引用本文： 李薛鑫, 劉健, 張德巍. 不同類型液體復蘇對創傷失血性休克大鼠復蘇后血清中 IL-8 與 TNF-α 的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(2): 174-178. doi: 10.7507/1007-9424.201606020 復制
創傷是導致人類死亡的重要因素，我國每年死于創傷的人數達 70 余萬人，其中創傷失血性休克為首位致死因素[1]。有效的液體復蘇是救治創傷失血性休克的關鍵。有研究[2-3]認為，創傷與免疫功能密切相關。因此，研究不同類型的復蘇液在創傷失血性休克液體復蘇過程中對免疫功能的影響對于創傷失血性休克的救治有著重大的意義。以往對于此問題的研究多偏向于對單一免疫指標的測定，且鮮有關注復蘇時間的改變與不同復蘇液的應用對于創傷失血性休克液體復蘇中免疫功能的共同影響。本研究擬通過復制大鼠創傷失血性休克模型，觀察不同類型復蘇液在使用過程中不同時相創傷失血性休克大鼠血清中白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量情況，以探究不同復蘇方式及不同種類的復蘇液對創傷失血性休克大鼠液體復蘇后免疫功能的影響，并希望本研究結果對臨床工作能提供一定的參考價值。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
健康雄性SD大鼠 64 只，體質量 400～550 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。在實驗溫度（24±3）℃、濕度 50%～65% 條件下飼養 1 周，動物符合 SPF 級，實驗前 12 h 禁食不禁水。實驗動物采用摸球法隨機分為 4 組，乳酸鈉林格液限制性復蘇組（晶體限制性復蘇組）、羥乙基淀粉（盈源）限制性復蘇組（膠體限制性復蘇組）、濃氯化鈉（7.5% 氯化鈉液）限制性復蘇組（濃氯化鈉限制性復蘇組）及羥乙基淀粉（盈源）非限制性復蘇組（膠體非限制性復蘇組），每組 16 只大鼠。
1.2 創傷失血性休克大鼠模型的制備
所有大鼠經 1% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后置于 37% 恒溫操作臺，行左側頸動脈置管術、右側股動脈置管術，測量此時大鼠的血壓。采取股骨創傷法：實驗大鼠血壓穩定 10 min 后，以 2 kg 鐵輪自 30 cm 高固定滑道中落下，分別撞擊麻醉后大鼠雙側下肢，同時監測平均動脈壓降至 40 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）左右，加壓包扎創面，減少其進一步出血。若平均動脈壓不能達到 40 mm Hg，或持續高于該標準，即采用少量輸液或頸動脈放血方法維持創傷失血性休克狀態，此狀態維持 1 h后開始復蘇。
1.3 液體復蘇步驟與方法
創傷失血性休克大鼠模型建立后 1 h 開始復蘇，復蘇標準為平均動脈壓維持在 80～90 mm Hg。晶體限制性復蘇組給予乳酸鈉林格液 20 mL，膠體限制性復蘇組給予羥乙基淀粉 20 mL，濃氯化鈉限制性復蘇組給予 7.5% 氯化鈉溶液 2 mL（6 mL/kg），膠體非限制性復蘇組給予羥乙基淀粉 40 mL。此過程中控制輸液速度以 3 mL/min 為宜，嚴密觀察大鼠生理狀況，防止大鼠死亡。
1.4 標本的制備與采集
麻醉復蘇后，將大鼠放回鼠籠，自由飲食。分別于復蘇后第 2、6、12 及 24 h 時取各組實驗大鼠（每個時相 4 只大鼠）腹主動脈血 5 mL 置于–20 ℃冰箱中備用，剖殺實驗動物，終止實驗。
1.5 檢測各組大鼠腹主動脈血中 IL-8 及 TNF-α 的含量
