引用本文： 張小東, 楊照國, 楊良, 馬英博, 李航宇. PKM2和YAP在人肝癌組織中的表達及其相關性分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(12): 1443-1449. doi: 10.7507/1007-9424.20160367 復制
肝癌是一種常見的、死亡率高的惡性腫瘤，其發病率在世界范圍內位居第4位，在中國位于第2位[1]。目前肝癌的治療方法主要是手術切除腫瘤組織[2]，但這并無法徹底治愈肝癌，且手術患者術后往往預后不良。因此研究肝癌發生發展的機理已成為近年來的重點。近幾年的研究[3-5]表明，在腫瘤細胞的發生發展過程中，往往伴隨著能量代謝的改變，其主要能量代謝方式是有氧糖酵解，而導致腫瘤細胞有氧糖酵解增強的原因與糖酵解過程中關鍵酶的合成增加、活性增強及某些信號通路異常相關，因此研究有氧糖酵解過程中的關鍵酶與信號通路之間的調控關系對于探究腫瘤的發生發展機理極為重要。丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）是有氧糖酵解過程中的關鍵酶[6-7]，目前已在結直腸癌、腎細胞癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中檢測到PKM2蛋白呈高表達，且其含量與腫瘤的分期密切相關[8-9]。yes相關蛋白（yes association protein，YAP）是HIPPO信號通路下游的效應蛋白，其已被證實在包括肝癌在內的多種腫瘤組織中表達上調，并能促進腫瘤的侵襲和轉移[10-11]。最新的研究[12]表明，YAP蛋白與腫瘤細胞能量代謝過程密切相關，無論是抑制腫瘤細胞的葡萄糖攝取、有氧糖酵解過程，還是將有氧糖酵解向氧化磷酸化過程轉化，均能抑制YAP蛋白的致癌活性。然而目前關于PKM2蛋白與YAP蛋白在肝癌組織中表達的相關性尚不明確，深化PKM2蛋白與YAP蛋白的研究將為未來肝癌的臨床治療提供潛在的靶點。因此，本實驗擬利用免疫組織化學染色方法檢測肝癌組織及癌旁組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達情況，并采用Western blot與實時熒光定量PCR方法檢測癌旁組織和肝癌組織中PKM2蛋白、YAP蛋白及其mRNA的表達水平，以探討PKM2蛋白與YAP蛋白在肝癌組織中表達的相關性，同時結合其表達與患者臨床病理學特征之間的關系，探討PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織中表達的意義，為有效治療肝癌提供策略支持。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集2010年4月至2013年10月期間于中國醫科大學附屬第四醫院行手術切除的120例肝細胞癌標本。所有病例均有完整的隨訪資料，且所有患者術前均未進行化療和放療治療。120例患者中，男93例，女27例；年齡39~79歲，平均55.3歲，其中≤55歲53例， > 55歲67例；腫瘤直徑≤5 cm59例， > 5 cm 61例；按國際抗癌聯盟（UICC）分期標準[13]進行分期：Ⅰ期+Ⅱ期76例，Ⅲ期+Ⅳ期44例；低分化28例，中、高分化92例；合并肝炎112例，未合并肝炎8例；甲胎蛋白（AFP）水平≤200 ng/mL48例， > 200 ng/mL 72例。肝癌標本同時取癌旁組織標本（距離腫瘤 > 2 cm）作為對照。其中，50例肝癌組織及癌旁組織標本具備手術時立即取材的新鮮冰凍組織標本，置液氮冷卻后送-70 ℃冷凍冰箱保存，以供Western blot與實時熒光定量PCR檢測。50例患者中，男31例，女19例；年齡43~65歲，平均53.5歲，其中≤55歲21例， > 55歲29例；腫瘤直徑≤5 cm 23例， > 5 cm 27例；Ⅰ期+Ⅱ期32例，Ⅲ期+Ⅳ期18例；低分化11例，中、高分化39例。組織病理學評估均由兩位高年資病理醫生獨立觀察，確診為肝細胞癌并復查無誤。所有標本檢測均經患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。
1.2 主要試劑和設備
