引用本文： 李川, 沈俊頤, 文天夫. FOXA2在肝內膽管細胞癌組織中的表達及其與預后的關系分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(12): 1450-1454. doi: 10.7507/1007-9424.20160368 復制
肝癌是世界范圍內第6大常見惡性腫瘤，其發生與乙肝及丙肝病毒的慢性感染密切相關[1]。我國是乙肝大國，2006年全國流行病學調查顯示我國乙肝表面抗原陽性者約占7.18% [2]。由于我國乙肝病毒的感染率高，全球約55%的肝癌患者為中國患者[3]。肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是肝臟第二大常見原發性腫瘤，約占原發性肝臟惡性腫瘤的10%~15% [4-5]。ICC的惡性程度較高，其5年生存率約為20%~32% [6-8]。由于ICC的惡性程度高，有學者[9]甚至認為ICC患者不適合行肝移植。ICC行手術切除后的復發率較高，但其復發的危險因素及機制目前并不清楚。筆者探討了ICC組織中叉頭框蛋白A2（forkhead box A2，FOXA2）的表達情況，及其與患者臨床病理學特征及預后的關系，現報道如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集2009-2013年期間于筆者所在醫院行肝切除的ICC患者的臨床病理資料，所有患者均經術后病理學檢查證實為ICC。本組共納入85例ICC患者，其中男42例，女43例；年齡23~81歲、（56.4±12.0）歲；腫瘤直徑2~17 cm、（6.5±2.8）cm；79例腫瘤為單發，6例腫瘤為多發；低分化61例，中分化及高分化共24例；TNM分期為Ⅰ期42例，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例，Ⅳ期17例；神經侵犯8例，未發生神經侵犯79例；微血管侵犯11例，未發生微血管侵犯74例；存在腫瘤衛星灶18例，不存在腫瘤衛星灶67例；發生肝硬變14例，未發生肝硬變71例；糖類抗原19-9（CA19-9）水平正常62例，升高23例。
1.2 ICC組織中FOXA2的檢測
兔抗人FOXA2多克隆抗體購于美國Abcam公司，DVB顯色試劑盒和二步法免疫組化檢測試劑盒均購于丹麥DAKO公司，EDTA抗原修復試劑購于北京中杉金橋生物技術有限公司。ICC組織經4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片；在62 ℃烤箱內烘烤2 h后，經二甲苯脫蠟；梯度乙醇脫水后，采用3%過氧化酶阻斷溶液室溫下孵育10 min，再采用PBS液洗滌3次，5 min/次；采用EDTA緩沖液高壓熱力修復抗原20 min后，采用PBS液洗滌3次，5 min/次；滴加兔抗人FOXA2單克隆抗體（1 : 300）作為一抗，4 ℃過夜；添加生物素標記的兔二抗37 ℃溫育0.5 h；最后行DAB顯色，以蘇木精復染細胞核。用PBS液代替一抗作為陰性對照，采用反復試驗驗證的已知陽性切片（肝組織）作為陽性對照。
1.3 免疫組化結果判定
FOXA2主要表達在ICC細胞的細胞核上，以細胞核見到棕褐色染色為陽性表達。依據半定量方法對陽性表達結果進行判定，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野以觀察細胞染色情況（取均值）：陽性細胞所占比例≤50%時判定為低表達，陽性細胞所占比例 > 50%時判定為高表達。
1.4 隨訪
患者術后均每3個月隨訪1次。隨訪內容包括肝腎功能、血常規、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、CA19-9、腹部超聲/CT/MRI。術后復發定義為：與術前影像學檢查圖像相比出現新的病灶，伴/不伴腫瘤標志物升高，或經活檢/手術切除證實復發。
