引用本文： 林熠, 李明霞, 王彥峰, 范曉禮, 鐘自彪, 肖琦, 葉啟發, 李玲, 彭貴主. 黃芪多糖對腦死亡狀態下肝臟的保護作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(3): 275-281. doi: 10.7507/1007-9424.201606072 復制
肝移植是挽救終末期肝病患者生命的唯一有效的治療手段[1-2]。然而，供肝短缺仍是目前制約肝移植事業發展的重要因素。擴大供肝來源成為了肝移植亟待解決的關鍵問題[3]。目前擴大供肝池的有效方法之一是增加邊緣供體的使用，因而對供體器官的維護與修復的研究一直是移植醫學的熱點課題。腦死亡供體往往會出現激素失調、血流動力學不穩定、電解質紊亂等一系列變化，這些生理改變常會加重肝臟損傷，導致受體的預后不良[4-6]。因此，如何提高腦死亡供體的質量越來越受到移植學界的關注。黃芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS），又稱黃芪，是我國傳統中藥的重要組成部分，曾被作為免疫抑制劑廣泛地用于腹瀉、發熱、疲勞、神經性厭食、肝炎等疾病的治療[7-8]。APS 可顯著降低血清天冬氨酸氨基轉移酶（aminotrans-ferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine amino-trans-ferase，ALT）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，并增強肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）的活性[9-10]。同時，文獻[11]表明，APS 能減輕肝損傷，改善抗氧化酶的活性，減少自由基產生和減輕脂質過氧化作用。然而，目前對于 APS 在腦死亡器官捐獻肝臟保護中的作用機制的研究極少。本實驗通過復制漸進性顱內加壓腦死亡模型，觀察 APS 對腦死亡供體肝臟的保護作用并對其機制進行探討。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
清潔級雄性新西蘭兔 24 只，12 周齡，體質量（3.2±0.3）kg，購于萬千佳禾實驗動物養殖中心，均檢疫合格，標準條件下飼養。
1.2 主要試劑及設備
注射用 APS 250 mg（天津賽諾制藥有限公司），腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 檢測試劑盒（美國 Sigma 公司），核轉錄因子 p65 蛋白（NF-κB p65）多克隆大鼠抗兔免疫組化試劑盒由武漢大學醫學院病理教研室提供。設備：JR-1/2 智能恒溫控制儀、BL-420 生物技能實驗系統及 HX-100E 動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司），IJ-6A 低溫離心機（美國 Beckman-Coulter 公司），1650 全自動生化分析儀（美國 Bayer 公司），SPOT-Ⅱ 數碼成像系統（美國 diagnostic instruments 公司）。
1.3 方法
1.3.1 實驗分組 實驗動物管理及人文關懷均遵守 1998 年中華人民共和國國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》及 1996 年美國國家科學院制定的《實驗動物關懷及應用指南》執行。將 24 只健康成年新西蘭兔隨機（隨機數字表法）均分為 3 組：空白對照組、腦死亡組及 APS 組，每組再分為 4 h 和 8 h 兩個時點組，每個時點組 4 只新西蘭兔。腦死亡組動物誘導腦死亡后以常規劑量多巴胺〔2 μg/（kg·min）〕靜脈滴入以維持血壓平穩。APS 組動物誘導麻醉后立即經股靜脈推注注射用 APS 12 mg/kg，其余處理同腦死亡組。空白對照組動物于顱頂鉆孔、顱內置 Foley 球囊導管，但不加壓，維持麻醉。實驗完畢，獲取血液和肝組織標本。
