引用本文： 趙大江, 李同昌, 王彪, 段秀慶. 模擬微重力培養對大鼠甲狀旁腺細胞形態及分泌功能的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(2): 179-184. doi: 10.7507/1007-9424.201606022 復制
甲狀旁腺移植治療甲狀旁腺功能減退癥的研究已歷經百年的探索和嘗試，國內外許多醫院都在開展對此種治療方法的研究，并已試用于臨床，且取得了良好的近期效果。然而足夠數量和功能良好的甲狀旁腺細胞是保證移植成功的關鍵。目前，甲狀旁腺細胞的培養依然局限于二維平面培養的方式。因此，本研究在旋轉細胞培養系統（rotary cell culture system，RCCS）提供的模擬微重力環境下三維培養甲狀旁腺細胞，研究其形態和分泌功能，以便探索甲狀旁腺細胞更為優良的培養技術。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
雄性 Wistar 大鼠，37 只，體質量 150～200 g，由哈爾濱醫科大學第一附屬醫院實驗動物中心提供。細胞支架：聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）購于美國 Synthecon 公司。RCCS-L 型回轉式生物反應器購自 Synthecon 公司。胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司。RPMI-1640 培養基、膠原酶 Ⅱ、吖啶橙及碘化丙啶購于 Sigma 公司。
1.2 大鼠甲狀旁腺組織的切取[1 ]
1% 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。仰臥位，頸胸部備皮，常規碘伏消毒。于頸部正中縱行切開皮膚，鈍性分離頸前組織，向兩側牽開頸前肌群，顯露氣管及雙側甲狀腺，于 10 倍解剖顯微鏡下仔細觀察辨認，甲狀腺組織為暗紅色，呈蝴蝶狀位于甲狀軟骨和氣管環兩側，鈍性分離胸骨甲狀肌，可見呈乳白色或灰白色的組織，即為甲狀旁腺，顯微剪剪下后經病理證實。
1.3 大鼠甲狀旁腺細胞的培養
將手術切取并經病理檢測證實的甲狀旁腺組織用 4 ℃ 含雙抗(青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL)的 RPMI-1640 培養基反復吹打漂洗 2 次，吸棄培養基，用顯微剪將甲狀旁腺組織剪碎成糊狀移入 10 mL 離心管中，加入 2 mL 0.25% 膠原酶 Ⅱ 后在 38 ℃ 恒溫水浴中振蕩消化 20 min。然后用含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養液 2 mL終止消化。用 100 目無菌不銹鋼網過濾后離心去上清，沉淀物加入含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養瓶中，調整細胞濃度為1×105個細胞/mL。同時，用臺盼藍染色計數細胞活力，細胞存活率>95%。將培養瓶置于 37 ℃含 5% CO2 和 95% 空氣的恒溫培養箱中培養。
1.4 PGA支架的預處理
將 PGA 支架剪切成規格為 5 mm×4 mm×1 mm 大小的小塊，漂洗干凈，75% 乙醇浸泡 30 min，然后取出用無菌 PBS 洗滌 3 次后，自然晾干，備用。
1.5 實驗分組及處理
將經膠原酶 Ⅱ 消化獲取的甲狀旁腺細胞，根據培養條件不同，分為 3 組。
1.5.1 普通培養組 單純甲狀旁腺細胞靜置培養。取 2 mL 濃度為 1×105個細胞/mL 的原代甲狀旁腺細胞懸液移入 10 mL 培養瓶中，置于 37 ℃ 含 5% CO2 和 95% 空氣的恒溫培養箱中培養。