1.5 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析。服從正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，不服從正態分布的計量資料以中位數（M）表示，統計方法采用成組t檢驗或成組設計兩樣本比較的秩和檢驗；計數資料的統計方法采用成組χ2檢驗或Fisher確切概率法；生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法，生存分析單因素分析采用log-rank檢驗，多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。檢驗水準α=0.050。
2 結果
本組ICC患者中，FOXA2呈低表達50例（圖 1），高表達35例（圖 2）。
圖1
免疫組化染色示FOXA2呈低表達（ABC ×200）??圖 2?免疫組化染色示FOXA2呈高表達（ABC ×200）
2.1 ICC組織中FOXA2的表達與患者臨床病理學特征的關系
ICC患者中FOXA2的表達與臨床病理學特征的關系見表 1。由表 1可見，FOXA2表達與年齡、性別、腫瘤直徑、多灶性、腫瘤分化程度、神經侵犯、微血管侵犯、衛星灶、肝硬變及CA19-9水平均無關（P > 0.050），而與TNM分期相關（P < 0.050），Ⅰ+Ⅱ期患者的高表達率高于Ⅲ+Ⅳ期患者。
表1
ICC組織中FOXA2表達與患者臨床病理學特征的關系
2.2 ICC患者術后腫瘤復發的影響因素分析
術后所有患者均獲訪，隨訪時間3~73個月，中位數為15個月。隨訪期間65例腫瘤復發，64例死亡。單因素分析及多因素分析結果均表明，ICC患者術后復發與年齡、性別、腫瘤直徑、多灶性、腫瘤分化程度、TNM分期、神經侵犯、微血管侵犯及肝硬變情況均無關（P > 0.050），而與衛星灶、FOXA2表達及CA19-9水平均相關（P < 0.050），存在衛星灶、FOXA2低表達及CA19-9水平升高者的術后復發率更高（表 2和表 3）。
表2
ICC患者術后復發影響因素的單因素分析結果
表3
ICC患者術后復發影響因素的多因素分析結果
2.3 ICC患者術后生存的影響因素分析
單因素分析結果表明，ICC患者術后生存與年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、微血管侵犯及肝硬變均無關（P > 0.050），而與多灶性、TNM分期、神經侵犯、衛星灶、FOXA2表達及CA19-9水平均相關（P < 0.050），存在多灶性、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、有神經侵犯、存在衛星灶、FOXA2低表達及CA19-9水平升高患者的術后生存情況差（表 4）。多因素分析結果表明，ICC患者術后生存與神經侵犯、衛星灶、FOXA2表達及CA19-9水平均相關（P < 0.050），腫瘤神經侵犯、存在衛星灶、FOXA2低表達和術前CA19-9升高患者的術后生存差（表 5）。
表4
ICC患者術后死亡的單因素分析結果（例）
表5
ICC患者術后死亡的多因素分析結果
3 討論
ICC起源于肝內膽管上皮細胞，在原發性肝癌中，其發病率僅次于肝細胞肝癌。目前ICC的病因尚不明確，可能與膽管慢性炎癥及代謝性疾病相關[6]。ICC具有侵襲性強、轉移早、切除率低等特征。既往的研究[10-12]顯示，無論是行肝切除還是肝移植，ICC患者的預后均較肝細胞肝癌差。目前，手術切除仍然是ICC主要的根治性治療手段，但ICC患者的術后復發率高，患者總體5年生存率約為20%~32% [6-8]。
3.1 FOXA2與腫瘤
FOXA是一類DNA結合區中的具有翼狀螺旋結構的轉錄因子，已發現其3名成員（FOXA1、FOXA2和FOXA3）在哺乳動物胚胎期的器官形成、成體時期的新陳代謝和腫瘤的發生發展中起著重要作用[13-15]。在肝臟發育過程中，FOXA亞家族成員起著關鍵的調控作用，其在肝臟分化形成過程中扮演“先鋒因子”的角色[13-14]。大量研究[16-19]表明，FOXA2在肝細胞肝癌、肺癌、乳腺癌及胰腺癌組織中的表達下調，提示FOXA2參與了腫瘤的發生與發展。Tang等[20]的研究顯示，在肺癌組織中，FOXA2可結合slug，上調E-鈣黏蛋白的表達，進而抑制上皮間充質轉化。Zhang等[21]的研究顯示，在乳腺癌組織中，FOXA2可促進轉導素樣分裂增強子3（TLE3）與E盒結合鋅指蛋白2（ZEB2）結合，進而抑制上皮間充質轉化過程。Song等[22]的研究顯示，在胰腺腫瘤組織中，FOXA2的表達可導致E-鈣黏蛋白基因的啟動子廣泛甲基化，從而使E-鈣黏蛋白基因再活化。Wang等[16]的研究顯示，FOXA2的表達上調后，其可通過抑制金屬蛋白酶-9的表達，從而抑制肝細胞肝癌的轉移和侵襲。
