引用本文： 何中林, 成正軍. PKM2 在肝細胞肝癌中的表達及其與預后的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(2): 248-251. doi: 10.7507/1007-9424.201606005 復制
Warburg 效應是腫瘤細胞的重要特征，即在氧氣充足的環境下，腫瘤細胞依然采用糖酵解進行能量代謝[1]。M2 型丙酮酸激酶（PKM2）是糖酵解的關鍵酶，在胚胎細胞和多種腫瘤細胞中高表達，在正常細胞中低表達或不表達，對腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移均有重要作用[2]。PKM2 表達與多種實體瘤的發生和預后均有密切關系，但其在肝細胞癌（以下簡稱“肝癌”）中的報道較少。本研究旨在研究 PKM2 蛋白在肝癌組織中的表達以及其與肝癌預后的關系。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集 2008 年 1 月至 2011 年 1 月期間重慶市第九人民醫院和重慶市九龍坡第二人民醫院病理科存檔的 225 例肝癌標本，其中 29 例不符合要求而被排除（17 例病理診斷為肝內膽管細胞癌，7 例失訪，5 例為再次手術鴐，最終納入術后病理明確診斷為肝癌患者 196 例。其中男 132 例，女 64 例；年齡 18～81 歲，平均年齡 58.6 歲，≤50歲者36例，>50歲者 160 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ 期 110 例，Ⅲ+Ⅳ 期 86例；分化程度：中-高分化 148 例，低分化 48 例；腫瘤數目：單結節腫瘤 102 例，多結節腫瘤 94 例；腫瘤最大直徑：≤5 cm 者77例，>5 cm 者 119 例；肝硬化：無肝硬化 43 例，有肝硬化 153 例；甲胎蛋白（AFP）水平：≥400 μg/L 者 138 例，<400 μg/L 者 58 例；乙肝表面抗原：陽性 174 例，陰性 22 例。本研究中納入患者均為首次手術者并獲得知情同意且簽署知情同意書，并且經重慶市第九人民醫院和重慶市九龍坡第二人民醫院倫理委員會審核批準。病理診斷結果經兩名以上病理醫師確認。
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學方法 ①主要試劑：PKM2 抗體購自 Abcam 公司（貨號：ab38237鴐，SP 免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司（貨號：SP9001鴐。②主要步驟：60 ℃ 烤片，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3% H2O2 37 ℃ 孵育阻斷滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液煮沸進行抗原修復，正常羊血清工作液封閉，滴加一抗（1∶100 稀釋）4 ℃ 冰箱孵育過夜，滴加生物素標記二抗，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，DAB 染色，自來水充分沖洗后，蘇木精復染，常規脫水，透明，干燥，封片。采用 PBS 代替一抗作為陰性對照，采用人子宮組織切片（ab4378）作為陽性對照。
1.2.2 結果判斷 每例切片隨機選取 5 個高倍鏡視野進行結果判定，由兩位經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法觀察，免疫組織化學染色結果評分：①染色深度：無染色為 0 分，淡黃色為 1 分，黃或深黃色為 2 分，褐或棕褐色為 3 分；②陽性細胞數：陽性細胞數≤5% 計 0 分，6%～25% 計 1 分，26%～50% 計 2 分，51%～75% 計 3 分，>75%計 4 分。將兩者得分相加，<4 分為 PKM2 蛋白低表達，≥4 分為 PKM2 蛋白高表達。