1.3.2 腦死亡模型建立 新西蘭兔術前禁食 12 h，采用 1% 戊巴比妥（40 mg/kg）耳緣靜脈緩慢推注麻醉。麻醉后于股動脈和肛門內分別連接動壓力傳感器進行連續測壓，以智能恒溫控制儀監測并控制體溫。行氣管切開并行 Y 型插管，連接微型呼吸機。分離劍突，通過縫線連接張力傳感器監測呼吸波。于額、頂和枕極顱骨骨膜下埋置腦電圖銀針電極，兩前肢及右后肢連接心電圖導聯。顱頂皮膚切開后顯露顱骨，于正中線偏右處鉆孔，Φ 為 0.5 cm。于硬膜外置入 10 號 Foley 球囊導管，保持硬腦膜完整。經 Foley 球囊導管以 0.4 mL/次漸進式注入生理鹽水，直至自主呼吸停止及腦電圖波動消失。自主呼吸停止后立即連接微型呼吸機，調節參數：潮氣量為 15 mL/kg，呼吸頻率為 35 次/min，吸呼比為 5∶4，氧濃度為 50%。保留導管內生理鹽水以維持顱內高壓至實驗結束。參照中國神經醫學學會制定的《成人腦死亡診斷指南》[4,12]，本實驗腦死亡判定標準符合以下全部條件：① 深昏迷（排除麻醉、低體溫等因素）；② 瞳孔對光反射與角膜反射消失；③ 自主呼吸停止；④ 腦電圖波動消失。腦死亡組和 APS 組動物均造模成功。
1.3.3 肝臟損傷指標檢測 股靜脈采血 5 mL，4 ℃ 離心 20 min（2 000 r/min，r=140 mm）后取上清，采用全自動生化分析儀檢測 AST 和 ALT 水平；采用 ELISA 試劑盒檢測 TNF-α水平，操作按試劑盒說明書進行。
1.3.4 HE 染色 肝臟組織標本用 10% 甲醛固定，常規脫水處理，隨后進行石蠟包埋，4 μm 厚切片，行 HE 染色，光鏡下進行組織學觀察。
1.3.5 免疫組化檢測 采用 SP 免疫組化染色方法檢測肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達，操作步驟參照試劑盒說明書進行，在光學顯微鏡下觀察結果。光學顯微鏡下觀察 NF-κB p65 蛋白呈棕黃色染色。測定陽性表達區域的平均光密度（OD）值，行定量分析。應用 diagnostic instruments 數碼成像系統，在高倍鏡下隨機選擇 5 個視野，采集圖像用定量分析軟件分析，測量陽性區域的OD 值（取均值）。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。本組計量資料服從正態分布或近似正態分布，采用均數±標準差（ ）表示，同時點組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用 SNK 法）；同組內 4 h 和 8 h 比較采用配對t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ALT 和 AST
不論是 4 h 還是 8 h 時，同時點與空白對照組比較，腦死亡組和 APS 組的 ALT 和 AST 水平均較高（P<0.05），且各時點腦死亡組的 ALT 和 AST 水平均高于 APS 組（P<0.05）。同組內比較，8 h 時空白對照組的 ALT 和 AST 水平與 4 h 比較差異均無統計學意義（P>0.05）；8 h 時腦死亡組的 ALT 和 AST 水平與 4 h 時比較均升高（P<0.05）；8 h 時 APS 組的 ALT 水平與 4 h 比較有所升高（P<0.05），但 8 h 時 APS 組的 AST 水平與 4 h 比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
3 組新西蘭兔的血清 ALT 和 AST 水平檢測結果（U/L，
，n=4）
2.2 TNF-α
不論是 4 h 還是 8 h 時，同時點與空白對照組比較，腦死亡組和 APS 組的 TNF-α水平均較高（P<0.05），且各時點腦死亡組的 TNF-α均高于 APS 組（P<0.05）。同組內比較，8 h 時空白對照組的 TNF-α水平與 4 h 比較差異無統計學意義（P>0.05）；8 h 時腦死亡組和 APS 組的 TNF-α水平比 4 h 均有所升高（P<0.05）。見表 2。
表2
3 組新西蘭兔的 TNF-α水平檢測結果（pg/mL，
，n=4）
2.3 HE 染色結果
