引用本文： 瞿軍, 沈葉, 王文杰, 黃忠明, 王時光, 吳濤. 鼠單側喉返神經橫斷后喉內肌和喉返神經變化特征的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(12): 1437-1442. doi: 10.7507/1007-9424.20160366 復制
喉返神經支配除環甲肌之外的喉內肌[1]，其損傷是甲狀腺手術等頸部手術的常見并發癥[2]。由喉返神經損傷引起的聲帶麻痹嚴重影響患者的生活質量[3-4]。臨床上對單側聲帶麻痹常通過手術治療[5]，雖然取得了一定的臨床效果，但術后神經功能的恢復卻不完全[6]。神經營養因子具有減少神經變性、刺激軸突生長及促進神經再生的功能[7-9]。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在維持神經細胞的存活、增殖、生長、分化及遷移方面均有重要作用[10-11]。目前，雖然有學者[12-14]做了部分基礎研究，但是關于患者喉返神經橫斷傷后神經和喉內肌變化的研究仍較少。筆者建立了大鼠喉返神經橫斷傷模型，通過研究神經和喉內肌的變化特征，探索了該種損傷的自愈能力，為研究喉返神經損傷修復做鋪墊。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
健康成年雄性清潔級Wistar大鼠30只（體質量340~360 g，12周齡），來源于上海市奉賢區中心醫院動物房（批號：2008001642157）。隨機（隨機數字表法）將大鼠分為2組，實驗組15只，空白對照組15只；2組再隨機（隨機數字表法）分為4周組、8周組及12周組，每組5只大鼠。動物倫理符合上海市奉賢區中心醫院倫理委員會的相關規定。
1.2 主要材料與設備
主要材料：環氧樹脂包埋劑（45347，Sigma公司，美國）、甲苯胺藍（ST326001，Sigma公司，美國）、BDNF抗體（ab108319，Abcam公司，美國）、戊二醛（G5882，Sigma公司，美國）、四氧化鋨（75632，Sigma公司，美國）及GTvisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（Gk500711，基因科技有限公司，上海）。設備：纖維喉鏡（BF-1T160，Olympus公司，日本）、光學顯微鏡（E600，Nicon公司，日本）及解剖顯微鏡（SZ51-ILST-SET，Olympus公司，日本）。
1.3 手術
所有大鼠在術前檢查聲帶運動情況，剔除有聲帶運動異常者，本實驗30只大鼠均無聲帶運動異常。將實驗動物采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（40 mg/kg）。麻醉成功后，大鼠取仰臥位，固定四肢，依次備皮、消毒及鋪巾后，取頸前正中垂直切口，切口長約1 cm，分離帶狀肌，于氣管食管溝處暴露右側喉返神經。在右側距喉1 cm處完整切除1段5 mm長的喉返神經，喉返神經斷端局部包埋。徹底止血，檢查器械及紗布無誤后逐層縫合頸部切口。空白對照組僅暴露右側喉返神經，不做截斷處理。術后即刻通過纖維喉鏡檢查確定實驗組的15只大鼠的右側聲帶固定。術后所有大鼠均常規飼養。
1.4 術后檢測指標
1.4.1 術后一般情況觀察
術后觀察大鼠有無發熱、切口感染、死亡等情況發生。
1.4.2 發聲功能評估
空白對照組及實驗組大鼠均在術后第1天、4周、8周及12周時（除術后第1天外，其余時點均檢測5只大鼠發聲功能后處死），在安靜環境下，在6、12及18點3個時刻，針刺大鼠右后肢，使用錄音筆記錄30 s發聲音頻。根據GRBAS標準[15]對聲樣進行分級（參數包括總嘶啞度、粗糙聲、氣息聲、無力聲及緊張聲），各參數均分為如下4級：正常為0級，輕度異常為1級，中度異常為2級，重度異常為3級。由于總嘶啞度分級（G）最為可靠穩定，所以本實驗由兩位研究者對同一聲樣進行各自獨立評估分級，若兩者有異議，則選取第三人評估的分級作為評估結果。