1.3 隨訪
所有患者均通過電話或門診復查的方式進行隨訪，直至患者死亡或隨訪滿 5 年患者，均具有完整隨訪資料，隨訪時間為 1～60 個月，中位隨訪時間為 25 個月。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計學軟件對數據進行分析，計數資料采用卡方檢驗，生存分析采用 Kaplan-Meier法，采用單因素及多因素 Cox 回歸分析進行危險因素分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 PKM2 蛋白在肝癌組織中的表達及其與肝癌患者的臨床病理特征的關系
PKM2 蛋白表達陽性染色主要定位于細胞漿，見圖 1。有 129 例（65.8%）肝癌患者的肝癌組織中 PKM2 蛋白高表達，有 67 例（34.2%）肝癌患者的肝癌組織中 PKM2 蛋白低表達。肝癌組織中 PKM2蛋白表達與肝癌患者的性別（P=0.049鴐、腫瘤分化程度（P=0.000鴐、血清 AFP 水平（P=0.010鴐、腫瘤數目（P=0.002）及 TNM 分期（P=0.001）有關，而與患者的年齡、有無肝硬化、腫瘤最大直徑及乙肝表面抗原無關（P>0.05鴐。見表 1。
圖1
PKM2 蛋白在肝癌組織中的表達(SP ×400) a：陰性表達； b：陽性表達
表1
PKM2 蛋白表達與肝癌患者的臨床病理特征的關系
2.2 PKM2蛋白在肝癌組織中的表達與肝癌患者預后的關系
1、3、5 年總體生存率在 PKM2 蛋白高表達患者中分別為 63.3%、32.6%、24.0%，明顯低于其在 PKM2 低表達患者中的 85.1%、61.2%、52.2%，差異有統計學意義（P<0.05）；1、3、5 年無瘤生存率在 PKM2 高表達患者中分別為 52.7%、23.3%、14.7%，明顯低于其在 PKM2 低表達患者中的 80.6%、52.2%、38.8%，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
PKM2 蛋白在肝癌組織中的表達與肝癌患者預后關系的生存曲線圖 a：總體生存率； b：無瘤生存率
2.3 影響肝癌患者預后因素的分析結果
①單因素分析結果顯示，肝癌患者的總體生存率與腫瘤的分化程度、腫瘤最大直徑、腫瘤數目、 TNM 分期、乙肝表面抗原及 PKM2 蛋白表達有關（P<0.05鴐；肝癌患者的無瘤生存率與腫瘤的分化程度、腫瘤最大直徑、TNM 分期、乙肝表面抗原及 PKM2 蛋白表達有關（P<0.05鴐。②多因素 Cox 回歸分析結果顯示，腫瘤的分化程度、TNM 分期及乙肝表面抗原與肝癌患者的總體生存率及無瘤生存率均有關（P<0.05鴐。③多因素 Cox 回歸分析均顯示 PKM2 蛋白表達是肝癌患者總體生存率（HR=1.661，P=0.024）及無瘤生存率（HR=1.662，P=0.013）的獨立危險因素。見表 2、3。
表2
影響肝癌患者術后總體生存率的單因素及多因素 Cox 回歸分析結果
表3
影響肝癌患者術后無瘤生存率的單因素及多因素 Cox 回歸分析結果
3 討論
早在 1930 年，德國生物化學家 Otto Warburg 發現癌細胞采用一種特殊的方式產生能量，即使在氧氣充足的條件，大多數腫瘤細胞通過產能率相對較低的糖酵解作用為自身供能[3]。PKM2 為腫瘤細胞維持這種代謝方式的關鍵酶，同時又可作為蛋白激酶、轉錄因子等調控腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，是腫瘤代謝和細胞功能的重要紐帶[4-6]。已有研究發現，PKM2與多種腫瘤的分化和預后密切相關。Zhang 等[7]對 86 例食管鱗狀細胞癌進行免疫組織化學染色后發現，PKM2 在腫瘤的細胞漿和細胞核中均有表達，且明顯高于其癌旁組織，細胞核中 PKM2 的表達與食管鱗狀細胞癌生存時間呈明顯的負相關；Zhan 等[8]的研究再次明確了 PKM2 與食管鱗狀細胞癌的分化及預后的密切關系；后來相繼有研究發現，PKM2 的表達與子宮內膜癌[9]、胃癌[10]等的預后均有關。