1.5.2 PGA 支架培養組 甲狀旁腺細胞接種在 PGA 支架上靜置培養。接種培養前，先將固定規格的 PGA 支架置于含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養液中孵育過夜。接種時，將已預濕的 PGA 支架置于 6 孔培養板中，取 2 mL 密度為 1×105個細胞/mL 的細胞懸液，再用吸管將其緩慢逐滴均勻地滴加于 4 塊 PGA 支架材料上。將此 6 孔培養板置于 37 ℃ 含 5% CO2 和 95% 空氣的恒溫培養箱中培養。
1.5.3 微重力培養組 甲狀旁腺細胞和 PGA 支架在模擬微重力環境中共培養。取 10 mL 密度為 1×105個細胞/mL 的甲狀旁腺細胞懸液，將事先已預濕的 20 塊 PGA 支架置于上述細胞懸液中，輕輕混勻，在 CO2 培養箱中預孵育 30 min。取容積為 10 mL 的 RCCS-L 型回轉式生物反應器，在無菌條件下安裝備好。關閉兩個取樣孔閥門，經注液孔緩緩注入已孵育的含 PGA 支架的細胞懸液，充滿整個容器。去除容器中所有氣泡，將微重力裝置放于培養箱中，調節轉速，以載體不接觸容器各壁為宜。
1.6 觀測指標
1.6.1 觀察細胞形態 分別于細胞培養第 1、3、5 和 7 天時用相差倒置顯微鏡觀察各組細胞的生長形態。
1.6.2 測定細胞分泌功能 在無菌技術下，于細胞培養第 1、3、5、7 天時離心獲得各組培養細胞的上清液 1～2 mL，裝入EP管，貼好標簽，放–20 ℃冰箱中保存，待統一融化檢測甲狀旁腺激素（PTH）水平。
1.6.3 細胞活性測定 取 0.01 mL 吖啶橙儲液與 1 mL 碘化丙啶儲液混合，加 9 mL PBS 稀釋 10 倍，混勻，取適量與培養第 1、3、5、7 天的甲狀旁腺細胞（離心所得）混合，培養箱中孵育 5 min 后，在共聚焦熒光顯微鏡下，用 490 nm 激發光濾光片，510 nm 光柵濾光片可同時見到綠色（吖啶橙）和紅色（碘化丙啶）熒光。活細胞顯綠色，死細胞顯紅色。細胞存活率=（綠色熒光細胞/紅色熒光細胞+綠色熒光細胞）×100%。每份樣本重復計算 4 次，取其平均值。
1.7 統計學方法
采用 Sigmplot 軟件對數據進行分析。實驗數據以均數±標準差（ ）表示；組間比較行獨立樣本t 檢驗，組內比較行配對樣本t 檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 甲狀旁腺細胞的生長形態觀察結果
2.1.1 普通培養組 培養后第 1 天時，細胞絕大部分附于培養瓶底面，呈現明顯的聚集性，少量單個細胞懸浮在培養液中；第 3 天時，細胞已貼壁生長，大部分細胞團周邊的細胞明顯延展，少數單個貼壁細胞仍呈圓形，勻質且透明；第 5 天時，幾乎所有細胞已延展，細胞相互接壤成片，呈多角形或星形，核圓，居中，呈現上皮細胞的形態特征；第 7 天時，大部分細胞形態良好，部分細胞團中心出現白色壞死灶，培養液中懸浮細胞及細胞碎片較前增多，并可見少量成纖維細胞貼壁生長。見圖 1。
圖1
普通培養組培養后不同時相下細胞形態觀察結果（相差倒置顯微鏡 ×100） a：第 5 天；b：第 7 天
2.1.2 PGA 支架培養組 細胞接種于 PGA 支架上第 1 天時，見網狀支架表面不少細胞附著，少量單個細胞進入支架空隙內部，6 孔培養板底部亦可見大量細胞；第 3 天時，支架表面及內部細胞未見延展，仍呈圓形，板底面的細胞已開始呈放射狀延展，輕輕晃動培養板，細胞無游離支架現象；第 5 天時，細胞在支架上附著牢固，少數細胞開始沿支架向兩極延伸，細胞呈短梭形或多角形，板底面的細胞已充分延展；第 7 天時，支架上大部分細胞沿 PGA 纖維縱軸方向向兩極伸展，相鄰支架被細胞外基質連接。見圖 2。
圖2
PGA支架培養組培養后不同時相下細胞形態觀察結果（相差倒置顯微鏡 ×200） a：第 5 天；b：第 7 天