1.4.3 杓狀軟骨運動評估
空白對照組及實驗組大鼠于術后4、8及12周時（每個時點5只大鼠），使用戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg）后，通過纖維喉鏡觀察杓狀軟骨的運動情況。抓取杓狀軟骨開放角度達最大的瞬間圖片，通過Photoshop CC軟件分析測量杓狀軟骨最大開放角度。
1.4.4 喉返神經遠端斷端軸突數目評估
空白對照組及實驗組大鼠于術后4、8及12周時，采用過量戊巴比妥鈉（120 mg/kg）麻醉處死大鼠（每個時點5只大鼠），在右側喉返神經距離入喉5 mm處切取一5 mm長的遠端神經標本。將喉返神經標本放置于2.5%戊二醛溶液中，之后用1%四氧化鋨固定24 h，經梯度丙酮（30%、60%、90%、100%、100%及100%）脫水20 min后用環氧樹脂包埋劑包埋喉返神經標本，待硬化后使用超薄切片機切取橫斷面厚度為1 μm的切片，用1%甲苯胺藍染色。在光學顯微鏡下（100倍）觀察形態并拍照，用Photoshop CC軟件計數軸突數目（1個視野）。
1.4.5 右側甲杓肌中BDNF表達水平的檢測
各時點組大鼠處死時點和方法同1.4.4。處死大鼠后行全喉切除。在解剖顯微鏡下游離甲杓肌后，行組織脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋后切片。抗原修復后滴加BDNF抗體（1 : 75）4 ℃過夜；加入二抗37 ℃孵育后以DAB顯色，以PBS液代替一抗作為陰性對照。通過Image Pro Plus 6.0軟件分析BDNF的表達情況，計算相對光密度值，相對光密度值越大，表達水平越高。
1.5 統計學方法
采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。同時點實驗組和空白對照組的發聲功能分級比較采用成組χ2檢驗，同時點實驗組和空白對照組的杓狀軟骨最大開放角度、喉返神經遠端斷端軸突數目、右側甲杓肌中的BDNF表達水平比較采用成組t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 術后一般情況
30只大鼠術后全部存活，無發熱、切口感染等情況發生。
2.2 發聲功能
各時點針刺空白對照組大鼠后肢后，其叫聲清脆、尖銳，分級均為G0級。實驗組大鼠術后第1天發聲嘶啞、無力，分級均為G3級；術后4周時其聲音嘶啞較前有好轉，分級仍均為G3級；術后8周時其聲音嘶啞有較大改善，聲音低沉，其中1例各時點的分級均為G3級，4例各時點的分級均為G2級；術后12周時聲音較8周時有改善，但是仍舊比較嘶啞，其中4例各時點的分級均為G2級，1例各時點的分級均為G1級。實驗組各時點組大鼠的發生功能均差于空白對照組（P < 0.05）。隨著時間延長，實驗組大鼠的發聲功能逐漸改善，但仍未達到正常水平（表 1）。
表1
實驗組和空白對照組大鼠各時點的聲樣分級結果（例）
2.3 杓狀軟骨最大開放角度
各時點空白對照組大鼠喉鏡下兩側杓狀軟骨運動均對稱（圖 1A）。實驗組大鼠于術后第1天即出現右側聲帶固定（圖 1B）；術后4周時右側杓狀軟骨仍有癱瘓，左右不對稱（圖 1C）；術后8周時杓狀軟骨運動較4周有所恢復（圖 1D）；術后12周時的杓狀軟骨運動較8周時有明顯改善，但仍未達到正常時狀態（圖 1E）。術后4、8及12周時，同時點空白對照組大鼠的杓狀軟骨最大開放角度均高于實驗組（P < 0.05）；隨時間延長，實驗組大鼠的杓狀軟骨最大開放角度逐漸升高，而空白對照組大鼠的杓狀軟骨最大開放角度幾乎無變化。見圖 2。
圖1