采用固相夾心酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測各組大鼠腹主動脈血中 IL-8 及 TNF-α 的含量。以 IL-8 及 TNF-α 試劑盒標準稀釋液按 1∶2 稀釋標準品，繪制標準曲線。取標本腹主動脈血上清，做雙孔檢測，同時每組檢測設置空白與標準各兩孔。于 450 nm 處讀取樣品吸光度值，每孔測定 2 次，取均值，根據樣品值通過標準曲線確定樣品中 IL-8 及 TNF-α 含量。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。數據以均數±標準差（ ±s）表示，每組分組因素的單獨效應分析采用完全隨機設計資料的方差分析，多重比較采用q 檢驗法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
復蘇后第 6 h 時，各限制性復蘇組血清中IL-8及TNF-α 含量較復蘇后第 2 h 時的相應指標均明顯升高（P＜0.05），且均達最高峰，然后均開始下降；至復蘇后第 12 h 時，各限制性復蘇組 IL-8 及 TNF-α 含量繼續呈下降趨勢（P＜0.05）。非限制性復蘇組不具有此變化趨勢，本研究對此不做討論。見表 1、2。
表1
限制性復蘇與非限制性復蘇各組中大鼠在復蘇后不同時相時的血清中 IL-8 含量的比較（ng/L，
）
表2
限制性復蘇與非限制性復蘇各組中大鼠在復蘇后不同時相時的血清中 TNF-α 含量的比較（ng/L，
）
非限制性復蘇組各時相點血清中 IL-8 及 TNF-α 含量均明顯高于各限制性復蘇組相應時相點對應的指標（P<0.05）；同時，晶體限制性復蘇組各時相點血清中 IL-8 及 TNF-α 含量又均明顯低于膠體及濃氯化鈉兩種復蘇液限制性復蘇組各時相點對應的指標（P<0.05）。見表 1、2。
3 討論
高能量創傷對機體組織的急性損傷會引發一系列的病理綜合征，同時也可導致機體免疫系統紊亂，誘發各種炎癥因子的釋放[4-5]。有研究[6]表明，人體內含有各種炎癥因子，包括促炎因子及抗炎因子，它們處于一種動態的平衡之中。發生創傷失血性休克時，機體產生的炎癥反應是一個復雜的病理過程，病理檢查可發現有大量炎癥細胞的局部浸潤和組織壞死，在這一過程中，一些細胞因子如 IL-8、TNF-α 等可促進炎癥細胞的聚集、活化和炎癥介質的釋放，可直接刺激發熱中樞引起全身發熱，加重炎癥癥狀，因此，對 IL-8 及 TNF-α 釋放的監測對創傷失血性休克患者的救治及預后起著至關重要的作用[7-8]。
對于創傷失血性休克患者，臨床上傳統的救治理念是早期快速足量輸注復蘇液，恢復重要器官的血流灌注，防止休克的進一步發展，但這一理念目前正在逐步被限制性液體復蘇所取代[9-10]。有文獻[11]報道，創傷失血性休克患者早期未經液體復蘇時，血漿內促炎因子的大量釋放會導致機體免疫系統的損傷，甚至誘導多器官功能障礙綜合征及全身炎癥反應綜合征的發生。然而早期非限制性復蘇液輸入則會導致血漿內抗炎因子的大量釋放并使得機體處于一種免疫麻痹狀態，并引起代償性抗炎反應綜合征，反而使得機體的炎癥反應進一步加重[12]。其原因可能是，早期足量液體的輸注，使得創傷失血性休克大鼠體內的促炎因子及抗炎因子的動態平衡被打破，加重了機體免疫系統的負擔，從而使機體的免疫系統不能有效地發揮其正常的免疫功能。本研究結果發現，限制性液體復蘇對于創傷失血性休克大鼠體內 IL-8 及 TNF-α 的控制要遠遠優于非限制性復蘇組，且在晶體、膠體及濃氯化鈉3種限制性液體復蘇組中，實驗大鼠血清中IL-8及TNF-α 含量的變化均呈現出一種先升高再降低的趨勢，分析其原因為限制性液體復蘇對于實驗大鼠體內促炎因子及抗炎因子動態平衡的維持會使得大鼠體內血細胞因子的變化呈現先升高再降低趨勢，這也是其有效抑制血液中 IL-8 及 TNF-α 釋放的重要原因。有資料[13-14]顯示，在組織損傷初期，TNF-α 作為一種單核巨噬細胞產生的細胞毒性蛋白會迅速升高，而 IL-8 又稱中性粒細胞激活蛋白質，它的產生主要得益于 TNF-α 在炎癥初期的誘導，這種趨勢的出現可能是因為 TNF-α 作為整個炎癥級聯反應的始發因子，會刺激 IL-8 等一系列炎癥因子的釋放，擴大其生物學效應。因此，在創傷失血性休克初期，體內促炎因子大量釋放，抗炎因子與促炎因子的動態平衡被打破，而復蘇液的限制性輸注，則會迅速促使機體的促炎因子及抗炎因子的動態平衡得以恢復，同時降低了體內炎癥因子的含量。