本組資料結果表明，ICC患者中FOXA2的表達與TNM分期相關（P < 0.050）。Ⅰ+Ⅱ期患者的高表達率高于Ⅲ+Ⅳ期患者。張正良等[23]針對胃癌的研究亦表明，在胃癌組織中，FOXA2的表達與胃癌的TNM分期有關；且在胃癌MKN-45細胞系中FOXA2過表達可以抑制胃癌細胞的侵襲。
3.2 ICC術后復發和生存的危險因素
本組資料結果表明，存在腫瘤衛星灶、FOXA2低表達及術前CA19-9水平升高均是ICC患者術后腫瘤復發的危險因素；腫瘤神經侵犯、存在衛星灶、FOXA2低表達和術前CA19-9水平升高均是患者預后差的危險因素。本組資料結果提示，CA19-9可能能反映ICC患者的預后。Nuzzo等[4]認為，ICC患者術前CA19-9水平 > 100 U/mL是患者術后早期復發的危險因素。Yoo等[24]認為，患者術后CA19-9水平的變化與患者術后的生存相關。本組結果與前述研究[4, 24]結論一致。本組資料結果同時還提示，腫瘤存在衛星灶亦是患者術后復發與死亡的危險因素。Sulpice等[25]的研究亦報道存在衛星灶的ICC患者術后更易于復發。這可能與存在衛星灶的患者更易于肝內轉移相關。
3.3 FOXA2與ICC術后復發、生存的關系
本組資料結果表明，FOXA2低表達與患者術后復發與生存密切相關。最近，Kondratyeva等[26]的研究證實，在胰腺癌細胞中，FOXA2的低表達可以促進胰腺癌細胞的上皮間充質轉化，從而增強癌細胞的侵襲轉移能力。Smith等[27]對子宮內膜癌患者的研究提示，FOXA2是一種抑癌基因，具有抑制腫瘤生長的作用。這些可能亦是FOXA2低表達的ICC患者術后易于復發的原因。但目前針對FOXA2與ICC的研究較少，FOXA2表達影響ICC預后的具體機制尚不清楚。
綜上所述，在ICC患者中，FOXA2的表達與TNM分期有關；此外，FOXA2低表達是ICC患者術后腫瘤復發與死亡的危險因素。但FOXA2表達影響ICC患者預后的具體機理目前尚不清楚，值得進一步研究。
肝癌是世界范圍內第6大常見惡性腫瘤，其發生與乙肝及丙肝病毒的慢性感染密切相關[1]。我國是乙肝大國，2006年全國流行病學調查顯示我國乙肝表面抗原陽性者約占7.18% [2]。由于我國乙肝病毒的感染率高，全球約55%的肝癌患者為中國患者[3]。肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是肝臟第二大常見原發性腫瘤，約占原發性肝臟惡性腫瘤的10%~15% [4-5]。ICC的惡性程度較高，其5年生存率約為20%~32% [6-8]。由于ICC的惡性程度高，有學者[9]甚至認為ICC患者不適合行肝移植。ICC行手術切除后的復發率較高，但其復發的危險因素及機制目前并不清楚。筆者探討了ICC組織中叉頭框蛋白A2（forkhead box A2，FOXA2）的表達情況，及其與患者臨床病理學特征及預后的關系，現報道如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集2009-2013年期間于筆者所在醫院行肝切除的ICC患者的臨床病理資料，所有患者均經術后病理學檢查證實為ICC。本組共納入85例ICC患者，其中男42例，女43例；年齡23~81歲、（56.4±12.0）歲；腫瘤直徑2~17 cm、（6.5±2.8）cm；79例腫瘤為單發，6例腫瘤為多發；低分化61例，中分化及高分化共24例；TNM分期為Ⅰ期42例，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例，Ⅳ期17例；神經侵犯8例，未發生神經侵犯79例；微血管侵犯11例，未發生微血管侵犯74例；存在腫瘤衛星灶18例，不存在腫瘤衛星灶67例；發生肝硬變14例，未發生肝硬變71例；糖類抗原19-9（CA19-9）水平正常62例，升高23例。
1.2 ICC組織中FOXA2的檢測