4 h 時，空白對照組、腦死亡組和 APS 組的肝臟組織結構基本正常，無明顯改變。8 h 時空白對照組的肝臟組織的病理學表現同空白對照組 4 h 時。8 h 時腦死亡組的肝細胞呈氣球樣改變，排列紊亂，胞質疏松淡染呈網狀，匯管區見大量炎性細胞浸潤，肝竇擠壓變窄致微循環障礙，表現為較為明顯的組織損傷。8 h 時 APS 組的肝細胞輕度水腫，排列正常，匯管區少量炎性細胞浸潤，組織形態損傷較腦死亡組 8 h 時明顯減輕（圖 1）。
圖1
示 3 組新西蘭兔肝組織的形態學變化（HE ×400） 1A：空白對照組 4 h；1B：腦死亡組 4 h；1C：APS 組 4 h；1D：空白對照組 8 h；1E：腦死亡組 8 h；1F：APS 組 8 h
2.4 SP 免疫組化染色結果
4 h 時空白對照組、腦死亡組和 APS 組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達相似，弱而分散。8 h 時空白對照組肝臟組織中 NF-κB p65 蛋白的表達同空白對照組 4 h 時。8 h時腦死亡組肝臟組織中NF-κB p65蛋白呈高表達，分布范圍廣。8 h時APS組肝臟組織中NF-κB p65蛋白呈低表達，分布零散。4 h 時，3 組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。8 h 時腦死亡組和 APS 組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平均高于同時點空白對照組（P<0.05），且腦死亡組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平高于 APS 組（P<0.05）。同組內比較，8 h 時空白對照組肝組織中 NF-κB p65 蛋白表達水平與 4 h 比較差異無統計學意義（P>0.05），但 8 h 時腦死亡組和 APS 組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平均高于對應組 4 h 時（P<0.05），見圖 2 和表 3。
圖2
示 3 組新西蘭兔肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達結果（SP ×400） 2A：空白對照組 4 h；2B：腦死亡組 4 h；2C：APS 組 4 h；2D：空白對照組 8 h；2E：腦死亡組 8 h；2F：APS 組 8 h
表3
3 組新西蘭兔肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平結果（×104，
，n=4）
3 討論
實驗[13]表明，腦死亡后機體會有一定程度的損傷，包括肝組織形態、凝血系統、補體系統、細胞增殖分化、物質代謝等都會發生不同程度的改變。ALT 和 AST 是反映肝臟急性損害的敏感指標，其增高程度通常反映肝臟損傷的程度。本實驗結果顯示，不論是 4 h 還是 8 h 時，同時點與空白對照組比較，腦死亡組的 ALT 和 AST 水平均較高（P<0.05）；腦死亡組 8 h 時的 ALT 和 AST 水平均高于 4 h 時（P<0.05），表明腦死亡后肝臟發生明顯損傷，其損傷程度可能與腦死亡時間長短有關。HE 染色結果也顯示，腦死亡組 8 h 時肝組織匯管區有大量炎性細胞浸潤，肝細胞呈氣球樣變，肝竇擠壓變窄致微循環障礙，表現為一系列不可逆的病理變化，而 4 h 時肝臟組織結構基本正常，無明顯改變。進一步證明長時間腦死亡將導致肝臟功能與形態損害的事實。腦死亡后機體損害的原因與機理是非常復雜的。在腦死亡過程中機體會發生強烈的應激反應，此時大量兒茶酚胺釋放，導致肝臟灌注不足，從而造成細胞水腫、肝竇受壓，表現為血流動力學改變[14-15]。
有研究[15]顯示，即使在血流動力學穩定的基礎上，腦死亡后機體的損傷仍漸進性加重。在漸進性顱內加壓腦死亡模型的建立過程中，盡管筆者通過氣管插管以及運用血管活性藥物來維持機體內環境穩態和血流動力學穩定，但肝臟仍發生明顯損害。血管活性藥物多巴胺的使用也會對機體產生一定的影響。大劑量使用多巴胺時極易引起腎動脈收縮，引起腎臟血供急劇減少，造成急性腎小管壞死，影響肝臟的物質代謝[11]。因此，腦死亡被認為是導致移植物失功和受體不良預后的獨立危險因素[16]。本課題組[17]的前期實驗證明，在腦死亡后撤除基本的生命支持，家兔的平均動脈壓和心率會在短時間內迅速下降。