主要試劑：免疫組織化學試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發公司，兔抗人YAP、PKM2多克隆抗體和鼠抗人多克隆β-actin抗體均購于ProteinTech公司，辣根酶標記的羊抗鼠IgG和辣根酶標記的羊抗兔IgG均購于北京中衫生物有限公司，PCR引物購于北京鼎國生物公司，實時熒光定量PCR試劑盒購于Promega試劑公司。主要設備：BX51光學顯微鏡購自Lesia公司，PowerPac Basic電泳系統及轉膜系統均購自美國Bio-Rad公司，5500全自動化學發光成像分析系統購自上海天能公司，TP600 PCR儀購自TAKARA公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫組織化學染色法檢測PKM2蛋白和YAP蛋白的表達
采用免疫組織化學染色法檢測120例肝癌及其癌旁組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達。免疫組織化學染色的具體操作嚴格按照說明書進行，用已知陽性組織（陽性對照是由兩位病理醫生獨立在肝癌組織中進行PKM2和YAP蛋白染色并確定陽性表達的其他肝癌組織）切片作為陽性對照，以PBS溶液替代一抗作為陰性對照。結果判定標準嚴格規范化[14]。陽性判斷標準以出現黃色或棕黃色顆粒為陽性，評分標準采用綜合評價法，且每張切片隨機觀察100個細胞。染色范圍評分標準：無陽性細胞為（-），為0分；陽性細胞占1%~30%為（+），為1分；陽性細胞占31%~60%為（++），為2分；陽性細胞所占比例 > 60%為（+++），為3分。染色強度評分標準：無染色為0分，染色顆粒黃、細、成堆為1分，染色顆粒深黃、粗、成片為2分，染色顆粒棕黃、粗大、成片為3分。染色范圍評分和染色強度評分相乘即為腫瘤細胞的免疫組織化學染色得分，0分為（-），1~2分為（+），3~4分為（++）， > 4分為（+++），其中（-）為陰性表達，（+）~（+++）為陽性表達[15]。
1.3.2 western blot法檢測PKM2蛋白和YAP蛋白的相對表達水平
采用western blot法檢測50例肝癌及其癌旁組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的相對表達水平。Western blot的具體操作嚴格按照說明書進行。通過Image J軟件分析圖像，分別以PKM2蛋白、YAP蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。
1.3.3 實時熒光定量PCR法檢測PKM2 mRNA和YAP mRNA的相對表達水平
采用實時熒光定量PCR法檢測50例新鮮肝癌及其癌旁組織中PKM2mRNA和YAP mRNA的相對表達水平。將組織剪碎后，用Trizol試劑提取組織總RNA，根據試劑盒說明書步驟進行實時熒光定量PCR檢測。PKM2基因的上游引物序列為：5’-ATGTCGAAGCCCCATAGT-GAA-3’，下游引物序列為：5’-TGGGTGGTGAATCAA-TGTCCA-3’，擴增片段長度為118 bp；YAP基因的上游引物序列為：5’-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3’，下游引物序列為：5’-TCATGCTTAGTCCACTGTCT-GT-3’，擴增片段長度為177 bp；內參18S基因的上游引物序列為：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT-GG-3’，擴增片段長度為197 bp。實時熒光定量PCR反應體系按照SYBR Green說明書配制。實時熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s退火，共40個循環。根據繪制的標準曲線得到PKM2 mRNA和YAP mRNA表達的相對濃度，以目的基因與18S基因相對濃度的比值來表示目的基因的表達量。每例設2個復孔，取均值。
1.4 統計學分析
采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，統計方法采用配對t檢驗；計數資料的統計分析方法采用配對χ2檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析。檢驗水準（雙側）α=0.050。
2 結果
2.1 免疫組織化學染色結果
2.1.1 肝癌組織和癌旁組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達