眾多的基礎研究發現，PKM2 可通過多種細胞分子機制參與肝癌的增殖、侵襲及轉移。2011 年日本的 Kitamura 等[11]的研究發現，PKM2可改變肝癌的糖代謝狀態，與肝癌的增殖能力有重要關系。PKM2 還可通過上調缺氧誘導因子-1α 和 Bcl-xL 的表達，從而促進肝癌細胞增殖[12]。PKM2 還可調節上皮間質化從而促進肝癌細胞的侵襲[4]。Liu等[13]發現，PKM2 可募集骨髓來源的抑制性細胞從而促進肝癌的轉移。但 PKM2 的表達與肝癌患者的臨床病理特征和預后的關系較少有報道。
本研究對 PKM2 的表達與肝癌患者的臨床病理特征和預后的關系進行了研究，結果顯示，肝癌組織中 PKM2 蛋白高表達率為 65.8%，陽性染色主要定位于細胞漿。肝癌組織中 PKM2 蛋白表達與肝癌患者的性別、腫瘤分化程度、血清 AFP 水平、腫瘤數目及 TNM 分期有關（P<0.05）；無論是總體生存率還是無瘤生存率，在 PKM2 蛋白高表達的患者中均低于其低表達的患者，且 PKM2 蛋白高表達是肝癌預后的獨立危險因素（P<0.05）。中山大學[14]和復旦大學[15]也從臨床的角度對 PKM2 表達與肝癌的關系進行了相關報道，均認為 PKM2 可單獨或聯合 TRIM35 作為判斷肝癌預后的指標，本研究結果與之基本相符。但本研究中，PKM2 蛋白表達陽性率為 65.8%，高于中山大學和復旦大學（52.2%、32.6%）[14-15]，這種差異可能與患者的基線水平有關，在本研究中單結節腫瘤和Ⅰ～Ⅱ期的患者所占比例為 52.0%、56.1%，明顯低于中山大學的 59.8%、51.8%[14]和復旦大學的 82.2%、79.2%[15]。
本研究的數據來自西南地區的基層醫療機構，可與國內大的醫學中心發表的數據形成互補，通過不同人群、地域、不同肝癌基礎特征的臨床數據進一步驗證了 PKM2 蛋白表達與肝癌預后的關系，PKM2 對肝癌細胞的生物學行為有重要影響，可作為判斷肝癌預后的一個新的指標，但仍需要大樣本的臨床研究，進行更加深入的分子機制探索。
Warburg 效應是腫瘤細胞的重要特征，即在氧氣充足的環境下，腫瘤細胞依然采用糖酵解進行能量代謝[1]。M2 型丙酮酸激酶（PKM2）是糖酵解的關鍵酶，在胚胎細胞和多種腫瘤細胞中高表達，在正常細胞中低表達或不表達，對腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移均有重要作用[2]。PKM2 表達與多種實體瘤的發生和預后均有密切關系，但其在肝細胞癌（以下簡稱“肝癌”）中的報道較少。本研究旨在研究 PKM2 蛋白在肝癌組織中的表達以及其與肝癌預后的關系。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集 2008 年 1 月至 2011 年 1 月期間重慶市第九人民醫院和重慶市九龍坡第二人民醫院病理科存檔的 225 例肝癌標本，其中 29 例不符合要求而被排除（17 例病理診斷為肝內膽管細胞癌，7 例失訪，5 例為再次手術鴐，最終納入術后病理明確診斷為肝癌患者 196 例。其中男 132 例，女 64 例；年齡 18～81 歲，平均年齡 58.6 歲，≤50歲者36例，>50歲者 160 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ 期 110 例，Ⅲ+Ⅳ 期 86例；分化程度：中-高分化 148 例，低分化 48 例；腫瘤數目：單結節腫瘤 102 例，多結節腫瘤 94 例；腫瘤最大直徑：≤5 cm 者77例，>5 cm 者 119 例；肝硬化：無肝硬化 43 例，有肝硬化 153 例；甲胎蛋白（AFP）水平：≥400 μg/L 者 138 例，<400 μg/L 者 58 例；乙肝表面抗原：陽性 174 例，陰性 22 例。本研究中納入患者均為首次手術者并獲得知情同意且簽署知情同意書，并且經重慶市第九人民醫院和重慶市九龍坡第二人民醫院倫理委員會審核批準。病理診斷結果經兩名以上病理醫師確認。