示喉鏡下2組大鼠的杓狀軟骨最大開放角度。1A：空白對照組大鼠的杓狀軟骨間夾角左右對稱；1B：實驗組大鼠術后第1天即出現右側聲帶麻痹（白箭）；1C-1E：術后4（1C）、8（1D）及12周（1E）時杓狀軟骨最大開放角度呈增大趨勢，但未達到空白對照組水平??圖 2?示實驗組和空白對照組大鼠各時點的杓狀軟骨最大開放角度。同時點與空白對照組比較，*P < 0.05??圖 3?示實驗組和空白對照組大鼠喉返神經斷端的甲苯胺藍染色結果（甲苯胺藍染色×100）。3A：空白對照組大鼠神經斷端的軸突分布均勻；3B-3D：實驗組大鼠術后4（3B）、8（3C）及12周（3D）時喉返神經斷端軸突分布局部稀疏，軸突直徑差異較大??圖 4?示實驗組和空白對照組大鼠各時點的遠端喉返神經斷端軸突數目。同時點與空白對照組比較，*P < 0.05??圖 5?示實驗組和空白對照組大鼠右側甲杓肌的免疫組化染色圖片（ABC ×400）。5A：空白對照組；5B-5D：術后4（5B）、8（5C）及12周（5D）時，隨著時間延長，棕黃色逐漸加深??圖 6?示實驗組和空白對照組大鼠各時點甲杓肌中BDNF的表達水平。同時點與空白對照組比較，*P < 0.05
2.4 軸突數目分析
2組大鼠的喉返神經遠端斷端經甲苯胺藍染色示，各時點空白對照組大鼠的喉返神經斷端軸突分布均勻（圖 3A）；實驗組大鼠術后4（圖 3B）、8（圖 3C）及12周（圖 3D）時喉返神經斷端軸突分布局部稀疏，軸突直徑差異較大，隨時間延長，軸突形態逐漸規整，數目有所增長。術后4、8及12周時，同時點空白對照組大鼠的喉返神經斷端軸突數目均高于實驗組（P < 0.05）；隨時間延長，實驗組大鼠的喉返神經斷端軸突數目逐漸升高，而空白對照組大鼠的喉返神經斷端軸突數目變化不大。見圖 4。
2.5 右側甲杓肌中BDNF的表達水平
免疫組化染色結果示：BDNF在胞漿中表達，呈現棕黃色顆粒狀。空白對照組大鼠的BDNF顆粒染色較深，呈棕黃色（圖 5A）；實驗組大鼠術后4（圖 5B）、8（圖 5C）及12周（圖 5D）時，隨著時間延長，棕黃色逐漸加深，但仍淺于空白對照組。術后4、8及12周時，同時點空白對照組大鼠的右側甲杓肌中BDNF的表達水平均高于實驗組（P < 0.05）；隨時間延長，實驗組大鼠的右側甲杓肌中BDNF的表達水平逐漸升高，而空白對照組大鼠的右側甲杓肌中BDNF的表達水平變化不大。見圖 6。
3 討論
甲狀腺疾病為普通外科的常見病，而喉返神經損傷是甲狀腺手術中較為嚴重的并發癥之一[16]。由于喉返神經損傷的類型、程度、治療有效性等不同，預后也不盡相同，輕者可以自行恢復，重者聲帶則會永久性麻痹，嚴重影響患者的生存質量[17]。有關喉返神經損傷修復的研究是當前研究的熱點之一，而如何使去神經支配的喉內肌恢復神經化是治療的關鍵，因此明確喉返神經橫斷損傷之后其病理生理變化情況對指導神經修復有重要意義。在本實驗中，筆者研究了Wistar大鼠喉返神經橫斷傷后其發聲功能、杓狀軟骨運動、BDNF在甲杓肌中的表達水平及遠端喉返神經斷端軸突數目變化，結果表明，單側喉返神經損傷后存在局限性自我修復，但是效果不佳。
神經橫斷損傷是神經損傷中較常見的一種類型[18]，神經橫斷損傷屬于神經損傷Sunderland分級中的第五級，涉及到神經主干的損傷[19]。有研究[20]表明，喉返神經損傷后，貓右側喉返神經的自我恢復能力優于左側，為了在短時間內觀察到喉返神經修復情況，筆者在本實驗中建立了右側喉返神經橫斷損傷模型。
肌肉是由神經支配的，肌纖維的成熟、分化以及成熟肌纖維正常的結構和功能的維持均依賴于神經所分泌的神經營養因子，肌纖維去神經支配后因神經營養因子丟失導致肌肉形態結構、生理生化、新陳代謝等方面發生改變[12]。喉返神經損傷后，患側肌肉失去神經支配，出現肌肉體積縮小、肌纖維萎縮等病理改變，失去肌肉主動收縮能力，而未受累喉肌的功能增強，以代償受累喉肌的功能[21-22]。甲杓肌作為喉內肌，在發音和呼吸中均發揮著重要作用。當喉返神經橫斷損傷后，甲杓肌失去支配該肌的神經的營養作用，其結構和功能會發生很大的變化。此外，研究[23-24]證實，麻醉對于聲帶運動的影響可以忽略不計。本實驗結果表明，實驗組大鼠喉返神經橫斷損傷后即刻出現聲帶固定，在12周內通過纖維喉鏡觀察未見聲帶活動完全恢復，但隨時間延長杓狀軟骨最大開放角度逐漸增大，相較損傷早期已有部分功能改善，主觀心理聽覺評估發聲也有明顯改善，這可能主要是由于早期完全去神經支配后，患側聲帶肌缺少神經營養因子的作用而導致萎縮，之后隨著神經的自我恢復，以及健側聲帶由于代償作用而增生，使發聲功能得到較大改善。
