式或者表達方式，見圖 7。
圖7
Western blot 法檢測胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達的定性結果
2.5 胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者臨床病理特征的關系
胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者的年齡（P=0.033）、血管浸潤（P=0.007）、T 分期（P=0.049）和 TNM 分期（P=0.041）有關，即胃癌組織中 CDKL5 mRNA 相對表達量在≥60 歲的患者中明顯高于<60 歲的患者、在有血管浸潤患者中明顯高于無血管浸潤患者、在 T3+T4 分期的患者中明顯高于 T1+T2 分期患者、在 TNM 分期 Ⅲ+Ⅳ 期患者中明顯高于 Ⅰ+Ⅱ 期患者；而胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者的性別、腫瘤類型、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結浸潤及 N 分期無關（P>0.05）。見表 1。將單因素分析中有統計學意義的項目納入多重逐步回歸分析，結果顯示，血管浸潤和 TNM 分期是影響胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達的重要因素（P<0.05），見表 2。
表1
胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者臨床病理特征間的關系（
）
表2
影響 CDKL5 表達因素的多重逐步回歸分析結果
3 討論
細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-depen-dent protein kinase，CDK）是主要在細胞周期調控中起作用的蛋白激酶，由于受周期蛋白的激活而得名[7]，它是蛋白質激酶家族中的一員，依賴與細胞周期蛋白的結合來執行細胞周期有序進行中的關鍵功能[8]。不同的 CDK-周期蛋白質復合物使特異的靶蛋白質磷酸化而激發細胞周期各期的順利進行[9]。近年來研究發現，細胞周期調控紊亂是腫瘤發生、發展的重要機理之一[10]，而與 CDK 同源的 CDKL 在其中發揮了重要作用[11-13]。
CDKL5 位于染色體 Xp22，包含 21 個外顯子，屬于脯氨酸亞家族，并與 CDK 高度同源，具有相似的功能結構域，也被稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶 9。早期研究[14]證實，CDKL5 蛋白在人類和嚙齒類動物的中樞神經系統中高表達，其表達異常與神經系統相關疾病如 Hanefeld 型 Rett 綜合征、X-連鎖嬰兒痙攣征、孤獨癥譜系障礙、Angleman 樣綜合征等有關。近年來研究[15-22]發現， CDKL5 蛋白表達的變化與多種腫瘤發生、發展存在相關性，這可能與 CDKL5 結合的蛋白有關，如 Dnmt1[23]、MeCP2[24]、Rac1[25]、NGL-1[26]、PSD-95[27]和 Amph1[28]。
本研究通過實時定量 PCR 法和 Western blot 法檢測發現 CDKL5 mRNA 和蛋白均在胃癌組織中高表達，且血管浸潤和 TNM 分期是影響 CDKL5 mRNA 表達的最重要的影響因素，提示 CDKL5 可作為胃癌組織是否血管浸潤的指標，甚至可作為胃癌預后的指標。免疫熒光檢測結果也證實 CDKL5 蛋白在胃癌組織和胃癌細胞中均有表達，并且 Ⅳ 期胃癌患者癌組織中的蛋白表達明顯高于其在 Ⅰ～Ⅲ 期胃癌患者的癌組織中的表達，充分說明 CDKL5 蛋白與胃癌的臨床分期關系密切。同時我們還發現，胃癌組織和胃癌細胞中 CDKL5 在相對分子質量為 107×103 和 85×103 條帶處均顯影，推測 CDKL5 在蛋白水平有不同的修飾方式或者表達方式，如氨基端和羧基端的修飾、共價修飾（磷酸化、糖基化、羥基化及二硫鍵的形成）、亞基的聚合等，這是否與蛋白功能的調控有關，有待進一步研究。CDKL5 在癌組織中的高表達，為我們尋找到了一個契機，是否與胃癌的發生、發展、侵襲、轉移等有關，更有待進一步研究證實，或許 CDKL5 能作為胃癌治療的新靶點。
綜上所述，對 CDKL5 mRNA 和蛋白在胃癌組織中表達的檢測可能是判斷胃癌預后和轉移的新方法，并對胃癌發生和轉移的機理研究提供了初步的臨床數據分析，進而為尋找靶向治療提供新的潛在靶點。另外，在細胞中檢測出 CDKL5 蛋白的兩條條帶，有可能為 CDKL5 在翻譯及翻譯后修飾水平上的機制研究提供新的思路和方向。