2.1.3 微重力培養組 在微重力環境中培養后第 1 天時，見大量細胞散布在 PGA 纖維網狀支架表面及空隙中，以支架邊緣附著的細胞密集，細胞呈圓形；第 3 天時，PGA 支架上黏附的細胞數較前明顯增加，均勻分布于支架表面和內部，細胞與支架黏附較為緊密，開始聚集成團，未見細胞延展；第 5 天時，支架表面和空隙中細胞密布，在不同的焦距下均清晰可見不同的細胞，細胞仍呈圓形，大量聚集成團；第 7 天時，細胞團較前增大增多，可見少量細胞碎片開始游離出來。見圖 3。
圖3
微重力培養組培養后不同時相下細胞形態觀察結果（相差倒置顯微鏡 ×200） a：第 5 天；b：第 7 天
2.2 各組細胞培養液中 PTH 值測定結果
各組細胞培養液中 PTH 值檢測結果見表 1。從表 1 可見，培養后第 1 天時，普通培養組和 PGA 支架培養組的 PTH 值比較差異無統計學意義（P>0.05），微重力培養組的 PTH 值明顯高于普通培養組（P<0.05）；培養后第 3、5 及 7 天時，PGA 支架培養組和微重力培養組的 PTH 值均明顯高于普通培養組（P<0.05），微重力培養組的 PTH 值明顯高于 PGA 支架培養組（P<0.05）。
表1
培養不同時相后各組細胞培養液中 PTH 值比較（ng/L，
）
2.3 各組細胞活性測定結果
各組細胞活性檢測結果見圖 4 和表 2。從表 2 可見，培養后第 1 天時，各組之間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；培養后第 3、5 天時，普通培養組與 PGA 支架培養組間比較差異無統計學意義（P>0.05），微重力培養組的細胞存活率明顯高于普通培養組（P<0.05）和 PGA 支架培養組（P<0.05）；培養后第 7 天時，PGA 支架培養組和微重力培養組的細胞存活率均明顯高于普通培養組（P<0.05），且微重力培養組的細胞存活率明顯高于 PGA 支架培養組（P<0.05）。
表2
培養不同時相后各組細胞存活率比較（%，
）
圖4
不同培養環境下培養至第 5 天時的細胞形態觀察結果（熒光顯微鏡 ×200） a：普通培養組，細胞存活率為 80.4%；b：微重力培養組，細胞存活率為 89.1%
3 討論
甲狀旁腺移植是甲狀旁腺功能減退患者獲得生理性血鈣水平的理想途徑[2]。 隨著細胞、生物材料、移植免疫等技術的進步，甲狀旁腺移植的方法和療效都取得了較大的進展[3-4]。但如何找到充足的移植來源、降低移植物的免疫原性以及延長移植后移植組織的存活時間，一直是困擾外科醫生的核心問題[5]。目前，甲狀旁腺細胞的培養依然局限于二維平面培養的方式，本研究在 RCCS 提供的模擬微重力環境下三維培養甲狀旁腺細胞，而微重力組織工程的核心技術是建立動物細胞的三維培養體系[6]。
模擬微重力環境對動物細胞的體外培養有如下優點[7-12]：① 培養液對細胞的機械剪切力小。② 正常的重力向量被持續隨機化，可能直接或間接地促進細胞的自分泌以及旁分泌，也可能對細胞基因表達產生影響，更加有利于細胞與細胞之間信號的轉導。③ 細胞生長在三維空間中，不易形成中心壞死，對維持細胞正常功能具有重要作用。④ 具有高保真度的優點。⑤ 在微重力培養條件下，細胞、支架和培養液在類似自由落體的狀態下運動，細胞和支架載體形成一種持續動態的接種，懸浮著的細胞可以不斷有機會與支架接觸而黏附，從而使細胞在載體表面及載體內部產生較均勻的分布。而靜置培養時，由于培養容器中的培養液無法動態混合，支架內部代謝廢物不易排出，容易在局部蓄積，使局部環境的 pH 值發生變化，另外，營養物質和氧氣也難以輸送給中心部位的細胞，因此，中心部位細胞極易發生生長停滯或死亡。
