引用本文： 李衍飛, 邵軍, 王志鑫, 姚寶洪, 陽丹才讓, 任利, 候立朝, 王海久, 周瀛, 溫浩, 王虎, 樊海寧. 泡球蚴囊液對大鼠肝星狀細胞TGF-β1、IL-6及TNF-α表達的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(12): 1500-1502. doi: 10.7507/1007-9424.20160378 復制
泡型肝包蟲病是泡球蚴寄生于體內臟器后所引起的疾病，流行于廣大牧區，危害極大。近年來對于泡型肝包蟲病發生和發展的研究不斷深入，然而有關泡球蚴囊液對肝星狀細胞作用的相關報道很少見。研究[1]表明，大量的細胞因子參與泡球蚴感染后宿主肝臟的纖維化過程，起到保護宿主、抵抗蟲體生長的作用。肝星狀細胞的激活是肝纖維化形成初始的中心環節[2]，轉化生長因子β1（TGF-β1）、白細胞介素6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）均在肝星狀細胞活化及其后續參與的病理生理過程中發揮不同作用。本實驗通過檢測不同濃度泡球蚴囊液干預后大鼠肝星狀細胞培養上清中TGF-β1、IL-6及TNF-α的濃度，以觀察泡球蚴囊液對肝星狀細胞分泌上述細胞因子能力的影響，初步探究泡型肝包蟲病免疫調節作用的潛在機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑
大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；泡球蚴囊液由新疆醫科大學提供；大鼠TGF-β1酶聯免疫檢測試劑盒（70-E-EK3811）、IL-6酶聯免疫檢測試劑盒（70-E-EK3061）及TNF-α酶聯免疫檢測試劑盒（70-E-EK3821）均購自杭州聯科生物科技有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
大鼠肝星狀細胞株HSC-T6采用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素以及100 g/mL鏈霉素的DMEM培養液培養，在5% CO2、37 ℃的細胞培養箱中培養24 h后，吸取上清。
1.2.2 細胞上清中TGF-β1、IL-6以及TNF-α濃度的檢測
以泡球蚴囊液中蛋白成分的濃度代表囊液濃度。將細胞接種于96孔板中（細胞數為3×105個/孔），孵育24 h后分別以0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.9、1.7、3.4、6.8以及13.5 mg/mL的泡球蚴囊液干預24 h后（每個濃度均設3個復孔），采用酶聯免疫吸附法檢測上清中TGF-β1、IL-6以及TNF-α濃度，操作均按試劑盒說明書進行。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理與分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間均數比較采用方差分析，兩兩比較采LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同濃度泡球蚴囊液干預對大鼠HSC-T6細胞中TGF-β1表達的影響
不同濃度泡球蚴囊液干預大鼠HSC-T6細胞24 h后，上清中TGF-β1濃度存在一定程度的波動（圖 1），但各濃度組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
不同濃度泡球蚴囊液對上清中TGF-β1濃度的影響
2.2 不同濃度泡球蚴囊液干預對大鼠HSC-T6細胞中IL-6表達的影響
不同濃度泡球蚴囊液干預大鼠HSC-T6細胞24 h后，上清中IL-6濃度見圖 2。由圖 2可見，當泡球蚴囊液濃度≤3.4 mg/mL時，上清中IL-6的濃度趨于平穩，各濃度組間兩兩比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；當泡球蚴囊液濃度為6.8和13.5 mg/mL時，IL-6濃度升高，分別為0 mg/mL組的3 028.65及3 879.23倍，且差異均有統計學意義（P < 0.01）。
圖2
不同濃度泡球蚴囊液對上清中IL-6濃度的影響
2.3 不同濃度泡球蚴囊液干預對大鼠HSC-T6細胞中TNF-α表達的影響
不同濃度泡球蚴囊液干預大鼠HSC-T6細胞24 h后，上清中TNF-α濃度見圖 3。由圖 3可見，當泡球蚴囊液濃度≤0.2 mg/mL時，上清中的TNF-α濃度趨于平穩，各濃度組間兩兩比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；當泡球蚴囊液濃度為0.4 mg/mL時，TNF-α濃度達到最大，為0 mg/mL組的3.53倍（P < 0.05）；此后隨濃度增高TNF-α濃度又逐漸降低，但仍高于0 mg/mL組（P < 0.05）。
圖3
不同濃度泡球蚴囊液對上清中TNF-α濃度的影響
3 討論