兔抗人FOXA2多克隆抗體購于美國Abcam公司，DVB顯色試劑盒和二步法免疫組化檢測試劑盒均購于丹麥DAKO公司，EDTA抗原修復試劑購于北京中杉金橋生物技術有限公司。ICC組織經4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片；在62 ℃烤箱內烘烤2 h后，經二甲苯脫蠟；梯度乙醇脫水后，采用3%過氧化酶阻斷溶液室溫下孵育10 min，再采用PBS液洗滌3次，5 min/次；采用EDTA緩沖液高壓熱力修復抗原20 min后，采用PBS液洗滌3次，5 min/次；滴加兔抗人FOXA2單克隆抗體（1 : 300）作為一抗，4 ℃過夜；添加生物素標記的兔二抗37 ℃溫育0.5 h；最后行DAB顯色，以蘇木精復染細胞核。用PBS液代替一抗作為陰性對照，采用反復試驗驗證的已知陽性切片（肝組織）作為陽性對照。
1.3 免疫組化結果判定
FOXA2主要表達在ICC細胞的細胞核上，以細胞核見到棕褐色染色為陽性表達。依據半定量方法對陽性表達結果進行判定，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野以觀察細胞染色情況（取均值）：陽性細胞所占比例≤50%時判定為低表達，陽性細胞所占比例 > 50%時判定為高表達。
1.4 隨訪
患者術后均每3個月隨訪1次。隨訪內容包括肝腎功能、血常規、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、CA19-9、腹部超聲/CT/MRI。術后復發定義為：與術前影像學檢查圖像相比出現新的病灶，伴/不伴腫瘤標志物升高，或經活檢/手術切除證實復發。
1.5 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析。服從正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，不服從正態分布的計量資料以中位數（M）表示，統計方法采用成組t檢驗或成組設計兩樣本比較的秩和檢驗；計數資料的統計方法采用成組χ2檢驗或Fisher確切概率法；生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法，生存分析單因素分析采用log-rank檢驗，多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。檢驗水準α=0.050。
2 結果
本組ICC患者中，FOXA2呈低表達50例（圖 1），高表達35例（圖 2）。
圖1
免疫組化染色示FOXA2呈低表達（ABC ×200）??圖 2?免疫組化染色示FOXA2呈高表達（ABC ×200）
2.1 ICC組織中FOXA2的表達與患者臨床病理學特征的關系
ICC患者中FOXA2的表達與臨床病理學特征的關系見表 1。由表 1可見，FOXA2表達與年齡、性別、腫瘤直徑、多灶性、腫瘤分化程度、神經侵犯、微血管侵犯、衛星灶、肝硬變及CA19-9水平均無關（P > 0.050），而與TNM分期相關（P < 0.050），Ⅰ+Ⅱ期患者的高表達率高于Ⅲ+Ⅳ期患者。
表1
ICC組織中FOXA2表達與患者臨床病理學特征的關系
2.2 ICC患者術后腫瘤復發的影響因素分析
術后所有患者均獲訪，隨訪時間3~73個月，中位數為15個月。隨訪期間65例腫瘤復發，64例死亡。單因素分析及多因素分析結果均表明，ICC患者術后復發與年齡、性別、腫瘤直徑、多灶性、腫瘤分化程度、TNM分期、神經侵犯、微血管侵犯及肝硬變情況均無關（P > 0.050），而與衛星灶、FOXA2表達及CA19-9水平均相關（P < 0.050），存在衛星灶、FOXA2低表達及CA19-9水平升高者的術后復發率更高（表 2和表 3）。
表2
ICC患者術后復發影響因素的單因素分析結果
表3
ICC患者術后復發影響因素的多因素分析結果
2.3 ICC患者術后生存的影響因素分析