神經軸突的數目與神經損傷后修復密切相關[25]。喉返神經橫斷損傷后，神經遠端變性尤為明顯，可能與神經元胞體對神經的營養作用喪失有關。本實驗結果表明，在喉返神經橫斷損傷后4~12周觀察到神經再生，軸突數目隨著時間延長而緩慢增加，但術后12周時神經軸突數目仍未達到空白對照組水平，表明神經橫斷損傷后其自我修復存在一定的局限性。神經的再生不僅依賴于周圍微環境[14]，還與軸突生長、相關基因的上調及與神經生長有關的蛋白質的存在密切相關[26]。喉返神經橫斷損傷后，BDNF的表達水平在4~12周期間呈上升趨勢，其變化特點與神經病理生理功能恢復趨勢基本一致，表明BDNF的表達水平與神經修復過程密切相關，因此筆者猜測應用外源性神經營養因子有可能促進神經修復進程。
綜上所述，本研究表明，大鼠單側喉返神經完全損傷后有局限的自我修復能力，其神經所支配的生理功能有一定的改善，且BDNF的表達水平與神經修復過程息息相關。但本研究存在一定的局限性，如動物樣本量小、術后觀測時間較短等；且由于種屬存在差異，Wistar大鼠也不可能完全模擬人類疾病的發生發展過程。此外，本實驗只測定了1種神經營養因子的表達水平，但可能有多種神經營養因子參與神經再生過程，這要進一步的定量分析來確定實驗結果，如Western blot檢測、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）實驗等。本實驗結果對臨床治療喉返神經損傷提供了客觀實驗依據，但仍需進一步研究。
喉返神經支配除環甲肌之外的喉內肌[1]，其損傷是甲狀腺手術等頸部手術的常見并發癥[2]。由喉返神經損傷引起的聲帶麻痹嚴重影響患者的生活質量[3-4]。臨床上對單側聲帶麻痹常通過手術治療[5]，雖然取得了一定的臨床效果，但術后神經功能的恢復卻不完全[6]。神經營養因子具有減少神經變性、刺激軸突生長及促進神經再生的功能[7-9]。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在維持神經細胞的存活、增殖、生長、分化及遷移方面均有重要作用[10-11]。目前，雖然有學者[12-14]做了部分基礎研究，但是關于患者喉返神經橫斷傷后神經和喉內肌變化的研究仍較少。筆者建立了大鼠喉返神經橫斷傷模型，通過研究神經和喉內肌的變化特征，探索了該種損傷的自愈能力，為研究喉返神經損傷修復做鋪墊。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
健康成年雄性清潔級Wistar大鼠30只（體質量340~360 g，12周齡），來源于上海市奉賢區中心醫院動物房（批號：2008001642157）。隨機（隨機數字表法）將大鼠分為2組，實驗組15只，空白對照組15只；2組再隨機（隨機數字表法）分為4周組、8周組及12周組，每組5只大鼠。動物倫理符合上海市奉賢區中心醫院倫理委員會的相關規定。
1.2 主要材料與設備
主要材料：環氧樹脂包埋劑（45347，Sigma公司，美國）、甲苯胺藍（ST326001，Sigma公司，美國）、BDNF抗體（ab108319，Abcam公司，美國）、戊二醛（G5882，Sigma公司，美國）、四氧化鋨（75632，Sigma公司，美國）及GTvisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（Gk500711，基因科技有限公司，上海）。設備：纖維喉鏡（BF-1T160，Olympus公司，日本）、光學顯微鏡（E600，Nicon公司，日本）及解剖顯微鏡（SZ51-ILST-SET，Olympus公司，日本）。