免疫組織化學染色結果示，PKM2蛋白表達陽性時，染色呈現棕黃色，主要在細胞漿內表達（圖 1）。其在肝癌組織中表達呈（-）39例，（+）30例，（++）27例，（+++）24例，總表達陽性率為67.50%（81/120）；其在癌旁組織中的表達呈（-）95例，（+）23例，（++）2例，（+++）0例，總表達陽性率為20.83%（25/120）。YAP蛋白表達陽性時，染色呈現棕黃色，主要在細胞核內，少量在細胞漿內表達（圖 1）。其在肝癌組織中表達呈（-）34例，（+）32例，（++）27例，（+++）27例，總表達陽性率為71.67%（86/120），在癌旁組織中表達呈（-）85例，（+）32例，（++）2例，（+++）1例，總表達陽性率為29.17%（35/120）。肝癌組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的總表達陽性率均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P < 0.050）。
圖1
示PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織和癌旁組織中表達的SP免疫組織化學染色結果，上圖為100倍，下圖為400倍。1A：PKM2蛋白在癌旁組織中呈（-）表達；1B：PKM2蛋白在肝癌組織中呈（+++）表達；1C：YAP蛋白在癌旁組織中呈（-）表達；1D：YAP蛋白在肝癌組織中呈（+++）表達
2.1.2 肝癌組織中PKM2蛋白表達與YAP蛋白表達的相關性
肝癌組織中，PKM2蛋白和YAP蛋白的表達呈正相關（r=0.519，P < 0.001），見表 1。提示在肝癌組織中，PKM2蛋白和YAP蛋白可能存在協同作用，共同促進肝癌的發生發展。
表1
肝癌組織中PKM2蛋白表達與YAP蛋白表達的相關性
2.1.3 肝癌組織中PKM2和YAP蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系
肝癌組織中PKM2蛋白的表達與性別、年齡及合并肝炎均無關（P > 0.050），而與腫瘤直徑、TNM分期、腫瘤分化程度及AFP水平相關（P < 0.050），腫瘤直徑 > 5 cm、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、腫瘤分化程度為低分化、AFP水平 > 200 ng/mL肝癌患者的PKM2蛋白的表達陽性率較高。肝癌組織中YAP蛋白的表達與性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期及合并肝炎均無關（P > 0.050），而與腫瘤分化程度和AFP水平有關（P < 0.050），AFP水平 > 200 ng/mL、分化程度為低分化肝癌患者的YAP蛋白的表達陽性率較高。見表 2。
表2
肝癌組織中PKM2蛋白和YAP蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系（例）
2.2 Western blot結果
Western blot結果顯示，50例肝癌組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達水平分別為1.25±0.11和1.08±0.10，癌旁組織分別為0.38±0.01和0.41±0.02。肝癌組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達水平均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P < 0.050），見圖 2。
圖2
示PKM2和YAP蛋白在肝癌組織和癌旁組織中表達的電泳結果（部分代表性蛋白條帶圖）。N：癌旁組織；T：肝癌組織；1-7：病例編號
2.3 實時熒光定量PCR結果
實時熒光定量PCR結果表明，以癌旁組織作為基準（即為1），肝癌組織中PKM2 mRNA和YAP mRNA的表達水平分別為11.38±0.35和19.96±0.48，肝癌組織中PKM2 mRNA和YAP mRNA的相對表達水平均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P < 0.050），見圖 3。
圖3
示肝癌組織和癌旁組織中PKM2 mRNA和YAP mRNA的相對表達水平（以癌旁組織作為基準）
3 討論