在本研究的晶體、膠體及濃氯化鈉 3 種限制性液體復蘇組中，晶體液限制性復蘇組相比其他兩種復蘇液能更明顯抑制大鼠體內血清中 IL-8 和 TNF-α 因子的釋放，其原因可能是，在創傷失血性休克早期，晶體液對于補充丟失的細胞外液是非常適當而有效的[15-16]。早期晶體液限制性的攝入，能迅速建立循環，減少再灌注時氧自由基等活性氧成分的產生，從而改善免疫反應；同時適量的晶體液輸入還可以降低毛細血管通透性，更有利于血漿容量的維持和氧合的改善，減少白細胞滲出，抑制白細胞的黏附，有效地阻止創傷組織的缺血再灌注損傷，對創傷失血性休克大鼠機體恢復到正常狀態起到十分重要的作用[17-19]。臨床研究[20-21]顯示，對于創傷失血性休克的患者早期限制性輸注林格液，能有效糾正脫水和低鈉血癥，擴充細胞外液的數量，同時也具有良好的腎功能保護作用，這也可能是使得細胞因子受到有效抑制的原因。本研究結果中，濃氯化鈉限制性復蘇組和膠體限制性復蘇組也可以在一定程度上減少 IL-8 和 TNF-α 因子的釋放。這可能是因為 7.5% 氯化鈉可產生 2 400 mmol/L 的滲透壓，相當于正常血漿滲透壓的 8 倍，通過提高血清鈉和血清滲透壓，產生的滲透壓梯度可以將細胞內和組織間隙的水分迅速向血管內轉移，從而減輕組織水腫[22-24]。而膠體液則可以通過下調轉錄因子核因子 κB 和轉錄激活因子 1 的水平來減少休克狀態下炎癥反應和氧化應激的發生[25-26]。然而與晶體液相比，它們并不具有與細胞外液近似的電解質成分及滲透壓，這可能是本研究中晶體液限制性復蘇組相比其他兩種復蘇液能更明顯抑制大鼠體內血清中 IL-8 和 TNF-α 因子釋放的原因。
對于創傷失血性休克患者的救治，采取何種類型的液體復蘇一直以來廣受爭議。本研究結果顯示，限制性液體復蘇對于創傷失血性休克狀態的改善要明顯優于非限制性液體復蘇；同時，在限制性復蘇方式中，采用晶體復蘇液比采用濃氯化鈉和羥乙基淀粉兩種復蘇液更能有效抑制大鼠體內 IL-8 和 TNF-α 的釋放。結果提示，限制性晶體復蘇液的使用對于創傷失血性休克的治療及預后可能具有相對良好的效果。
創傷是導致人類死亡的重要因素，我國每年死于創傷的人數達 70 余萬人，其中創傷失血性休克為首位致死因素[1]。有效的液體復蘇是救治創傷失血性休克的關鍵。有研究[2-3]認為，創傷與免疫功能密切相關。因此，研究不同類型的復蘇液在創傷失血性休克液體復蘇過程中對免疫功能的影響對于創傷失血性休克的救治有著重大的意義。以往對于此問題的研究多偏向于對單一免疫指標的測定，且鮮有關注復蘇時間的改變與不同復蘇液的應用對于創傷失血性休克液體復蘇中免疫功能的共同影響。本研究擬通過復制大鼠創傷失血性休克模型，觀察不同類型復蘇液在使用過程中不同時相創傷失血性休克大鼠血清中白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量情況，以探究不同復蘇方式及不同種類的復蘇液對創傷失血性休克大鼠液體復蘇后免疫功能的影響，并希望本研究結果對臨床工作能提供一定的參考價值。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
健康雄性SD大鼠 64 只，體質量 400～550 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。在實驗溫度（24±3）℃、濕度 50%～65% 條件下飼養 1 周，動物符合 SPF 級，實驗前 12 h 禁食不禁水。實驗動物采用摸球法隨機分為 4 組，乳酸鈉林格液限制性復蘇組（晶體限制性復蘇組）、羥乙基淀粉（盈源）限制性復蘇組（膠體限制性復蘇組）、濃氯化鈉（7.5% 氯化鈉液）限制性復蘇組（濃氯化鈉限制性復蘇組）及羥乙基淀粉（盈源）非限制性復蘇組（膠體非限制性復蘇組），每組 16 只大鼠。
1.2 創傷失血性休克大鼠模型的制備