1.3 手術
所有大鼠在術前檢查聲帶運動情況，剔除有聲帶運動異常者，本實驗30只大鼠均無聲帶運動異常。將實驗動物采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（40 mg/kg）。麻醉成功后，大鼠取仰臥位，固定四肢，依次備皮、消毒及鋪巾后，取頸前正中垂直切口，切口長約1 cm，分離帶狀肌，于氣管食管溝處暴露右側喉返神經。在右側距喉1 cm處完整切除1段5 mm長的喉返神經，喉返神經斷端局部包埋。徹底止血，檢查器械及紗布無誤后逐層縫合頸部切口。空白對照組僅暴露右側喉返神經，不做截斷處理。術后即刻通過纖維喉鏡檢查確定實驗組的15只大鼠的右側聲帶固定。術后所有大鼠均常規飼養。
1.4 術后檢測指標
1.4.1 術后一般情況觀察
術后觀察大鼠有無發熱、切口感染、死亡等情況發生。
1.4.2 發聲功能評估
空白對照組及實驗組大鼠均在術后第1天、4周、8周及12周時（除術后第1天外，其余時點均檢測5只大鼠發聲功能后處死），在安靜環境下，在6、12及18點3個時刻，針刺大鼠右后肢，使用錄音筆記錄30 s發聲音頻。根據GRBAS標準[15]對聲樣進行分級（參數包括總嘶啞度、粗糙聲、氣息聲、無力聲及緊張聲），各參數均分為如下4級：正常為0級，輕度異常為1級，中度異常為2級，重度異常為3級。由于總嘶啞度分級（G）最為可靠穩定，所以本實驗由兩位研究者對同一聲樣進行各自獨立評估分級，若兩者有異議，則選取第三人評估的分級作為評估結果。
1.4.3 杓狀軟骨運動評估
空白對照組及實驗組大鼠于術后4、8及12周時（每個時點5只大鼠），使用戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg）后，通過纖維喉鏡觀察杓狀軟骨的運動情況。抓取杓狀軟骨開放角度達最大的瞬間圖片，通過Photoshop CC軟件分析測量杓狀軟骨最大開放角度。
1.4.4 喉返神經遠端斷端軸突數目評估
空白對照組及實驗組大鼠于術后4、8及12周時，采用過量戊巴比妥鈉（120 mg/kg）麻醉處死大鼠（每個時點5只大鼠），在右側喉返神經距離入喉5 mm處切取一5 mm長的遠端神經標本。將喉返神經標本放置于2.5%戊二醛溶液中，之后用1%四氧化鋨固定24 h，經梯度丙酮（30%、60%、90%、100%、100%及100%）脫水20 min后用環氧樹脂包埋劑包埋喉返神經標本，待硬化后使用超薄切片機切取橫斷面厚度為1 μm的切片，用1%甲苯胺藍染色。在光學顯微鏡下（100倍）觀察形態并拍照，用Photoshop CC軟件計數軸突數目（1個視野）。
1.4.5 右側甲杓肌中BDNF表達水平的檢測
各時點組大鼠處死時點和方法同1.4.4。處死大鼠后行全喉切除。在解剖顯微鏡下游離甲杓肌后，行組織脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋后切片。抗原修復后滴加BDNF抗體（1 : 75）4 ℃過夜；加入二抗37 ℃孵育后以DAB顯色，以PBS液代替一抗作為陰性對照。通過Image Pro Plus 6.0軟件分析BDNF的表達情況，計算相對光密度值，相對光密度值越大，表達水平越高。
1.5 統計學方法
采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。同時點實驗組和空白對照組的發聲功能分級比較采用成組χ2檢驗，同時點實驗組和空白對照組的杓狀軟骨最大開放角度、喉返神經遠端斷端軸突數目、右側甲杓肌中的BDNF表達水平比較采用成組t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 術后一般情況