腦死亡狀態下，“炎癥風暴”過程中大量兒茶酚胺的分泌會使腸道淤血水腫，從而釋放大量內毒素，對肝臟產生直接毒害作用[18]。肝 Kuffer 細胞可清除內毒素，但同時又可以在內毒素的誘導下產生大量的炎性物質。肝臟 Kuffer 細胞是血清中 TNF-α的重要來源，而內毒素可強烈誘導 TNF-α的產生[19]。NF-κB 是重要的核內轉錄因子，參與腦死亡過程中肝臟的氧化應激、炎癥反應、細胞再生、細胞凋亡等病理生理過程[2,20-21]。本實驗結果顯示，各時點（4 h 和 8 h）腦死亡組的血清 TNF-α 水平、8 h 時肝臟組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平均較空白對照組升高（P<0.05），HE 染色結果（8 h）示肝細胞損傷程度也更為嚴重。進一步說明腦死亡肝損害與炎癥反應關系密切。Van Der Hoeven 等[22]的大鼠腦死亡模型實驗結果與本實驗結果類似，其發現腦死亡后肝臟組織中 NF-κB 的表達上調。而腦死亡后血清中 NF-κB 的升高被認為與炎性因子表達有關[14]。
APS 作為傳統中藥，可減輕脂質過氧化，減輕氧自由基損傷，營養血管。Zhu 等[23]的實驗結果提示，APS 可通過抑制血管內皮細胞和中性粒細胞的黏附來減輕心肌缺血再灌注損傷。李天一等[24]通過對不同劑量 APS 治療小鼠免疫性肝損傷的研究后發現，經 APS 治療后肝細胞腫脹程度和炎性細胞浸潤程度都明顯減輕，血清中的 ALT、AST 及 TNF-α水平也明顯下降。Xue 等[25]認為，APS 可以通過減輕氧化應激損傷及抑制 NF-κB 信號通路的活化來抑制豬圓環病毒 2 型（PCV2）的復制，從而治療與豬圓環病毒相關的疾病。本實驗中，APS 組肝臟的損傷程度明顯較腦死亡組減輕，各時點（4 h 和 8 h）TNF-α水平較腦死亡組低（P<0.05）， 8 h時肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平也較腦死亡組低（P<0.05）。該研究結果提示：APS 對腦死亡后的肝臟具有保護作用，其可能機制為，通過抑制 TNF-α的表達和 NF-κB 信號轉導通路的活化，減輕腦死亡后的炎癥級聯反應及其所導致的損傷。
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肝移植是挽救終末期肝病患者生命的唯一有效的治療手段[1-2]。然而，供肝短缺仍是目前制約肝移植事業發展的重要因素。擴大供肝來源成為了肝移植亟待解決的關鍵問題[3]。目前擴大供肝池的有效方法之一是增加邊緣供體的使用，因而對供體器官的維護與修復的研究一直是移植醫學的熱點課題。腦死亡供體往往會出現激素失調、血流動力學不穩定、電解質紊亂等一系列變化，這些生理改變常會加重肝臟損傷，導致受體的預后不良[4-6]。因此，如何提高腦死亡供體的質量越來越受到移植學界的關注。黃芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS），又稱黃芪，是我國傳統中藥的重要組成部分，曾被作為免疫抑制劑廣泛地用于腹瀉、發熱、疲勞、神經性厭食、肝炎等疾病的治療[7-8]。APS 可顯著降低血清天冬氨酸氨基轉移酶（aminotrans-ferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine amino-trans-ferase，ALT）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，并增強肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）的活性[9-10]。同時，文獻[11]表明，APS 能減輕肝損傷，改善抗氧化酶的活性，減少自由基產生和減輕脂質過氧化作用。然而，目前對于 APS 在腦死亡器官捐獻肝臟保護中的作用機制的研究極少。本實驗通過復制漸進性顱內加壓腦死亡模型，觀察 APS 對腦死亡供體肝臟的保護作用并對其機制進行探討。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
清潔級雄性新西蘭兔 24 只，12 周齡，體質量（3.2±0.3）kg，購于萬千佳禾實驗動物養殖中心，均檢疫合格，標準條件下飼養。