單因素分析結果表明，ICC患者術后生存與年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、微血管侵犯及肝硬變均無關（P > 0.050），而與多灶性、TNM分期、神經侵犯、衛星灶、FOXA2表達及CA19-9水平均相關（P < 0.050），存在多灶性、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、有神經侵犯、存在衛星灶、FOXA2低表達及CA19-9水平升高患者的術后生存情況差（表 4）。多因素分析結果表明，ICC患者術后生存與神經侵犯、衛星灶、FOXA2表達及CA19-9水平均相關（P < 0.050），腫瘤神經侵犯、存在衛星灶、FOXA2低表達和術前CA19-9升高患者的術后生存差（表 5）。
表4
ICC患者術后死亡的單因素分析結果（例）
表5
ICC患者術后死亡的多因素分析結果
3 討論
ICC起源于肝內膽管上皮細胞，在原發性肝癌中，其發病率僅次于肝細胞肝癌。目前ICC的病因尚不明確，可能與膽管慢性炎癥及代謝性疾病相關[6]。ICC具有侵襲性強、轉移早、切除率低等特征。既往的研究[10-12]顯示，無論是行肝切除還是肝移植，ICC患者的預后均較肝細胞肝癌差。目前，手術切除仍然是ICC主要的根治性治療手段，但ICC患者的術后復發率高，患者總體5年生存率約為20%~32% [6-8]。
3.1 FOXA2與腫瘤
FOXA是一類DNA結合區中的具有翼狀螺旋結構的轉錄因子，已發現其3名成員（FOXA1、FOXA2和FOXA3）在哺乳動物胚胎期的器官形成、成體時期的新陳代謝和腫瘤的發生發展中起著重要作用[13-15]。在肝臟發育過程中，FOXA亞家族成員起著關鍵的調控作用，其在肝臟分化形成過程中扮演“先鋒因子”的角色[13-14]。大量研究[16-19]表明，FOXA2在肝細胞肝癌、肺癌、乳腺癌及胰腺癌組織中的表達下調，提示FOXA2參與了腫瘤的發生與發展。Tang等[20]的研究顯示，在肺癌組織中，FOXA2可結合slug，上調E-鈣黏蛋白的表達，進而抑制上皮間充質轉化。Zhang等[21]的研究顯示，在乳腺癌組織中，FOXA2可促進轉導素樣分裂增強子3（TLE3）與E盒結合鋅指蛋白2（ZEB2）結合，進而抑制上皮間充質轉化過程。Song等[22]的研究顯示，在胰腺腫瘤組織中，FOXA2的表達可導致E-鈣黏蛋白基因的啟動子廣泛甲基化，從而使E-鈣黏蛋白基因再活化。Wang等[16]的研究顯示，FOXA2的表達上調后，其可通過抑制金屬蛋白酶-9的表達，從而抑制肝細胞肝癌的轉移和侵襲。
本組資料結果表明，ICC患者中FOXA2的表達與TNM分期相關（P < 0.050）。Ⅰ+Ⅱ期患者的高表達率高于Ⅲ+Ⅳ期患者。張正良等[23]針對胃癌的研究亦表明，在胃癌組織中，FOXA2的表達與胃癌的TNM分期有關；且在胃癌MKN-45細胞系中FOXA2過表達可以抑制胃癌細胞的侵襲。
3.2 ICC術后復發和生存的危險因素
本組資料結果表明，存在腫瘤衛星灶、FOXA2低表達及術前CA19-9水平升高均是ICC患者術后腫瘤復發的危險因素；腫瘤神經侵犯、存在衛星灶、FOXA2低表達和術前CA19-9水平升高均是患者預后差的危險因素。本組資料結果提示，CA19-9可能能反映ICC患者的預后。Nuzzo等[4]認為，ICC患者術前CA19-9水平 > 100 U/mL是患者術后早期復發的危險因素。Yoo等[24]認為，患者術后CA19-9水平的變化與患者術后的生存相關。本組結果與前述研究[4, 24]結論一致。本組資料結果同時還提示，腫瘤存在衛星灶亦是患者術后復發與死亡的危險因素。Sulpice等[25]的研究亦報道存在衛星灶的ICC患者術后更易于復發。這可能與存在衛星灶的患者更易于肝內轉移相關。
3.3 FOXA2與ICC術后復發、生存的關系
本組資料結果表明，FOXA2低表達與患者術后復發與生存密切相關。最近，Kondratyeva等[26]的研究證實，在胰腺癌細胞中，FOXA2的低表達可以促進胰腺癌細胞的上皮間充質轉化，從而增強癌細胞的侵襲轉移能力。Smith等[27]對子宮內膜癌患者的研究提示，FOXA2是一種抑癌基因，具有抑制腫瘤生長的作用。這些可能亦是FOXA2低表達的ICC患者術后易于復發的原因。但目前針對FOXA2與ICC的研究較少，FOXA2表達影響ICC預后的具體機制尚不清楚。
綜上所述，在ICC患者中，FOXA2的表達與TNM分期有關；此外，FOXA2低表達是ICC患者術后腫瘤復發與死亡的危險因素。但FOXA2表達影響ICC患者預后的具體機理目前尚不清楚，值得進一步研究。