腫瘤細胞即使在有氧條件下，也經由糖酵解轉化大量葡萄糖而生成乳酸，這一現象被稱為Warburg效應[16-17]，是腫瘤細胞的基本特征之一。在糖酵解過程中有多種酶發揮重要的作用，其中PKM2蛋白值得我們關注。PKM2蛋白是丙酮酸激酶（PK）的同工酶，PK在代謝過程中的主要功能是催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸產生丙酮酸。而PKM2蛋白除了通過核轉錄調節和活性調節兩個方面調控腫瘤細胞的能量代謝過程外，還參與到了多種信號通路的轉錄調控活動中[18]。PKM2蛋白的表達既可以被缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α）和C-MYC基因調控[19-20]，也可以在磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路過度活化后表達上調，引起Warburg效應的增強[21]。鑒于PKM2蛋白在維系腫瘤細胞能量和合成原料供應平衡中發揮的重要作用及其與信號通路之間的調控關系，其已成為腫瘤診斷和治療領域的研究熱點。
越來越多的研究[22-24]表明，YAP蛋白是致癌蛋白，其與多種腫瘤的發生發展密切相關。YAP蛋白在細胞核內的聚集以及表達上調是引起細胞過度增殖、乃至癌變的重要因素。近幾年的研究[25-27]表明，YAP蛋白在腫瘤細胞能量代謝改變的過程中同樣發揮著重要作用。DeRan等[25]發現，細胞內能量水平是YAP基因上游的調節因子，細胞能量應激狀態的出現，如葡萄糖代謝的抑制和ATP產生減少，均能抑制YAP基因的活性，進而影響腫瘤細胞的增殖。Wang等[26]在對肝癌和結腸癌組織的免疫組織化學研究中發現，YAP蛋白與葡萄糖轉運蛋白3（glucose transporter 3，GLUT3）都處于高表達狀態，且相關性分析表明二者表達呈正相關；進一步開展細胞水平上的研究表明，YAP蛋白通過直接上調GLUT3蛋白的表達來促進腫瘤細胞的葡萄糖攝取和有氧糖酵解過程。Enzo等[27]的研究表明，在腫瘤細胞中，有氧糖酵解除了發揮自身的生化作用外，還可以參與調控YAP蛋白的表達，進一步促進腫瘤細胞的增殖和侵襲；此外，磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase 1，PFK1）--糖酵解過程中的第一個關鍵酶，通過與YAP/TEAD轉錄因子復合體相互作用，直接參與對YAP基因的表達調控。那么，糖酵解過程中的另一重要關鍵酶--PKM2，其與YAP之間存在怎樣的關系值得我們進一步研究。因此明確PKM2蛋白與YAP蛋白在肝癌組織中的表達及相關性，對肝癌的發生、發展、早期診斷和治療研究均具有潛在的意義。
在本研究中，筆者首先利用免疫組織化學染色SP方法，研究了PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達情況。結果顯示，PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織中的表達陽性率均高于癌旁組織（P < 0.050），YAP蛋白在肝癌組織中主要在細胞核內表達，PKM2蛋白則主要在肝癌組織的細胞漿內表達；且二者之間的相關性分析結果表明，在肝癌組織中，PKM2蛋白和YAP蛋白的表達呈正相關關系（r=0.519，P < 0.001）。該結果提示，PKM2蛋白與YAP蛋白的表達與肝癌的發生密切相關，二者可能具有協同作用。接下來，筆者通過分析PKM2蛋白和YAP蛋白與患者臨床病理學特征的關系后發現，PKM2蛋白和YAP蛋白的表達均與肝癌的分化程度以及AFP水平相關，陽性表達PKM2蛋白和YAP蛋白的患者往往伴隨著腫瘤分化程度的降低以及AFP水平的升高。為了進一步明確PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織中的表達關系，筆者在免疫組織化學染色結果的基礎上，利用Western blot與實時熒光定量PCR方法對50例新鮮冰凍肝癌組織及其癌旁組織標本進行蛋白水平和mRNA水平的檢測，結果western blot與實時熒光定量PCR的結果與免疫組織化學染色結果一致，即在蛋白和mRNA兩個水平，PKM2和YAP在肝癌組織中的表達都高于癌旁組織（P < 0.050）。以上結果表明，肝癌的發生發展與PKM2蛋白和YAP蛋白的表達密切相關，但是二者之間的確切調控關系還需細胞水平的實驗驗證。深入探索PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌中的調控機理，有望為肝癌的臨床治療提供潛在的靶點支持。