泡型肝包蟲病是由于泡狀棘球絳蟲幼蟲寄生所致的一種人畜共患寄生蟲病，分布于全世界各地。在我國，泡型肝包蟲病主要分布于新疆維吾爾自治區、甘肅省、四川省、寧夏回族自治區、青海省、西藏自治區等地區，青海省與四川省交界的部分高原區是泡型肝包蟲病的重災區[3-5]。泡狀棘球蚴主要寄生于肝臟（75%）[6-7]，呈惡性浸潤性生長，可繼發于肺和腦，故有“蟲癌”之稱，預后極差[7-10]。如未經及時治療，其5年和10年死亡率分別高達70%和93% [11]，危害極大。目前對于泡球蚴所致肝損傷的發生機理尚不清楚。因此，本實驗以肝星狀細胞為切入點，探索相關細胞因子與泡球蚴所致肝損傷之間的聯系，以期為后期研究奠定基礎，發現更具體的相關機制。
泡球蚴所致的肝纖維化是肝臟細胞外基質作用的結果。肝星狀細胞是肝臟細胞外基質的主要來源，在生理狀態下主要調節細胞外基質的產生和降解[12-13]。當肝臟發生損傷時，受損細胞釋放產物，激活肝星狀細胞，從而促進TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放。研究[14-18]表明，TGF-β1和IL-6具有促進肝纖維化發展的作用，TNF-α具有促進肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）表達的能力[19-20]，而HGF的分泌對肝纖維化具有一定的抑制作用[21-22]。
有研究[23-24]表明，TGF-β1拮抗劑及CD147抗體的聯合應用能夠逆轉肝纖維化，而肝星狀細胞在肝纖維化中發揮重要作用，在某些肝臟疾病的治療中也是重要的靶細胞。因此，研究肝星狀細胞分泌的TGF-β1、IL-6、TNF-α等細胞因子在泡球蚴所致的肝臟損傷中的作用具有特別重要的現實意義。本實驗結果表明，當泡球蚴囊液濃度 > 3.4 mg/mL時，肝星狀細胞培養液上清中IL-6的濃度逐漸升高；當泡球蚴囊液濃度≥0.4 mg/mL時，TNF-α濃度均顯著高于0 mg/mL組；而不同泡球蚴囊液濃度組中TGF-β1的濃度與0 mg/mL組比較差異均無統計學意義。故筆者推測：在一定泡球蚴囊液濃度的刺激下，肝星狀細胞分泌的IL-6和TNF-α水平升高，但其對TGF-β1的分泌基本沒有影響。
綜上所述，筆者初步推測，IL-6和TNF-α的表達水平升高可能進一步導致肝臟炎癥細胞浸潤，放大炎癥反應，加速肝纖維化的進程；而泡球蚴囊液對HSC-T6細胞中TGF-β1的表達無影響，可能是由于TGF-β1的表達因作用細胞的類型、分化程度、外環境及是否有其他生長因子作用而異。肝星狀細胞的激活和增殖在泡型肝包蟲病的發生中起重要作用，肝星狀細胞分泌的IL-6和TNF-α在泡型肝包蟲病的纖維化和組織損傷中扮演重要角色。但是，由于實驗過程中難免存在偏倚，泡球蚴囊液干預下肝星狀細胞的免疫學機制仍需在以后的研究中不斷研究和探索。
泡型肝包蟲病是泡球蚴寄生于體內臟器后所引起的疾病，流行于廣大牧區，危害極大。近年來對于泡型肝包蟲病發生和發展的研究不斷深入，然而有關泡球蚴囊液對肝星狀細胞作用的相關報道很少見。研究[1]表明，大量的細胞因子參與泡球蚴感染后宿主肝臟的纖維化過程，起到保護宿主、抵抗蟲體生長的作用。肝星狀細胞的激活是肝纖維化形成初始的中心環節[2]，轉化生長因子β1（TGF-β1）、白細胞介素6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）均在肝星狀細胞活化及其后續參與的病理生理過程中發揮不同作用。本實驗通過檢測不同濃度泡球蚴囊液干預后大鼠肝星狀細胞培養上清中TGF-β1、IL-6及TNF-α的濃度，以觀察泡球蚴囊液對肝星狀細胞分泌上述細胞因子能力的影響，初步探究泡型肝包蟲病免疫調節作用的潛在機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑
大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；泡球蚴囊液由新疆醫科大學提供；大鼠TGF-β1酶聯免疫檢測試劑盒（70-E-EK3811）、IL-6酶聯免疫檢測試劑盒（70-E-EK3061）及TNF-α酶聯免疫檢測試劑盒（70-E-EK3821）均購自杭州聯科生物科技有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
大鼠肝星狀細胞株HSC-T6采用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素以及100 g/mL鏈霉素的DMEM培養液培養，在5% CO2、37 ℃的細胞培養箱中培養24 h后，吸取上清。
1.2.2 細胞上清中TGF-β1、IL-6以及TNF-α濃度的檢測