本研究結果發現，普通培養組的細胞在培養第 3 天時已經開始延展，第 5 天時幾乎所有細胞都已伸展，呈現多角形或星形；PGA支架培養組細胞于培養第 5 天時開始沿支架向兩極延伸，呈現短梭形或多角形，第 7 天時，支架上細胞大部分沿 PGA 纖維縱軸方向向兩極伸展；而微重力培養組的細胞在培養第 7 天時細胞仍呈圓形，聚集成團，并逐漸增大。細胞相互聚集成團，有利于細胞與細胞之間的信號傳遞，更加有利于細胞外基質在細胞周圍的固守，而細胞外基質能對細胞的增殖分化、生長代謝發揮巨大的調節作用，從而為細胞的生長代謝及功能發揮創造更加適宜的微環境[13]。細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質之間的聯系調控細胞骨架蛋白基因的表達，從而使細胞呈現不同的形態，而細胞的形態與細胞功能密切相關[14]。
本研究中，在細胞培養的第 1、3、5、7 天時，取適量細胞進行吖啶橙和碘化丙啶染色，檢測細胞存活情況，結果顯示，除第 1 天外，微重力培養組細胞存活率均明顯高于 PGA 支架培養組（P<0.05）和普通培養組（P<0.05），且PTH值也均明顯高于PGA支架培養組和普通培養組（P<0.05）。PGA 支架培養組細胞培養液中 PTH 濃度均明顯高于普通培養組。我們認為，可能由于普通培養組是二維培養，營養物質的吸收及代謝廢物的排出受到了限制，加速了甲狀旁腺細胞的死亡；而 PGA 支架培養組的細胞由于有了 PGA 支架的支持和維護，使細胞成三維立體生長，而三維培養更加有利于營養成分的吸收和氣體的交換以及代謝廢物的排出，所以與普通培養組相比，支架組甲狀旁腺細胞的活性較強，細胞存活率高于普通培養組。同時我們還發現，各培養組細胞分泌峰值均是在培養后的第 5 天，第 7 天開始下降，由此推測培養 5 d 的甲狀旁腺細胞分泌功能最強，狀態最佳，可作為移植的最佳供體[15]。考慮原因可能為：①細胞培養前幾日測出的 PTH 可能主要為細胞已合成儲存在細胞體內的 PTH；②體外培養的甲狀旁腺細胞由于缺乏 PTH 合成的原料及相關細胞因子，其合成 PTH 的能力處于較低的水平；③體外培養的甲狀旁腺細胞的增殖及分化功能較分泌功能顯著。
本實驗結果提示，甲狀旁腺細胞和 PGA 支架共培養，細胞能在 PGA 支架上黏附生長并形成三維立體的生長方式，細胞形態良好，PGA 支架上的細胞存活率高，分泌 PTH 功能較好，PGA 支架可以作為甲狀旁腺細胞培養的良好載體。
甲狀旁腺移植治療甲狀旁腺功能減退癥的研究已歷經百年的探索和嘗試，國內外許多醫院都在開展對此種治療方法的研究，并已試用于臨床，且取得了良好的近期效果。然而足夠數量和功能良好的甲狀旁腺細胞是保證移植成功的關鍵。目前，甲狀旁腺細胞的培養依然局限于二維平面培養的方式。因此，本研究在旋轉細胞培養系統（rotary cell culture system，RCCS）提供的模擬微重力環境下三維培養甲狀旁腺細胞，研究其形態和分泌功能，以便探索甲狀旁腺細胞更為優良的培養技術。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
雄性 Wistar 大鼠，37 只，體質量 150～200 g，由哈爾濱醫科大學第一附屬醫院實驗動物中心提供。細胞支架：聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）購于美國 Synthecon 公司。RCCS-L 型回轉式生物反應器購自 Synthecon 公司。胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司。RPMI-1640 培養基、膠原酶 Ⅱ、吖啶橙及碘化丙啶購于 Sigma 公司。
1.2 大鼠甲狀旁腺組織的切取[1 ]
1% 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。仰臥位，頸胸部備皮，常規碘伏消毒。于頸部正中縱行切開皮膚，鈍性分離頸前組織，向兩側牽開頸前肌群，顯露氣管及雙側甲狀腺，于 10 倍解剖顯微鏡下仔細觀察辨認，甲狀腺組織為暗紅色，呈蝴蝶狀位于甲狀軟骨和氣管環兩側，鈍性分離胸骨甲狀肌，可見呈乳白色或灰白色的組織，即為甲狀旁腺，顯微剪剪下后經病理證實。