1.2 主要試劑及設備
注射用 APS 250 mg（天津賽諾制藥有限公司），腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 檢測試劑盒（美國 Sigma 公司），核轉錄因子 p65 蛋白（NF-κB p65）多克隆大鼠抗兔免疫組化試劑盒由武漢大學醫學院病理教研室提供。設備：JR-1/2 智能恒溫控制儀、BL-420 生物技能實驗系統及 HX-100E 動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司），IJ-6A 低溫離心機（美國 Beckman-Coulter 公司），1650 全自動生化分析儀（美國 Bayer 公司），SPOT-Ⅱ 數碼成像系統（美國 diagnostic instruments 公司）。
1.3 方法
1.3.1 實驗分組 實驗動物管理及人文關懷均遵守 1998 年中華人民共和國國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》及 1996 年美國國家科學院制定的《實驗動物關懷及應用指南》執行。將 24 只健康成年新西蘭兔隨機（隨機數字表法）均分為 3 組：空白對照組、腦死亡組及 APS 組，每組再分為 4 h 和 8 h 兩個時點組，每個時點組 4 只新西蘭兔。腦死亡組動物誘導腦死亡后以常規劑量多巴胺〔2 μg/（kg·min）〕靜脈滴入以維持血壓平穩。APS 組動物誘導麻醉后立即經股靜脈推注注射用 APS 12 mg/kg，其余處理同腦死亡組。空白對照組動物于顱頂鉆孔、顱內置 Foley 球囊導管，但不加壓，維持麻醉。實驗完畢，獲取血液和肝組織標本。
1.3.2 腦死亡模型建立 新西蘭兔術前禁食 12 h，采用 1% 戊巴比妥（40 mg/kg）耳緣靜脈緩慢推注麻醉。麻醉后于股動脈和肛門內分別連接動壓力傳感器進行連續測壓，以智能恒溫控制儀監測并控制體溫。行氣管切開并行 Y 型插管，連接微型呼吸機。分離劍突，通過縫線連接張力傳感器監測呼吸波。于額、頂和枕極顱骨骨膜下埋置腦電圖銀針電極，兩前肢及右后肢連接心電圖導聯。顱頂皮膚切開后顯露顱骨，于正中線偏右處鉆孔，Φ 為 0.5 cm。于硬膜外置入 10 號 Foley 球囊導管，保持硬腦膜完整。經 Foley 球囊導管以 0.4 mL/次漸進式注入生理鹽水，直至自主呼吸停止及腦電圖波動消失。自主呼吸停止后立即連接微型呼吸機，調節參數：潮氣量為 15 mL/kg，呼吸頻率為 35 次/min，吸呼比為 5∶4，氧濃度為 50%。保留導管內生理鹽水以維持顱內高壓至實驗結束。參照中國神經醫學學會制定的《成人腦死亡診斷指南》[4,12]，本實驗腦死亡判定標準符合以下全部條件：① 深昏迷（排除麻醉、低體溫等因素）；② 瞳孔對光反射與角膜反射消失；③ 自主呼吸停止；④ 腦電圖波動消失。腦死亡組和 APS 組動物均造模成功。
1.3.3 肝臟損傷指標檢測 股靜脈采血 5 mL，4 ℃ 離心 20 min（2 000 r/min，r=140 mm）后取上清，采用全自動生化分析儀檢測 AST 和 ALT 水平；采用 ELISA 試劑盒檢測 TNF-α水平，操作按試劑盒說明書進行。
1.3.4 HE 染色 肝臟組織標本用 10% 甲醛固定，常規脫水處理，隨后進行石蠟包埋，4 μm 厚切片，行 HE 染色，光鏡下進行組織學觀察。
1.3.5 免疫組化檢測 采用 SP 免疫組化染色方法檢測肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達，操作步驟參照試劑盒說明書進行，在光學顯微鏡下觀察結果。光學顯微鏡下觀察 NF-κB p65 蛋白呈棕黃色染色。測定陽性表達區域的平均光密度（OD）值，行定量分析。應用 diagnostic instruments 數碼成像系統，在高倍鏡下隨機選擇 5 個視野，采集圖像用定量分析軟件分析，測量陽性區域的OD 值（取均值）。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。本組計量資料服從正態分布或近似正態分布，采用均數±標準差（ ）表示，同時點組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用 SNK 法）；同組內 4 h 和 8 h 比較采用配對t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ALT 和 AST