胃癌是世界上最常見且死亡率較高的惡性腫瘤之一[1]。現代醫學已經發展到分子生物學時代甚至基因組學時代，針對胃癌發生、發展的分子生物學研究也如火如荼[2-4]。周期素依賴性激酶樣-5（cyclin-dependent kinase-like 5，CDKL5）基因最早在 1998 年被發現[5]，主要參與細胞周期的調控，并在哺乳動物的中樞神經中參與信號傳導，因此，CDKL5 在腫瘤發生、發展中的作用逐漸受到重視。研究[6]發現，當神經瘤細胞中 CDKL5 的表達被上游 MYCN 基因抑制后，神經瘤細胞的增殖有所減慢，在成人 T 淋巴細胞白血病腫瘤細胞中也得到了類似的結果。然而，針對 CDKL5 在胃癌中的功能及機制的研究仍鳳毛麟角。本研究應用熒光實時定量 PCR 法和 Western blot 法分別檢測胃癌及其相應的癌旁組織中 CDKL5 mRNA 和蛋白表達情況，分析 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者的臨床病理特征之間的關系，并采用免疫熒光方法檢測胃癌細胞株中 CDKL5 蛋白的表達情況。
1 資料與方法
1.1 病例資料和組織樣本來源
收集我院普外科 2014 年 1 月至 2015 年 12 月期間收治并隨訪的 45 例胃癌患者的臨床病理資料，其中男 28 例，女 17 例；年齡 27～85 歲，中位年齡 60 歲。腺癌 43 例，其他類型胃癌 2 例；低分化胃癌 33 例，中高分化胃癌 12 例；腫瘤直徑≥5 cm 者 25 例，<5 cm 者 20 例；有血管浸潤者 28 例，無血管浸潤者 17 例；有淋巴結轉移者 37 例，無淋巴結轉移者 8 例；TNM 分期（根據日本胃癌學會胃癌治療規范第 14 版標準進行綜合評估）Ⅰ 期和 Ⅱ 期者 8 例，Ⅲ 期和 Ⅳ 期者 37 例。新鮮標本獲取經患者及其家屬同意，取自手術切除的胃癌標本及其對應的癌旁組織（距原發灶 3 cm 并獲得病理學證實）。新鮮組織標本一部分置于 4% 多聚甲醛固定 48 h，隨后常規石蠟包埋切片，常溫保存備用。另一部分保存于液氮中備用。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑 Trizol，Invitrogen 公司；氯仿、異丙醇、RT M-MLV 反轉錄試劑盒，Promega 公司；SYBR Premix ExTaq 試劑盒，Takara 公司；BCA 蛋白濃度試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，碧云天公司；30% 丙烯酰胺、Tris-HCl、10% SDS、10% APS、TEMED、PVDF 膜、TBS、彩色預染蛋白分子量標志物（26616），Thermo Scientific 公司；GAPDH 抗體，CST 公司；CDKL5 抗體，Abcam 公司；4% 多聚甲醛、3% 牛血清球蛋白（BSA），雙向西巴斯公司；0.1% Triton-100、Tween-20，上海生工公司；Alexa Fluor 488，Invitrogen 公司；DAPI，碧云天公司。胃癌細胞株 AGS 和 MKN-45 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。
1.2.2 熒光實時定量 PCR 方法 使用 Trizol 裂解組織和細胞，按 Trizol 法提取總 RNA。再用 RT M-MLV 反轉錄試劑盒把總 RNA 反轉錄為 cDNA。使用 SYBR Premix ExTaq 試劑盒進行熒光定量 PCR。使用的引物對為 5′-GGCTTGGATGGAA-GCTTGA-3′和 5′-TCAGACTTCTGGCGTGTATGGA-3′。GAPDH 為內參基因，以內參基因的表達值標準化各處理組的表達值，使用 2–ΔΔCt 法分析 CDKL5 mRNA 的相對表達量。
1.2.3 Western blot 方法 使用蛋白抽提液提取組織和細胞中的總蛋白，用 BCA 蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。使用 SDS-PAGE 分離蛋白，蛋白轉印到 PVDF 膜上，脫脂奶粉溶液 4 ℃ 封閉過夜。膜分別按相應比例稀釋的 CDKL5 和 GAPDH 抗體，一抗孵育，4 ℃ 過夜，二抗孵育 2 h，最后經顯影、定影后觀察結果。分析蛋白條帶的相對水平時，使用 Adobe Photoshop 軟件分析目的蛋白條帶和對應內參蛋白條帶的灰度值（平均灰度×像素），目的蛋白條帶/內參蛋白條帶的灰度比值即為蛋白的相對表達水平。
1.2.4 免疫熒光方法 ①石蠟切片常規脫水，抗原熱修復 20 min 后 3% BSA 封閉 5 h，加入 CDKL5 抗體，滴度 1∶100，室溫孵育 16 h，洗去一抗，用封閉液稀釋 Alexa Fluor 488 山羊抗兔綠色熒光二抗和 DAPI（細胞核染色），室溫下孵育 3 h，洗去二抗，甘油封片。②6 孔板中培養細胞 24 h，使細胞附著在玻璃片上。于 4 ℃ 用 4% 多聚甲醛固定 15 min。37 ℃ 用封閉液孵育 1 h。用 3% BSA 封閉液稀釋 CDKL5 抗體，將玻璃片夾至濕盒中，在表面滴加抗體稀釋液，4 ℃ 孵育 12～16 h。用封閉液稀釋 Alexa Fluor 488 山羊抗兔綠色熒光二抗和 DAPI（細胞核染色），室溫避光孵育 2 h。用 75% 甘油封片。激光共聚焦顯微鏡采集熒光圖像，采用專業圖像分析軟件 Image-pro Plus 6.0 對采集到的熒光染色圖像做半定量分析。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。計量資料采用t 檢驗，多因素分析采用多重逐步回歸分析模型進行。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 熒光實時定量 PCR 法檢測胃癌及其相應癌旁組織中 CDKL5 mRNA 的表達結果