1.3 大鼠甲狀旁腺細胞的培養
將手術切取并經病理檢測證實的甲狀旁腺組織用 4 ℃ 含雙抗(青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL)的 RPMI-1640 培養基反復吹打漂洗 2 次，吸棄培養基，用顯微剪將甲狀旁腺組織剪碎成糊狀移入 10 mL 離心管中，加入 2 mL 0.25% 膠原酶 Ⅱ 后在 38 ℃ 恒溫水浴中振蕩消化 20 min。然后用含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養液 2 mL終止消化。用 100 目無菌不銹鋼網過濾后離心去上清，沉淀物加入含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養瓶中，調整細胞濃度為1×105個細胞/mL。同時，用臺盼藍染色計數細胞活力，細胞存活率>95%。將培養瓶置于 37 ℃含 5% CO2 和 95% 空氣的恒溫培養箱中培養。
1.4 PGA支架的預處理
將 PGA 支架剪切成規格為 5 mm×4 mm×1 mm 大小的小塊，漂洗干凈，75% 乙醇浸泡 30 min，然后取出用無菌 PBS 洗滌 3 次后，自然晾干，備用。
1.5 實驗分組及處理
將經膠原酶 Ⅱ 消化獲取的甲狀旁腺細胞，根據培養條件不同，分為 3 組。
1.5.1 普通培養組 單純甲狀旁腺細胞靜置培養。取 2 mL 濃度為 1×105個細胞/mL 的原代甲狀旁腺細胞懸液移入 10 mL 培養瓶中，置于 37 ℃ 含 5% CO2 和 95% 空氣的恒溫培養箱中培養。
1.5.2 PGA 支架培養組 甲狀旁腺細胞接種在 PGA 支架上靜置培養。接種培養前，先將固定規格的 PGA 支架置于含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養液中孵育過夜。接種時，將已預濕的 PGA 支架置于 6 孔培養板中，取 2 mL 密度為 1×105個細胞/mL 的細胞懸液，再用吸管將其緩慢逐滴均勻地滴加于 4 塊 PGA 支架材料上。將此 6 孔培養板置于 37 ℃ 含 5% CO2 和 95% 空氣的恒溫培養箱中培養。
1.5.3 微重力培養組 甲狀旁腺細胞和 PGA 支架在模擬微重力環境中共培養。取 10 mL 密度為 1×105個細胞/mL 的甲狀旁腺細胞懸液，將事先已預濕的 20 塊 PGA 支架置于上述細胞懸液中，輕輕混勻，在 CO2 培養箱中預孵育 30 min。取容積為 10 mL 的 RCCS-L 型回轉式生物反應器，在無菌條件下安裝備好。關閉兩個取樣孔閥門，經注液孔緩緩注入已孵育的含 PGA 支架的細胞懸液，充滿整個容器。去除容器中所有氣泡，將微重力裝置放于培養箱中，調節轉速，以載體不接觸容器各壁為宜。
1.6 觀測指標
1.6.1 觀察細胞形態 分別于細胞培養第 1、3、5 和 7 天時用相差倒置顯微鏡觀察各組細胞的生長形態。
1.6.2 測定細胞分泌功能 在無菌技術下，于細胞培養第 1、3、5、7 天時離心獲得各組培養細胞的上清液 1～2 mL，裝入EP管，貼好標簽，放–20 ℃冰箱中保存，待統一融化檢測甲狀旁腺激素（PTH）水平。
1.6.3 細胞活性測定 取 0.01 mL 吖啶橙儲液與 1 mL 碘化丙啶儲液混合，加 9 mL PBS 稀釋 10 倍，混勻，取適量與培養第 1、3、5、7 天的甲狀旁腺細胞（離心所得）混合，培養箱中孵育 5 min 后，在共聚焦熒光顯微鏡下，用 490 nm 激發光濾光片，510 nm 光柵濾光片可同時見到綠色（吖啶橙）和紅色（碘化丙啶）熒光。活細胞顯綠色，死細胞顯紅色。細胞存活率=（綠色熒光細胞/紅色熒光細胞+綠色熒光細胞）×100%。每份樣本重復計算 4 次，取其平均值。
1.7 統計學方法