不論是 4 h 還是 8 h 時，同時點與空白對照組比較，腦死亡組和 APS 組的 ALT 和 AST 水平均較高（P<0.05），且各時點腦死亡組的 ALT 和 AST 水平均高于 APS 組（P<0.05）。同組內比較，8 h 時空白對照組的 ALT 和 AST 水平與 4 h 比較差異均無統計學意義（P>0.05）；8 h 時腦死亡組的 ALT 和 AST 水平與 4 h 時比較均升高（P<0.05）；8 h 時 APS 組的 ALT 水平與 4 h 比較有所升高（P<0.05），但 8 h 時 APS 組的 AST 水平與 4 h 比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
3 組新西蘭兔的血清 ALT 和 AST 水平檢測結果（U/L，
，n=4）
2.2 TNF-α
不論是 4 h 還是 8 h 時，同時點與空白對照組比較，腦死亡組和 APS 組的 TNF-α水平均較高（P<0.05），且各時點腦死亡組的 TNF-α均高于 APS 組（P<0.05）。同組內比較，8 h 時空白對照組的 TNF-α水平與 4 h 比較差異無統計學意義（P>0.05）；8 h 時腦死亡組和 APS 組的 TNF-α水平比 4 h 均有所升高（P<0.05）。見表 2。
表2
3 組新西蘭兔的 TNF-α水平檢測結果（pg/mL，
，n=4）
2.3 HE 染色結果
4 h 時，空白對照組、腦死亡組和 APS 組的肝臟組織結構基本正常，無明顯改變。8 h 時空白對照組的肝臟組織的病理學表現同空白對照組 4 h 時。8 h 時腦死亡組的肝細胞呈氣球樣改變，排列紊亂，胞質疏松淡染呈網狀，匯管區見大量炎性細胞浸潤，肝竇擠壓變窄致微循環障礙，表現為較為明顯的組織損傷。8 h 時 APS 組的肝細胞輕度水腫，排列正常，匯管區少量炎性細胞浸潤，組織形態損傷較腦死亡組 8 h 時明顯減輕（圖 1）。
圖1
示 3 組新西蘭兔肝組織的形態學變化（HE ×400） 1A：空白對照組 4 h；1B：腦死亡組 4 h；1C：APS 組 4 h；1D：空白對照組 8 h；1E：腦死亡組 8 h；1F：APS 組 8 h
2.4 SP 免疫組化染色結果
4 h 時空白對照組、腦死亡組和 APS 組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達相似，弱而分散。8 h 時空白對照組肝臟組織中 NF-κB p65 蛋白的表達同空白對照組 4 h 時。8 h時腦死亡組肝臟組織中NF-κB p65蛋白呈高表達，分布范圍廣。8 h時APS組肝臟組織中NF-κB p65蛋白呈低表達，分布零散。4 h 時，3 組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。8 h 時腦死亡組和 APS 組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平均高于同時點空白對照組（P<0.05），且腦死亡組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平高于 APS 組（P<0.05）。同組內比較，8 h 時空白對照組肝組織中 NF-κB p65 蛋白表達水平與 4 h 比較差異無統計學意義（P>0.05），但 8 h 時腦死亡組和 APS 組肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平均高于對應組 4 h 時（P<0.05），見圖 2 和表 3。
圖2
示 3 組新西蘭兔肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達結果（SP ×400） 2A：空白對照組 4 h；2B：腦死亡組 4 h；2C：APS 組 4 h；2D：空白對照組 8 h；2E：腦死亡組 8 h；2F：APS 組 8 h