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學方法 ①主要試劑：PKM2 抗體購自 Abcam 公司（貨號：ab38237鴐，SP 免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司（貨號：SP9001鴐。②主要步驟：60 ℃ 烤片，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3% H2O2 37 ℃ 孵育阻斷滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液煮沸進行抗原修復，正常羊血清工作液封閉，滴加一抗（1∶100 稀釋）4 ℃ 冰箱孵育過夜，滴加生物素標記二抗，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，DAB 染色，自來水充分沖洗后，蘇木精復染，常規脫水，透明，干燥，封片。采用 PBS 代替一抗作為陰性對照，采用人子宮組織切片（ab4378）作為陽性對照。
1.2.2 結果判斷 每例切片隨機選取 5 個高倍鏡視野進行結果判定，由兩位經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法觀察，免疫組織化學染色結果評分：①染色深度：無染色為 0 分，淡黃色為 1 分，黃或深黃色為 2 分，褐或棕褐色為 3 分；②陽性細胞數：陽性細胞數≤5% 計 0 分，6%～25% 計 1 分，26%～50% 計 2 分，51%～75% 計 3 分，>75%計 4 分。將兩者得分相加，<4 分為 PKM2 蛋白低表達，≥4 分為 PKM2 蛋白高表達。
1.3 隨訪
所有患者均通過電話或門診復查的方式進行隨訪，直至患者死亡或隨訪滿 5 年患者，均具有完整隨訪資料，隨訪時間為 1～60 個月，中位隨訪時間為 25 個月。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計學軟件對數據進行分析，計數資料采用卡方檢驗，生存分析采用 Kaplan-Meier法，采用單因素及多因素 Cox 回歸分析進行危險因素分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 PKM2 蛋白在肝癌組織中的表達及其與肝癌患者的臨床病理特征的關系
PKM2 蛋白表達陽性染色主要定位于細胞漿，見圖 1。有 129 例（65.8%）肝癌患者的肝癌組織中 PKM2 蛋白高表達，有 67 例（34.2%）肝癌患者的肝癌組織中 PKM2 蛋白低表達。肝癌組織中 PKM2蛋白表達與肝癌患者的性別（P=0.049鴐、腫瘤分化程度（P=0.000鴐、血清 AFP 水平（P=0.010鴐、腫瘤數目（P=0.002）及 TNM 分期（P=0.001）有關，而與患者的年齡、有無肝硬化、腫瘤最大直徑及乙肝表面抗原無關（P>0.05鴐。見表 1。
圖1
PKM2 蛋白在肝癌組織中的表達(SP ×400) a：陰性表達； b：陽性表達
表1
PKM2 蛋白表達與肝癌患者的臨床病理特征的關系
2.2 PKM2蛋白在肝癌組織中的表達與肝癌患者預后的關系
1、3、5 年總體生存率在 PKM2 蛋白高表達患者中分別為 63.3%、32.6%、24.0%，明顯低于其在 PKM2 低表達患者中的 85.1%、61.2%、52.2%，差異有統計學意義（P<0.05）；1、3、5 年無瘤生存率在 PKM2 高表達患者中分別為 52.7%、23.3%、14.7%，明顯低于其在 PKM2 低表達患者中的 80.6%、52.2%、38.8%，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
PKM2 蛋白在肝癌組織中的表達與肝癌患者預后關系的生存曲線圖 a：總體生存率； b：無瘤生存率