所有大鼠經 1% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后置于 37% 恒溫操作臺，行左側頸動脈置管術、右側股動脈置管術，測量此時大鼠的血壓。采取股骨創傷法：實驗大鼠血壓穩定 10 min 后，以 2 kg 鐵輪自 30 cm 高固定滑道中落下，分別撞擊麻醉后大鼠雙側下肢，同時監測平均動脈壓降至 40 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）左右，加壓包扎創面，減少其進一步出血。若平均動脈壓不能達到 40 mm Hg，或持續高于該標準，即采用少量輸液或頸動脈放血方法維持創傷失血性休克狀態，此狀態維持 1 h后開始復蘇。
1.3 液體復蘇步驟與方法
創傷失血性休克大鼠模型建立后 1 h 開始復蘇，復蘇標準為平均動脈壓維持在 80～90 mm Hg。晶體限制性復蘇組給予乳酸鈉林格液 20 mL，膠體限制性復蘇組給予羥乙基淀粉 20 mL，濃氯化鈉限制性復蘇組給予 7.5% 氯化鈉溶液 2 mL（6 mL/kg），膠體非限制性復蘇組給予羥乙基淀粉 40 mL。此過程中控制輸液速度以 3 mL/min 為宜，嚴密觀察大鼠生理狀況，防止大鼠死亡。
1.4 標本的制備與采集
麻醉復蘇后，將大鼠放回鼠籠，自由飲食。分別于復蘇后第 2、6、12 及 24 h 時取各組實驗大鼠（每個時相 4 只大鼠）腹主動脈血 5 mL 置于–20 ℃冰箱中備用，剖殺實驗動物，終止實驗。
1.5 檢測各組大鼠腹主動脈血中 IL-8 及 TNF-α 的含量
采用固相夾心酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測各組大鼠腹主動脈血中 IL-8 及 TNF-α 的含量。以 IL-8 及 TNF-α 試劑盒標準稀釋液按 1∶2 稀釋標準品，繪制標準曲線。取標本腹主動脈血上清，做雙孔檢測，同時每組檢測設置空白與標準各兩孔。于 450 nm 處讀取樣品吸光度值，每孔測定 2 次，取均值，根據樣品值通過標準曲線確定樣品中 IL-8 及 TNF-α 含量。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。數據以均數±標準差（ ±s）表示，每組分組因素的單獨效應分析采用完全隨機設計資料的方差分析，多重比較采用q 檢驗法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
復蘇后第 6 h 時，各限制性復蘇組血清中IL-8及TNF-α 含量較復蘇后第 2 h 時的相應指標均明顯升高（P＜0.05），且均達最高峰，然后均開始下降；至復蘇后第 12 h 時，各限制性復蘇組 IL-8 及 TNF-α 含量繼續呈下降趨勢（P＜0.05）。非限制性復蘇組不具有此變化趨勢，本研究對此不做討論。見表 1、2。
表1
限制性復蘇與非限制性復蘇各組中大鼠在復蘇后不同時相時的血清中 IL-8 含量的比較（ng/L，
）
表2
限制性復蘇與非限制性復蘇各組中大鼠在復蘇后不同時相時的血清中 TNF-α 含量的比較（ng/L，
）
非限制性復蘇組各時相點血清中 IL-8 及 TNF-α 含量均明顯高于各限制性復蘇組相應時相點對應的指標（P<0.05）；同時，晶體限制性復蘇組各時相點血清中 IL-8 及 TNF-α 含量又均明顯低于膠體及濃氯化鈉兩種復蘇液限制性復蘇組各時相點對應的指標（P<0.05）。見表 1、2。
3 討論
高能量創傷對機體組織的急性損傷會引發一系列的病理綜合征，同時也可導致機體免疫系統紊亂，誘發各種炎癥因子的釋放[4-5]。有研究[6]表明，人體內含有各種炎癥因子，包括促炎因子及抗炎因子，它們處于一種動態的平衡之中。發生創傷失血性休克時，機體產生的炎癥反應是一個復雜的病理過程，病理檢查可發現有大量炎癥細胞的局部浸潤和組織壞死，在這一過程中，一些細胞因子如 IL-8、TNF-α 等可促進炎癥細胞的聚集、活化和炎癥介質的釋放，可直接刺激發熱中樞引起全身發熱，加重炎癥癥狀，因此，對 IL-8 及 TNF-α 釋放的監測對創傷失血性休克患者的救治及預后起著至關重要的作用[7-8]。