肝癌是一種常見的、死亡率高的惡性腫瘤，其發病率在世界范圍內位居第4位，在中國位于第2位[1]。目前肝癌的治療方法主要是手術切除腫瘤組織[2]，但這并無法徹底治愈肝癌，且手術患者術后往往預后不良。因此研究肝癌發生發展的機理已成為近年來的重點。近幾年的研究[3-5]表明，在腫瘤細胞的發生發展過程中，往往伴隨著能量代謝的改變，其主要能量代謝方式是有氧糖酵解，而導致腫瘤細胞有氧糖酵解增強的原因與糖酵解過程中關鍵酶的合成增加、活性增強及某些信號通路異常相關，因此研究有氧糖酵解過程中的關鍵酶與信號通路之間的調控關系對于探究腫瘤的發生發展機理極為重要。丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）是有氧糖酵解過程中的關鍵酶[6-7]，目前已在結直腸癌、腎細胞癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中檢測到PKM2蛋白呈高表達，且其含量與腫瘤的分期密切相關[8-9]。yes相關蛋白（yes association protein，YAP）是HIPPO信號通路下游的效應蛋白，其已被證實在包括肝癌在內的多種腫瘤組織中表達上調，并能促進腫瘤的侵襲和轉移[10-11]。最新的研究[12]表明，YAP蛋白與腫瘤細胞能量代謝過程密切相關，無論是抑制腫瘤細胞的葡萄糖攝取、有氧糖酵解過程，還是將有氧糖酵解向氧化磷酸化過程轉化，均能抑制YAP蛋白的致癌活性。然而目前關于PKM2蛋白與YAP蛋白在肝癌組織中表達的相關性尚不明確，深化PKM2蛋白與YAP蛋白的研究將為未來肝癌的臨床治療提供潛在的靶點。因此，本實驗擬利用免疫組織化學染色方法檢測肝癌組織及癌旁組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達情況，并采用Western blot與實時熒光定量PCR方法檢測癌旁組織和肝癌組織中PKM2蛋白、YAP蛋白及其mRNA的表達水平，以探討PKM2蛋白與YAP蛋白在肝癌組織中表達的相關性，同時結合其表達與患者臨床病理學特征之間的關系，探討PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織中表達的意義，為有效治療肝癌提供策略支持。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集2010年4月至2013年10月期間于中國醫科大學附屬第四醫院行手術切除的120例肝細胞癌標本。所有病例均有完整的隨訪資料，且所有患者術前均未進行化療和放療治療。120例患者中，男93例，女27例；年齡39~79歲，平均55.3歲，其中≤55歲53例， > 55歲67例；腫瘤直徑≤5 cm59例， > 5 cm 61例；按國際抗癌聯盟（UICC）分期標準[13]進行分期：Ⅰ期+Ⅱ期76例，Ⅲ期+Ⅳ期44例；低分化28例，中、高分化92例；合并肝炎112例，未合并肝炎8例；甲胎蛋白（AFP）水平≤200 ng/mL48例， > 200 ng/mL 72例。肝癌標本同時取癌旁組織標本（距離腫瘤 > 2 cm）作為對照。其中，50例肝癌組織及癌旁組織標本具備手術時立即取材的新鮮冰凍組織標本，置液氮冷卻后送-70 ℃冷凍冰箱保存，以供Western blot與實時熒光定量PCR檢測。50例患者中，男31例，女19例；年齡43~65歲，平均53.5歲，其中≤55歲21例， > 55歲29例；腫瘤直徑≤5 cm 23例， > 5 cm 27例；Ⅰ期+Ⅱ期32例，Ⅲ期+Ⅳ期18例；低分化11例，中、高分化39例。組織病理學評估均由兩位高年資病理醫生獨立觀察，確診為肝細胞癌并復查無誤。所有標本檢測均經患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。
1.2 主要試劑和設備