2.3 影響肝癌患者預后因素的分析結果
①單因素分析結果顯示，肝癌患者的總體生存率與腫瘤的分化程度、腫瘤最大直徑、腫瘤數目、 TNM 分期、乙肝表面抗原及 PKM2 蛋白表達有關（P<0.05鴐；肝癌患者的無瘤生存率與腫瘤的分化程度、腫瘤最大直徑、TNM 分期、乙肝表面抗原及 PKM2 蛋白表達有關（P<0.05鴐。②多因素 Cox 回歸分析結果顯示，腫瘤的分化程度、TNM 分期及乙肝表面抗原與肝癌患者的總體生存率及無瘤生存率均有關（P<0.05鴐。③多因素 Cox 回歸分析均顯示 PKM2 蛋白表達是肝癌患者總體生存率（HR=1.661，P=0.024）及無瘤生存率（HR=1.662，P=0.013）的獨立危險因素。見表 2、3。
表2
影響肝癌患者術后總體生存率的單因素及多因素 Cox 回歸分析結果
表3
影響肝癌患者術后無瘤生存率的單因素及多因素 Cox 回歸分析結果
3 討論
早在 1930 年，德國生物化學家 Otto Warburg 發現癌細胞采用一種特殊的方式產生能量，即使在氧氣充足的條件，大多數腫瘤細胞通過產能率相對較低的糖酵解作用為自身供能[3]。PKM2 為腫瘤細胞維持這種代謝方式的關鍵酶，同時又可作為蛋白激酶、轉錄因子等調控腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，是腫瘤代謝和細胞功能的重要紐帶[4-6]。已有研究發現，PKM2與多種腫瘤的分化和預后密切相關。Zhang 等[7]對 86 例食管鱗狀細胞癌進行免疫組織化學染色后發現，PKM2 在腫瘤的細胞漿和細胞核中均有表達，且明顯高于其癌旁組織，細胞核中 PKM2 的表達與食管鱗狀細胞癌生存時間呈明顯的負相關；Zhan 等[8]的研究再次明確了 PKM2 與食管鱗狀細胞癌的分化及預后的密切關系；后來相繼有研究發現，PKM2 的表達與子宮內膜癌[9]、胃癌[10]等的預后均有關。
眾多的基礎研究發現，PKM2 可通過多種細胞分子機制參與肝癌的增殖、侵襲及轉移。2011 年日本的 Kitamura 等[11]的研究發現，PKM2可改變肝癌的糖代謝狀態，與肝癌的增殖能力有重要關系。PKM2 還可通過上調缺氧誘導因子-1α 和 Bcl-xL 的表達，從而促進肝癌細胞增殖[12]。PKM2 還可調節上皮間質化從而促進肝癌細胞的侵襲[4]。Liu等[13]發現，PKM2 可募集骨髓來源的抑制性細胞從而促進肝癌的轉移。但 PKM2 的表達與肝癌患者的臨床病理特征和預后的關系較少有報道。
本研究對 PKM2 的表達與肝癌患者的臨床病理特征和預后的關系進行了研究，結果顯示，肝癌組織中 PKM2 蛋白高表達率為 65.8%，陽性染色主要定位于細胞漿。肝癌組織中 PKM2 蛋白表達與肝癌患者的性別、腫瘤分化程度、血清 AFP 水平、腫瘤數目及 TNM 分期有關（P<0.05）；無論是總體生存率還是無瘤生存率，在 PKM2 蛋白高表達的患者中均低于其低表達的患者，且 PKM2 蛋白高表達是肝癌預后的獨立危險因素（P<0.05）。中山大學[14]和復旦大學[15]也從臨床的角度對 PKM2 表達與肝癌的關系進行了相關報道，均認為 PKM2 可單獨或聯合 TRIM35 作為判斷肝癌預后的指標，本研究結果與之基本相符。但本研究中，PKM2 蛋白表達陽性率為 65.8%，高于中山大學和復旦大學（52.2%、32.6%）[14-15]，這種差異可能與患者的基線水平有關，在本研究中單結節腫瘤和Ⅰ～Ⅱ期的患者所占比例為 52.0%、56.1%，明顯低于中山大學的 59.8%、51.8%[14]和復旦大學的 82.2%、79.2%[15]。
本研究的數據來自西南地區的基層醫療機構，可與國內大的醫學中心發表的數據形成互補，通過不同人群、地域、不同肝癌基礎特征的臨床數據進一步驗證了 PKM2 蛋白表達與肝癌預后的關系，PKM2 對肝癌細胞的生物學行為有重要影響，可作為判斷肝癌預后的一個新的指標，但仍需要大樣本的臨床研究，進行更加深入的分子機制探索。