熒光實時定量 PCR 法檢測結果發現，在胃癌組織及其相應癌旁組織中均有 CDKL5 mRNA 表達，其在 45 例胃癌患者中有 44 例（97.8%）胃癌組織中的 CDKL5 mRNA 表達高于其在相應癌旁組織中的表達，只有 1 例（2.2%）其在胃癌組織中的表達低于其在相應癌旁組織中的表達，見圖 1。CDKL5 mRNA 在胃癌組織中的相對表達量明顯高于其在相應癌旁組織中的相對表達量（9.879±10.392 比 1.153±0.159，P=0.000）。
圖1
胃癌及其相應癌旁組織中 CDKL5 mRNA 相對表達量
2.2 Western blot 法檢測胃癌及其相應癌旁組織中 CDKL5 蛋白表達結果
CDKL5 蛋白在胃癌組織中均呈強表達，且在相對分子質量為 107×103 和 85×103 處均有顯影，而其在相應的癌旁組織中均呈弱表達。CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織及其相應癌旁組織中的定性表達結果見圖 2，半定量結果見圖 3。
圖2
CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織及其相應癌旁組織中的定性表達結果 C：胃癌組織；N：癌旁組織
圖3
CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織中的半定量表達結果 與胃癌臨床分期 Ⅰ～Ⅲ 期比較，*P<0.05
胃癌組織中 CDKL5 蛋白在相對分子質量為 85×103 處的相對表達量明顯高于其在相應癌旁組織中的相對表達量（1.154±0.322 比 0.334±0.158，P=0.000），在相對分子質量為 107×103 處的相對表達量也明顯高于其在相應癌旁組織中的相對表達量（0.832±0.225 比 0.264±0.182，P=0.000）。
在 Ⅳ 期胃癌組織中 CDKL5 蛋白在相對分子質量為 85×103 處的相對表達量明顯高于其在 Ⅰ～Ⅲ 期胃癌組織中的表達（1.285±0.107比0.954±0.122，P=0.000；1.285±0.107比0.824±0.105，P=0.000；1.285±0.107比1.008±0.082，P=0.000），在 Ⅳ 期胃癌組織中 CDKL5 蛋白在相對分子質量為 107×103 處的相對表達量明顯高于其在 Ⅰ～Ⅲ 期胃癌組織中的表達（1.038±0.095比0.857±0.093，P=0.000；1.038±0.095比0.342±0.114，P=0.000；1.038±0.095比0.905±0.111，P=0.000）。見圖3。
2.3 免疫熒光法檢測胃癌及其相應癌旁組織中 CDKL5 蛋白表達結果
免疫熒光法檢測 CDKL5 蛋白在胃癌組織中呈強陽性表達，其在相應的癌旁組織中呈弱陽性表達；CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織及其相應的癌旁組織中表達的定性結果見圖 4，半定量結果見圖 5。
圖4
免疫熒光法檢測 CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織及其相應癌旁組織中表達的定性結果（激光共聚焦顯微鏡 ×400）
圖5
免疫熒光法檢測 CDKL5 蛋白在胃癌臨床分期 4 期的癌組織中表達的半定量結果 與胃癌臨床分期 Ⅰ～Ⅲ 期比較，*P<0.05
CDKL5 蛋白在胃癌組織中的相對表達量明顯高于在其相應的癌旁組織中的相對表達量（270.135±32.758 比 40.672±6.802，P=0.000）；其在 Ⅳ 期胃癌組織中的相對表達量明顯高于其在 Ⅰ～Ⅲ 期胃癌組織中的相對表達量（285.108±10.107比258.394±8.936，P=0.000；285.108±10.107比261.849±12.175，P=0.000；285.108±10.107比268.763±6.738，P=0.000）。見圖 5。
2.4 胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達結果
2.4.1 免疫熒光法檢測胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達結果 在胃癌細胞株 AGS 和 MKN-45 中均有 CDKL5 蛋白表達，見圖 6。
圖6