主要試劑：免疫組織化學試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發公司，兔抗人YAP、PKM2多克隆抗體和鼠抗人多克隆β-actin抗體均購于ProteinTech公司，辣根酶標記的羊抗鼠IgG和辣根酶標記的羊抗兔IgG均購于北京中衫生物有限公司，PCR引物購于北京鼎國生物公司，實時熒光定量PCR試劑盒購于Promega試劑公司。主要設備：BX51光學顯微鏡購自Lesia公司，PowerPac Basic電泳系統及轉膜系統均購自美國Bio-Rad公司，5500全自動化學發光成像分析系統購自上海天能公司，TP600 PCR儀購自TAKARA公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫組織化學染色法檢測PKM2蛋白和YAP蛋白的表達
采用免疫組織化學染色法檢測120例肝癌及其癌旁組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達。免疫組織化學染色的具體操作嚴格按照說明書進行，用已知陽性組織（陽性對照是由兩位病理醫生獨立在肝癌組織中進行PKM2和YAP蛋白染色并確定陽性表達的其他肝癌組織）切片作為陽性對照，以PBS溶液替代一抗作為陰性對照。結果判定標準嚴格規范化[14]。陽性判斷標準以出現黃色或棕黃色顆粒為陽性，評分標準采用綜合評價法，且每張切片隨機觀察100個細胞。染色范圍評分標準：無陽性細胞為（-），為0分；陽性細胞占1%~30%為（+），為1分；陽性細胞占31%~60%為（++），為2分；陽性細胞所占比例 > 60%為（+++），為3分。染色強度評分標準：無染色為0分，染色顆粒黃、細、成堆為1分，染色顆粒深黃、粗、成片為2分，染色顆粒棕黃、粗大、成片為3分。染色范圍評分和染色強度評分相乘即為腫瘤細胞的免疫組織化學染色得分，0分為（-），1~2分為（+），3~4分為（++）， > 4分為（+++），其中（-）為陰性表達，（+）~（+++）為陽性表達[15]。
1.3.2 western blot法檢測PKM2蛋白和YAP蛋白的相對表達水平
采用western blot法檢測50例肝癌及其癌旁組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的相對表達水平。Western blot的具體操作嚴格按照說明書進行。通過Image J軟件分析圖像，分別以PKM2蛋白、YAP蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。
1.3.3 實時熒光定量PCR法檢測PKM2 mRNA和YAP mRNA的相對表達水平
采用實時熒光定量PCR法檢測50例新鮮肝癌及其癌旁組織中PKM2mRNA和YAP mRNA的相對表達水平。將組織剪碎后，用Trizol試劑提取組織總RNA，根據試劑盒說明書步驟進行實時熒光定量PCR檢測。PKM2基因的上游引物序列為：5’-ATGTCGAAGCCCCATAGT-GAA-3’，下游引物序列為：5’-TGGGTGGTGAATCAA-TGTCCA-3’，擴增片段長度為118 bp；YAP基因的上游引物序列為：5’-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3’，下游引物序列為：5’-TCATGCTTAGTCCACTGTCT-GT-3’，擴增片段長度為177 bp；內參18S基因的上游引物序列為：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT-GG-3’，擴增片段長度為197 bp。實時熒光定量PCR反應體系按照SYBR Green說明書配制。實時熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s退火，共40個循環。根據繪制的標準曲線得到PKM2 mRNA和YAP mRNA表達的相對濃度，以目的基因與18S基因相對濃度的比值來表示目的基因的表達量。每例設2個復孔，取均值。
1.4 統計學分析
采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，統計方法采用配對t檢驗；計數資料的統計分析方法采用配對χ2檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析。檢驗水準（雙側）α=0.050。
2 結果
2.1 免疫組織化學染色結果
2.1.1 肝癌組織和癌旁組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達