對于創傷失血性休克患者，臨床上傳統的救治理念是早期快速足量輸注復蘇液，恢復重要器官的血流灌注，防止休克的進一步發展，但這一理念目前正在逐步被限制性液體復蘇所取代[9-10]。有文獻[11]報道，創傷失血性休克患者早期未經液體復蘇時，血漿內促炎因子的大量釋放會導致機體免疫系統的損傷，甚至誘導多器官功能障礙綜合征及全身炎癥反應綜合征的發生。然而早期非限制性復蘇液輸入則會導致血漿內抗炎因子的大量釋放并使得機體處于一種免疫麻痹狀態，并引起代償性抗炎反應綜合征，反而使得機體的炎癥反應進一步加重[12]。其原因可能是，早期足量液體的輸注，使得創傷失血性休克大鼠體內的促炎因子及抗炎因子的動態平衡被打破，加重了機體免疫系統的負擔，從而使機體的免疫系統不能有效地發揮其正常的免疫功能。本研究結果發現，限制性液體復蘇對于創傷失血性休克大鼠體內 IL-8 及 TNF-α 的控制要遠遠優于非限制性復蘇組，且在晶體、膠體及濃氯化鈉3種限制性液體復蘇組中，實驗大鼠血清中IL-8及TNF-α 含量的變化均呈現出一種先升高再降低的趨勢，分析其原因為限制性液體復蘇對于實驗大鼠體內促炎因子及抗炎因子動態平衡的維持會使得大鼠體內血細胞因子的變化呈現先升高再降低趨勢，這也是其有效抑制血液中 IL-8 及 TNF-α 釋放的重要原因。有資料[13-14]顯示，在組織損傷初期，TNF-α 作為一種單核巨噬細胞產生的細胞毒性蛋白會迅速升高，而 IL-8 又稱中性粒細胞激活蛋白質，它的產生主要得益于 TNF-α 在炎癥初期的誘導，這種趨勢的出現可能是因為 TNF-α 作為整個炎癥級聯反應的始發因子，會刺激 IL-8 等一系列炎癥因子的釋放，擴大其生物學效應。因此，在創傷失血性休克初期，體內促炎因子大量釋放，抗炎因子與促炎因子的動態平衡被打破，而復蘇液的限制性輸注，則會迅速促使機體的促炎因子及抗炎因子的動態平衡得以恢復，同時降低了體內炎癥因子的含量。
在本研究的晶體、膠體及濃氯化鈉 3 種限制性液體復蘇組中，晶體液限制性復蘇組相比其他兩種復蘇液能更明顯抑制大鼠體內血清中 IL-8 和 TNF-α 因子的釋放，其原因可能是，在創傷失血性休克早期，晶體液對于補充丟失的細胞外液是非常適當而有效的[15-16]。早期晶體液限制性的攝入，能迅速建立循環，減少再灌注時氧自由基等活性氧成分的產生，從而改善免疫反應；同時適量的晶體液輸入還可以降低毛細血管通透性，更有利于血漿容量的維持和氧合的改善，減少白細胞滲出，抑制白細胞的黏附，有效地阻止創傷組織的缺血再灌注損傷，對創傷失血性休克大鼠機體恢復到正常狀態起到十分重要的作用[17-19]。臨床研究[20-21]顯示，對于創傷失血性休克的患者早期限制性輸注林格液，能有效糾正脫水和低鈉血癥，擴充細胞外液的數量，同時也具有良好的腎功能保護作用，這也可能是使得細胞因子受到有效抑制的原因。本研究結果中，濃氯化鈉限制性復蘇組和膠體限制性復蘇組也可以在一定程度上減少 IL-8 和 TNF-α 因子的釋放。這可能是因為 7.5% 氯化鈉可產生 2 400 mmol/L 的滲透壓，相當于正常血漿滲透壓的 8 倍，通過提高血清鈉和血清滲透壓，產生的滲透壓梯度可以將細胞內和組織間隙的水分迅速向血管內轉移，從而減輕組織水腫[22-24]。而膠體液則可以通過下調轉錄因子核因子 κB 和轉錄激活因子 1 的水平來減少休克狀態下炎癥反應和氧化應激的發生[25-26]。然而與晶體液相比，它們并不具有與細胞外液近似的電解質成分及滲透壓，這可能是本研究中晶體液限制性復蘇組相比其他兩種復蘇液能更明顯抑制大鼠體內血清中 IL-8 和 TNF-α 因子釋放的原因。
對于創傷失血性休克患者的救治，采取何種類型的液體復蘇一直以來廣受爭議。本研究結果顯示，限制性液體復蘇對于創傷失血性休克狀態的改善要明顯優于非限制性液體復蘇；同時，在限制性復蘇方式中，采用晶體復蘇液比采用濃氯化鈉和羥乙基淀粉兩種復蘇液更能有效抑制大鼠體內 IL-8 和 TNF-α 的釋放。結果提示，限制性晶體復蘇液的使用對于創傷失血性休克的治療及預后可能具有相對良好的效果。