表3
3 組新西蘭兔肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平結果（×104，
，n=4）
3 討論
實驗[13]表明，腦死亡后機體會有一定程度的損傷，包括肝組織形態、凝血系統、補體系統、細胞增殖分化、物質代謝等都會發生不同程度的改變。ALT 和 AST 是反映肝臟急性損害的敏感指標，其增高程度通常反映肝臟損傷的程度。本實驗結果顯示，不論是 4 h 還是 8 h 時，同時點與空白對照組比較，腦死亡組的 ALT 和 AST 水平均較高（P<0.05）；腦死亡組 8 h 時的 ALT 和 AST 水平均高于 4 h 時（P<0.05），表明腦死亡后肝臟發生明顯損傷，其損傷程度可能與腦死亡時間長短有關。HE 染色結果也顯示，腦死亡組 8 h 時肝組織匯管區有大量炎性細胞浸潤，肝細胞呈氣球樣變，肝竇擠壓變窄致微循環障礙，表現為一系列不可逆的病理變化，而 4 h 時肝臟組織結構基本正常，無明顯改變。進一步證明長時間腦死亡將導致肝臟功能與形態損害的事實。腦死亡后機體損害的原因與機理是非常復雜的。在腦死亡過程中機體會發生強烈的應激反應，此時大量兒茶酚胺釋放，導致肝臟灌注不足，從而造成細胞水腫、肝竇受壓，表現為血流動力學改變[14-15]。
有研究[15]顯示，即使在血流動力學穩定的基礎上，腦死亡后機體的損傷仍漸進性加重。在漸進性顱內加壓腦死亡模型的建立過程中，盡管筆者通過氣管插管以及運用血管活性藥物來維持機體內環境穩態和血流動力學穩定，但肝臟仍發生明顯損害。血管活性藥物多巴胺的使用也會對機體產生一定的影響。大劑量使用多巴胺時極易引起腎動脈收縮，引起腎臟血供急劇減少，造成急性腎小管壞死，影響肝臟的物質代謝[11]。因此，腦死亡被認為是導致移植物失功和受體不良預后的獨立危險因素[16]。本課題組[17]的前期實驗證明，在腦死亡后撤除基本的生命支持，家兔的平均動脈壓和心率會在短時間內迅速下降。腦死亡狀態下，“炎癥風暴”過程中大量兒茶酚胺的分泌會使腸道淤血水腫，從而釋放大量內毒素，對肝臟產生直接毒害作用[18]。肝 Kuffer 細胞可清除內毒素，但同時又可以在內毒素的誘導下產生大量的炎性物質。肝臟 Kuffer 細胞是血清中 TNF-α的重要來源，而內毒素可強烈誘導 TNF-α的產生[19]。NF-κB 是重要的核內轉錄因子，參與腦死亡過程中肝臟的氧化應激、炎癥反應、細胞再生、細胞凋亡等病理生理過程[2,20-21]。本實驗結果顯示，各時點（4 h 和 8 h）腦死亡組的血清 TNF-α 水平、8 h 時肝臟組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平均較空白對照組升高（P<0.05），HE 染色結果（8 h）示肝細胞損傷程度也更為嚴重。進一步說明腦死亡肝損害與炎癥反應關系密切。Van Der Hoeven 等[22]的大鼠腦死亡模型實驗結果與本實驗結果類似，其發現腦死亡后肝臟組織中 NF-κB 的表達上調。而腦死亡后血清中 NF-κB 的升高被認為與炎性因子表達有關[14]。
APS 作為傳統中藥，可減輕脂質過氧化，減輕氧自由基損傷，營養血管。Zhu 等[23]的實驗結果提示，APS 可通過抑制血管內皮細胞和中性粒細胞的黏附來減輕心肌缺血再灌注損傷。李天一等[24]通過對不同劑量 APS 治療小鼠免疫性肝損傷的研究后發現，經 APS 治療后肝細胞腫脹程度和炎性細胞浸潤程度都明顯減輕，血清中的 ALT、AST 及 TNF-α水平也明顯下降。Xue 等[25]認為，APS 可以通過減輕氧化應激損傷及抑制 NF-κB 信號通路的活化來抑制豬圓環病毒 2 型（PCV2）的復制，從而治療與豬圓環病毒相關的疾病。本實驗中，APS 組肝臟的損傷程度明顯較腦死亡組減輕，各時點（4 h 和 8 h）TNF-α水平較腦死亡組低（P<0.05）， 8 h時肝組織中 NF-κB p65 蛋白的表達水平也較腦死亡組低（P<0.05）。該研究結果提示：APS 對腦死亡后的肝臟具有保護作用，其可能機制為，通過抑制 TNF-α的表達和 NF-κB 信號轉導通路的活化，減輕腦死亡后的炎癥級聯反應及其所導致的損傷。
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