采用 Sigmplot 軟件對數據進行分析。實驗數據以均數±標準差（ ）表示；組間比較行獨立樣本t 檢驗，組內比較行配對樣本t 檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 甲狀旁腺細胞的生長形態觀察結果
2.1.1 普通培養組 培養后第 1 天時，細胞絕大部分附于培養瓶底面，呈現明顯的聚集性，少量單個細胞懸浮在培養液中；第 3 天時，細胞已貼壁生長，大部分細胞團周邊的細胞明顯延展，少數單個貼壁細胞仍呈圓形，勻質且透明；第 5 天時，幾乎所有細胞已延展，細胞相互接壤成片，呈多角形或星形，核圓，居中，呈現上皮細胞的形態特征；第 7 天時，大部分細胞形態良好，部分細胞團中心出現白色壞死灶，培養液中懸浮細胞及細胞碎片較前增多，并可見少量成纖維細胞貼壁生長。見圖 1。
圖1
普通培養組培養后不同時相下細胞形態觀察結果（相差倒置顯微鏡 ×100） a：第 5 天；b：第 7 天
2.1.2 PGA 支架培養組 細胞接種于 PGA 支架上第 1 天時，見網狀支架表面不少細胞附著，少量單個細胞進入支架空隙內部，6 孔培養板底部亦可見大量細胞；第 3 天時，支架表面及內部細胞未見延展，仍呈圓形，板底面的細胞已開始呈放射狀延展，輕輕晃動培養板，細胞無游離支架現象；第 5 天時，細胞在支架上附著牢固，少數細胞開始沿支架向兩極延伸，細胞呈短梭形或多角形，板底面的細胞已充分延展；第 7 天時，支架上大部分細胞沿 PGA 纖維縱軸方向向兩極伸展，相鄰支架被細胞外基質連接。見圖 2。
圖2
PGA支架培養組培養后不同時相下細胞形態觀察結果（相差倒置顯微鏡 ×200） a：第 5 天；b：第 7 天
2.1.3 微重力培養組 在微重力環境中培養后第 1 天時，見大量細胞散布在 PGA 纖維網狀支架表面及空隙中，以支架邊緣附著的細胞密集，細胞呈圓形；第 3 天時，PGA 支架上黏附的細胞數較前明顯增加，均勻分布于支架表面和內部，細胞與支架黏附較為緊密，開始聚集成團，未見細胞延展；第 5 天時，支架表面和空隙中細胞密布，在不同的焦距下均清晰可見不同的細胞，細胞仍呈圓形，大量聚集成團；第 7 天時，細胞團較前增大增多，可見少量細胞碎片開始游離出來。見圖 3。
圖3
微重力培養組培養后不同時相下細胞形態觀察結果（相差倒置顯微鏡 ×200） a：第 5 天；b：第 7 天
2.2 各組細胞培養液中 PTH 值測定結果
各組細胞培養液中 PTH 值檢測結果見表 1。從表 1 可見，培養后第 1 天時，普通培養組和 PGA 支架培養組的 PTH 值比較差異無統計學意義（P>0.05），微重力培養組的 PTH 值明顯高于普通培養組（P<0.05）；培養后第 3、5 及 7 天時，PGA 支架培養組和微重力培養組的 PTH 值均明顯高于普通培養組（P<0.05），微重力培養組的 PTH 值明顯高于 PGA 支架培養組（P<0.05）。
表1
培養不同時相后各組細胞培養液中 PTH 值比較（ng/L，
）
2.3 各組細胞活性測定結果
各組細胞活性檢測結果見圖 4 和表 2。從表 2 可見，培養后第 1 天時，各組之間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；培養后第 3、5 天時，普通培養組與 PGA 支架培養組間比較差異無統計學意義（P>0.05），微重力培養組的細胞存活率明顯高于普通培養組（P<0.05）和 PGA 支架培養組（P<0.05）；培養后第 7 天時，PGA 支架培養組和微重力培養組的細胞存活率均明顯高于普通培養組（P<0.05），且微重力培養組的細胞存活率明顯高于 PGA 支架培養組（P<0.05）。
表2
培養不同時相后各組細胞存活率比較（%，
）
圖4
不同培養環境下培養至第 5 天時的細胞形態觀察結果（熒光顯微鏡 ×200） a：普通培養組，細胞存活率為 80.4%；b：微重力培養組，細胞存活率為 89.1%