免疫熒光法檢測胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達結果（激光共聚焦顯微鏡 ×400）
2.4.2 Western blot 法檢測胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達結果 在胃癌細胞株 AGS 和 MKN-45 中，CDKL5 蛋白在相對分子質量為 107×103 和 85×103 處均有顯影，提示 CDKL5 在蛋白水平可能有不同的修飾方式或者表達方式，見圖 7。
圖7
Western blot 法檢測胃癌細胞中 CDKL5 蛋白表達的定性結果
2.5 胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者臨床病理特征的關系
胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者的年齡（P=0.033）、血管浸潤（P=0.007）、T 分期（P=0.049）和 TNM 分期（P=0.041）有關，即胃癌組織中 CDKL5 mRNA 相對表達量在≥60 歲的患者中明顯高于<60 歲的患者、在有血管浸潤患者中明顯高于無血管浸潤患者、在 T3+T4 分期的患者中明顯高于 T1+T2 分期患者、在 TNM 分期 Ⅲ+Ⅳ 期患者中明顯高于 Ⅰ+Ⅱ 期患者；而胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者的性別、腫瘤類型、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結浸潤及 N 分期無關（P>0.05）。見表 1。將單因素分析中有統計學意義的項目納入多重逐步回歸分析，結果顯示，血管浸潤和 TNM 分期是影響胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達的重要因素（P<0.05），見表 2。
表1
胃癌組織中 CDKL5 mRNA 表達與胃癌患者臨床病理特征間的關系（
）
表2
影響 CDKL5 表達因素的多重逐步回歸分析結果
3 討論
細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-depen-dent protein kinase，CDK）是主要在細胞周期調控中起作用的蛋白激酶，由于受周期蛋白的激活而得名[7]，它是蛋白質激酶家族中的一員，依賴與細胞周期蛋白的結合來執行細胞周期有序進行中的關鍵功能[8]。不同的 CDK-周期蛋白質復合物使特異的靶蛋白質磷酸化而激發細胞周期各期的順利進行[9]。近年來研究發現，細胞周期調控紊亂是腫瘤發生、發展的重要機理之一[10]，而與 CDK 同源的 CDKL 在其中發揮了重要作用[11-13]。
CDKL5 位于染色體 Xp22，包含 21 個外顯子，屬于脯氨酸亞家族，并與 CDK 高度同源，具有相似的功能結構域，也被稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶 9。早期研究[14]證實，CDKL5 蛋白在人類和嚙齒類動物的中樞神經系統中高表達，其表達異常與神經系統相關疾病如 Hanefeld 型 Rett 綜合征、X-連鎖嬰兒痙攣征、孤獨癥譜系障礙、Angleman 樣綜合征等有關。近年來研究[15-22]發現， CDKL5 蛋白表達的變化與多種腫瘤發生、發展存在相關性，這可能與 CDKL5 結合的蛋白有關，如 Dnmt1[23]、MeCP2[24]、Rac1[25]、NGL-1[26]、PSD-95[27]和 Amph1[28]。
本研究通過實時定量 PCR 法和 Western blot 法檢測發現 CDKL5 mRNA 和蛋白均在胃癌組織中高表達，且血管浸潤和 TNM 分期是影響 CDKL5 mRNA 表達的最重要的影響因素，提示 CDKL5 可作為胃癌組織是否血管浸潤的指標，甚至可作為胃癌預后的指標。免疫熒光檢測結果也證實 CDKL5 蛋白在胃癌組織和胃癌細胞中均有表達，并且 Ⅳ 期胃癌患者癌組織中的蛋白表達明顯高于其在 Ⅰ～Ⅲ 期胃癌患者的癌組織中的表達，充分說明 CDKL5 蛋白與胃癌的臨床分期關系密切。同時我們還發現，胃癌組織和胃癌細胞中 CDKL5 在相對分子質量為 107×103 和 85×103 條帶處均顯影，推測 CDKL5 在蛋白水平有不同的修飾方式或者表達方式，如氨基端和羧基端的修飾、共價修飾（磷酸化、糖基化、羥基化及二硫鍵的形成）、亞基的聚合等，這是否與蛋白功能的調控有關，有待進一步研究。CDKL5 在癌組織中的高表達，為我們尋找到了一個契機，是否與胃癌的發生、發展、侵襲、轉移等有關，更有待進一步研究證實，或許 CDKL5 能作為胃癌治療的新靶點。
綜上所述，對 CDKL5 mRNA 和蛋白在胃癌組織中表達的檢測可能是判斷胃癌預后和轉移的新方法，并對胃癌發生和轉移的機理研究提供了初步的臨床數據分析，進而為尋找靶向治療提供新的潛在靶點。另外，在細胞中檢測出 CDKL5 蛋白的兩條條帶，有可能為 CDKL5 在翻譯及翻譯后修飾水平上的機制研究提供新的思路和方向。