以泡球蚴囊液中蛋白成分的濃度代表囊液濃度。將細胞接種于96孔板中（細胞數為3×105個/孔），孵育24 h后分別以0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.9、1.7、3.4、6.8以及13.5 mg/mL的泡球蚴囊液干預24 h后（每個濃度均設3個復孔），采用酶聯免疫吸附法檢測上清中TGF-β1、IL-6以及TNF-α濃度，操作均按試劑盒說明書進行。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理與分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間均數比較采用方差分析，兩兩比較采LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同濃度泡球蚴囊液干預對大鼠HSC-T6細胞中TGF-β1表達的影響
不同濃度泡球蚴囊液干預大鼠HSC-T6細胞24 h后，上清中TGF-β1濃度存在一定程度的波動（圖 1），但各濃度組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
不同濃度泡球蚴囊液對上清中TGF-β1濃度的影響
2.2 不同濃度泡球蚴囊液干預對大鼠HSC-T6細胞中IL-6表達的影響
不同濃度泡球蚴囊液干預大鼠HSC-T6細胞24 h后，上清中IL-6濃度見圖 2。由圖 2可見，當泡球蚴囊液濃度≤3.4 mg/mL時，上清中IL-6的濃度趨于平穩，各濃度組間兩兩比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；當泡球蚴囊液濃度為6.8和13.5 mg/mL時，IL-6濃度升高，分別為0 mg/mL組的3 028.65及3 879.23倍，且差異均有統計學意義（P < 0.01）。
圖2
不同濃度泡球蚴囊液對上清中IL-6濃度的影響
2.3 不同濃度泡球蚴囊液干預對大鼠HSC-T6細胞中TNF-α表達的影響
不同濃度泡球蚴囊液干預大鼠HSC-T6細胞24 h后，上清中TNF-α濃度見圖 3。由圖 3可見，當泡球蚴囊液濃度≤0.2 mg/mL時，上清中的TNF-α濃度趨于平穩，各濃度組間兩兩比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；當泡球蚴囊液濃度為0.4 mg/mL時，TNF-α濃度達到最大，為0 mg/mL組的3.53倍（P < 0.05）；此后隨濃度增高TNF-α濃度又逐漸降低，但仍高于0 mg/mL組（P < 0.05）。
圖3
不同濃度泡球蚴囊液對上清中TNF-α濃度的影響
3 討論
泡型肝包蟲病是由于泡狀棘球絳蟲幼蟲寄生所致的一種人畜共患寄生蟲病，分布于全世界各地。在我國，泡型肝包蟲病主要分布于新疆維吾爾自治區、甘肅省、四川省、寧夏回族自治區、青海省、西藏自治區等地區，青海省與四川省交界的部分高原區是泡型肝包蟲病的重災區[3-5]。泡狀棘球蚴主要寄生于肝臟（75%）[6-7]，呈惡性浸潤性生長，可繼發于肺和腦，故有“蟲癌”之稱，預后極差[7-10]。如未經及時治療，其5年和10年死亡率分別高達70%和93% [11]，危害極大。目前對于泡球蚴所致肝損傷的發生機理尚不清楚。因此，本實驗以肝星狀細胞為切入點，探索相關細胞因子與泡球蚴所致肝損傷之間的聯系，以期為后期研究奠定基礎，發現更具體的相關機制。
泡球蚴所致的肝纖維化是肝臟細胞外基質作用的結果。肝星狀細胞是肝臟細胞外基質的主要來源，在生理狀態下主要調節細胞外基質的產生和降解[12-13]。當肝臟發生損傷時，受損細胞釋放產物，激活肝星狀細胞，從而促進TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放。研究[14-18]表明，TGF-β1和IL-6具有促進肝纖維化發展的作用，TNF-α具有促進肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）表達的能力[19-20]，而HGF的分泌對肝纖維化具有一定的抑制作用[21-22]。
有研究[23-24]表明，TGF-β1拮抗劑及CD147抗體的聯合應用能夠逆轉肝纖維化，而肝星狀細胞在肝纖維化中發揮重要作用，在某些肝臟疾病的治療中也是重要的靶細胞。因此，研究肝星狀細胞分泌的TGF-β1、IL-6、TNF-α等細胞因子在泡球蚴所致的肝臟損傷中的作用具有特別重要的現實意義。本實驗結果表明，當泡球蚴囊液濃度 > 3.4 mg/mL時，肝星狀細胞培養液上清中IL-6的濃度逐漸升高；當泡球蚴囊液濃度≥0.4 mg/mL時，TNF-α濃度均顯著高于0 mg/mL組；而不同泡球蚴囊液濃度組中TGF-β1的濃度與0 mg/mL組比較差異均無統計學意義。故筆者推測：在一定泡球蚴囊液濃度的刺激下，肝星狀細胞分泌的IL-6和TNF-α水平升高，但其對TGF-β1的分泌基本沒有影響。
綜上所述，筆者初步推測，IL-6和TNF-α的表達水平升高可能進一步導致肝臟炎癥細胞浸潤，放大炎癥反應，加速肝纖維化的進程；而泡球蚴囊液對HSC-T6細胞中TGF-β1的表達無影響，可能是由于TGF-β1的表達因作用細胞的類型、分化程度、外環境及是否有其他生長因子作用而異。肝星狀細胞的激活和增殖在泡型肝包蟲病的發生中起重要作用，肝星狀細胞分泌的IL-6和TNF-α在泡型肝包蟲病的纖維化和組織損傷中扮演重要角色。但是，由于實驗過程中難免存在偏倚，泡球蚴囊液干預下肝星狀細胞的免疫學機制仍需在以后的研究中不斷研究和探索。