免疫組織化學染色結果示，PKM2蛋白表達陽性時，染色呈現棕黃色，主要在細胞漿內表達（圖 1）。其在肝癌組織中表達呈（-）39例，（+）30例，（++）27例，（+++）24例，總表達陽性率為67.50%（81/120）；其在癌旁組織中的表達呈（-）95例，（+）23例，（++）2例，（+++）0例，總表達陽性率為20.83%（25/120）。YAP蛋白表達陽性時，染色呈現棕黃色，主要在細胞核內，少量在細胞漿內表達（圖 1）。其在肝癌組織中表達呈（-）34例，（+）32例，（++）27例，（+++）27例，總表達陽性率為71.67%（86/120），在癌旁組織中表達呈（-）85例，（+）32例，（++）2例，（+++）1例，總表達陽性率為29.17%（35/120）。肝癌組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的總表達陽性率均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P < 0.050）。
圖1
示PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織和癌旁組織中表達的SP免疫組織化學染色結果，上圖為100倍，下圖為400倍。1A：PKM2蛋白在癌旁組織中呈（-）表達；1B：PKM2蛋白在肝癌組織中呈（+++）表達；1C：YAP蛋白在癌旁組織中呈（-）表達；1D：YAP蛋白在肝癌組織中呈（+++）表達
2.1.2 肝癌組織中PKM2蛋白表達與YAP蛋白表達的相關性
肝癌組織中，PKM2蛋白和YAP蛋白的表達呈正相關（r=0.519，P < 0.001），見表 1。提示在肝癌組織中，PKM2蛋白和YAP蛋白可能存在協同作用，共同促進肝癌的發生發展。
表1
肝癌組織中PKM2蛋白表達與YAP蛋白表達的相關性
2.1.3 肝癌組織中PKM2和YAP蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系
肝癌組織中PKM2蛋白的表達與性別、年齡及合并肝炎均無關（P > 0.050），而與腫瘤直徑、TNM分期、腫瘤分化程度及AFP水平相關（P < 0.050），腫瘤直徑 > 5 cm、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、腫瘤分化程度為低分化、AFP水平 > 200 ng/mL肝癌患者的PKM2蛋白的表達陽性率較高。肝癌組織中YAP蛋白的表達與性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期及合并肝炎均無關（P > 0.050），而與腫瘤分化程度和AFP水平有關（P < 0.050），AFP水平 > 200 ng/mL、分化程度為低分化肝癌患者的YAP蛋白的表達陽性率較高。見表 2。
表2
肝癌組織中PKM2蛋白和YAP蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系（例）
2.2 Western blot結果
Western blot結果顯示，50例肝癌組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達水平分別為1.25±0.11和1.08±0.10，癌旁組織分別為0.38±0.01和0.41±0.02。肝癌組織中PKM2蛋白和YAP蛋白的表達水平均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P < 0.050），見圖 2。
圖2
示PKM2和YAP蛋白在肝癌組織和癌旁組織中表達的電泳結果（部分代表性蛋白條帶圖）。N：癌旁組織；T：肝癌組織；1-7：病例編號
2.3 實時熒光定量PCR結果
實時熒光定量PCR結果表明，以癌旁組織作為基準（即為1），肝癌組織中PKM2 mRNA和YAP mRNA的表達水平分別為11.38±0.35和19.96±0.48，肝癌組織中PKM2 mRNA和YAP mRNA的相對表達水平均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P < 0.050），見圖 3。
圖3
示肝癌組織和癌旁組織中PKM2 mRNA和YAP mRNA的相對表達水平（以癌旁組織作為基準）
3 討論