3 討論
甲狀旁腺移植是甲狀旁腺功能減退患者獲得生理性血鈣水平的理想途徑[2]。 隨著細胞、生物材料、移植免疫等技術的進步，甲狀旁腺移植的方法和療效都取得了較大的進展[3-4]。但如何找到充足的移植來源、降低移植物的免疫原性以及延長移植后移植組織的存活時間，一直是困擾外科醫生的核心問題[5]。目前，甲狀旁腺細胞的培養依然局限于二維平面培養的方式，本研究在 RCCS 提供的模擬微重力環境下三維培養甲狀旁腺細胞，而微重力組織工程的核心技術是建立動物細胞的三維培養體系[6]。
模擬微重力環境對動物細胞的體外培養有如下優點[7-12]：① 培養液對細胞的機械剪切力小。② 正常的重力向量被持續隨機化，可能直接或間接地促進細胞的自分泌以及旁分泌，也可能對細胞基因表達產生影響，更加有利于細胞與細胞之間信號的轉導。③ 細胞生長在三維空間中，不易形成中心壞死，對維持細胞正常功能具有重要作用。④ 具有高保真度的優點。⑤ 在微重力培養條件下，細胞、支架和培養液在類似自由落體的狀態下運動，細胞和支架載體形成一種持續動態的接種，懸浮著的細胞可以不斷有機會與支架接觸而黏附，從而使細胞在載體表面及載體內部產生較均勻的分布。而靜置培養時，由于培養容器中的培養液無法動態混合，支架內部代謝廢物不易排出，容易在局部蓄積，使局部環境的 pH 值發生變化，另外，營養物質和氧氣也難以輸送給中心部位的細胞，因此，中心部位細胞極易發生生長停滯或死亡。
本研究結果發現，普通培養組的細胞在培養第 3 天時已經開始延展，第 5 天時幾乎所有細胞都已伸展，呈現多角形或星形；PGA支架培養組細胞于培養第 5 天時開始沿支架向兩極延伸，呈現短梭形或多角形，第 7 天時，支架上細胞大部分沿 PGA 纖維縱軸方向向兩極伸展；而微重力培養組的細胞在培養第 7 天時細胞仍呈圓形，聚集成團，并逐漸增大。細胞相互聚集成團，有利于細胞與細胞之間的信號傳遞，更加有利于細胞外基質在細胞周圍的固守，而細胞外基質能對細胞的增殖分化、生長代謝發揮巨大的調節作用，從而為細胞的生長代謝及功能發揮創造更加適宜的微環境[13]。細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質之間的聯系調控細胞骨架蛋白基因的表達，從而使細胞呈現不同的形態，而細胞的形態與細胞功能密切相關[14]。
本研究中，在細胞培養的第 1、3、5、7 天時，取適量細胞進行吖啶橙和碘化丙啶染色，檢測細胞存活情況，結果顯示，除第 1 天外，微重力培養組細胞存活率均明顯高于 PGA 支架培養組（P<0.05）和普通培養組（P<0.05），且PTH值也均明顯高于PGA支架培養組和普通培養組（P<0.05）。PGA 支架培養組細胞培養液中 PTH 濃度均明顯高于普通培養組。我們認為，可能由于普通培養組是二維培養，營養物質的吸收及代謝廢物的排出受到了限制，加速了甲狀旁腺細胞的死亡；而 PGA 支架培養組的細胞由于有了 PGA 支架的支持和維護，使細胞成三維立體生長，而三維培養更加有利于營養成分的吸收和氣體的交換以及代謝廢物的排出，所以與普通培養組相比，支架組甲狀旁腺細胞的活性較強，細胞存活率高于普通培養組。同時我們還發現，各培養組細胞分泌峰值均是在培養后的第 5 天，第 7 天開始下降，由此推測培養 5 d 的甲狀旁腺細胞分泌功能最強，狀態最佳，可作為移植的最佳供體[15]。考慮原因可能為：①細胞培養前幾日測出的 PTH 可能主要為細胞已合成儲存在細胞體內的 PTH；②體外培養的甲狀旁腺細胞由于缺乏 PTH 合成的原料及相關細胞因子，其合成 PTH 的能力處于較低的水平；③體外培養的甲狀旁腺細胞的增殖及分化功能較分泌功能顯著。
本實驗結果提示，甲狀旁腺細胞和 PGA 支架共培養，細胞能在 PGA 支架上黏附生長并形成三維立體的生長方式，細胞形態良好，PGA 支架上的細胞存活率高，分泌 PTH 功能較好，PGA 支架可以作為甲狀旁腺細胞培養的良好載體。