腫瘤細胞即使在有氧條件下，也經由糖酵解轉化大量葡萄糖而生成乳酸，這一現象被稱為Warburg效應[16-17]，是腫瘤細胞的基本特征之一。在糖酵解過程中有多種酶發揮重要的作用，其中PKM2蛋白值得我們關注。PKM2蛋白是丙酮酸激酶（PK）的同工酶，PK在代謝過程中的主要功能是催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸產生丙酮酸。而PKM2蛋白除了通過核轉錄調節和活性調節兩個方面調控腫瘤細胞的能量代謝過程外，還參與到了多種信號通路的轉錄調控活動中[18]。PKM2蛋白的表達既可以被缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α）和C-MYC基因調控[19-20]，也可以在磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路過度活化后表達上調，引起Warburg效應的增強[21]。鑒于PKM2蛋白在維系腫瘤細胞能量和合成原料供應平衡中發揮的重要作用及其與信號通路之間的調控關系，其已成為腫瘤診斷和治療領域的研究熱點。
越來越多的研究[22-24]表明，YAP蛋白是致癌蛋白，其與多種腫瘤的發生發展密切相關。YAP蛋白在細胞核內的聚集以及表達上調是引起細胞過度增殖、乃至癌變的重要因素。近幾年的研究[25-27]表明，YAP蛋白在腫瘤細胞能量代謝改變的過程中同樣發揮著重要作用。DeRan等[25]發現，細胞內能量水平是YAP基因上游的調節因子，細胞能量應激狀態的出現，如葡萄糖代謝的抑制和ATP產生減少，均能抑制YAP基因的活性，進而影響腫瘤細胞的增殖。Wang等[26]在對肝癌和結腸癌組織的免疫組織化學研究中發現，YAP蛋白與葡萄糖轉運蛋白3（glucose transporter 3，GLUT3）都處于高表達狀態，且相關性分析表明二者表達呈正相關；進一步開展細胞水平上的研究表明，YAP蛋白通過直接上調GLUT3蛋白的表達來促進腫瘤細胞的葡萄糖攝取和有氧糖酵解過程。Enzo等[27]的研究表明，在腫瘤細胞中，有氧糖酵解除了發揮自身的生化作用外，還可以參與調控YAP蛋白的表達，進一步促進腫瘤細胞的增殖和侵襲；此外，磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase 1，PFK1）--糖酵解過程中的第一個關鍵酶，通過與YAP/TEAD轉錄因子復合體相互作用，直接參與對YAP基因的表達調控。那么，糖酵解過程中的另一重要關鍵酶--PKM2，其與YAP之間存在怎樣的關系值得我們進一步研究。因此明確PKM2蛋白與YAP蛋白在肝癌組織中的表達及相關性，對肝癌的發生、發展、早期診斷和治療研究均具有潛在的意義。
在本研究中，筆者首先利用免疫組織化學染色SP方法，研究了PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達情況。結果顯示，PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織中的表達陽性率均高于癌旁組織（P < 0.050），YAP蛋白在肝癌組織中主要在細胞核內表達，PKM2蛋白則主要在肝癌組織的細胞漿內表達；且二者之間的相關性分析結果表明，在肝癌組織中，PKM2蛋白和YAP蛋白的表達呈正相關關系（r=0.519，P < 0.001）。該結果提示，PKM2蛋白與YAP蛋白的表達與肝癌的發生密切相關，二者可能具有協同作用。接下來，筆者通過分析PKM2蛋白和YAP蛋白與患者臨床病理學特征的關系后發現，PKM2蛋白和YAP蛋白的表達均與肝癌的分化程度以及AFP水平相關，陽性表達PKM2蛋白和YAP蛋白的患者往往伴隨著腫瘤分化程度的降低以及AFP水平的升高。為了進一步明確PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌組織中的表達關系，筆者在免疫組織化學染色結果的基礎上，利用Western blot與實時熒光定量PCR方法對50例新鮮冰凍肝癌組織及其癌旁組織標本進行蛋白水平和mRNA水平的檢測，結果western blot與實時熒光定量PCR的結果與免疫組織化學染色結果一致，即在蛋白和mRNA兩個水平，PKM2和YAP在肝癌組織中的表達都高于癌旁組織（P < 0.050）。以上結果表明，肝癌的發生發展與PKM2蛋白和YAP蛋白的表達密切相關，但是二者之間的確切調控關系還需細胞水平的實驗驗證。深入探索PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌中的調控機理，有望為肝癌的臨床治療提供潛在的靶點支持。