30只大鼠術后全部存活，無發熱、切口感染等情況發生。
2.2 發聲功能
各時點針刺空白對照組大鼠后肢后，其叫聲清脆、尖銳，分級均為G0級。實驗組大鼠術后第1天發聲嘶啞、無力，分級均為G3級；術后4周時其聲音嘶啞較前有好轉，分級仍均為G3級；術后8周時其聲音嘶啞有較大改善，聲音低沉，其中1例各時點的分級均為G3級，4例各時點的分級均為G2級；術后12周時聲音較8周時有改善，但是仍舊比較嘶啞，其中4例各時點的分級均為G2級，1例各時點的分級均為G1級。實驗組各時點組大鼠的發生功能均差于空白對照組（P < 0.05）。隨著時間延長，實驗組大鼠的發聲功能逐漸改善，但仍未達到正常水平（表 1）。
表1
實驗組和空白對照組大鼠各時點的聲樣分級結果（例）
2.3 杓狀軟骨最大開放角度
各時點空白對照組大鼠喉鏡下兩側杓狀軟骨運動均對稱（圖 1A）。實驗組大鼠于術后第1天即出現右側聲帶固定（圖 1B）；術后4周時右側杓狀軟骨仍有癱瘓，左右不對稱（圖 1C）；術后8周時杓狀軟骨運動較4周有所恢復（圖 1D）；術后12周時的杓狀軟骨運動較8周時有明顯改善，但仍未達到正常時狀態（圖 1E）。術后4、8及12周時，同時點空白對照組大鼠的杓狀軟骨最大開放角度均高于實驗組（P < 0.05）；隨時間延長，實驗組大鼠的杓狀軟骨最大開放角度逐漸升高，而空白對照組大鼠的杓狀軟骨最大開放角度幾乎無變化。見圖 2。
圖1
示喉鏡下2組大鼠的杓狀軟骨最大開放角度。1A：空白對照組大鼠的杓狀軟骨間夾角左右對稱；1B：實驗組大鼠術后第1天即出現右側聲帶麻痹（白箭）；1C-1E：術后4（1C）、8（1D）及12周（1E）時杓狀軟骨最大開放角度呈增大趨勢，但未達到空白對照組水平??圖 2?示實驗組和空白對照組大鼠各時點的杓狀軟骨最大開放角度。同時點與空白對照組比較，*P < 0.05??圖 3?示實驗組和空白對照組大鼠喉返神經斷端的甲苯胺藍染色結果（甲苯胺藍染色×100）。3A：空白對照組大鼠神經斷端的軸突分布均勻；3B-3D：實驗組大鼠術后4（3B）、8（3C）及12周（3D）時喉返神經斷端軸突分布局部稀疏，軸突直徑差異較大??圖 4?示實驗組和空白對照組大鼠各時點的遠端喉返神經斷端軸突數目。同時點與空白對照組比較，*P < 0.05??圖 5?示實驗組和空白對照組大鼠右側甲杓肌的免疫組化染色圖片（ABC ×400）。5A：空白對照組；5B-5D：術后4（5B）、8（5C）及12周（5D）時，隨著時間延長，棕黃色逐漸加深??圖 6?示實驗組和空白對照組大鼠各時點甲杓肌中BDNF的表達水平。同時點與空白對照組比較，*P < 0.05
2.4 軸突數目分析
2組大鼠的喉返神經遠端斷端經甲苯胺藍染色示，各時點空白對照組大鼠的喉返神經斷端軸突分布均勻（圖 3A）；實驗組大鼠術后4（圖 3B）、8（圖 3C）及12周（圖 3D）時喉返神經斷端軸突分布局部稀疏，軸突直徑差異較大，隨時間延長，軸突形態逐漸規整，數目有所增長。術后4、8及12周時，同時點空白對照組大鼠的喉返神經斷端軸突數目均高于實驗組（P < 0.05）；隨時間延長，實驗組大鼠的喉返神經斷端軸突數目逐漸升高，而空白對照組大鼠的喉返神經斷端軸突數目變化不大。見圖 4。
2.5 右側甲杓肌中BDNF的表達水平
免疫組化染色結果示：BDNF在胞漿中表達，呈現棕黃色顆粒狀。空白對照組大鼠的BDNF顆粒染色較深，呈棕黃色（圖 5A）；實驗組大鼠術后4（圖 5B）、8（圖 5C）及12周（圖 5D）時，隨著時間延長，棕黃色逐漸加深，但仍淺于空白對照組。術后4、8及12周時，同時點空白對照組大鼠的右側甲杓肌中BDNF的表達水平均高于實驗組（P < 0.05）；隨時間延長，實驗組大鼠的右側甲杓肌中BDNF的表達水平逐漸升高，而空白對照組大鼠的右側甲杓肌中BDNF的表達水平變化不大。見圖 6。
3 討論
甲狀腺疾病為普通外科的常見病，而喉返神經損傷是甲狀腺手術中較為嚴重的并發癥之一[16]。由于喉返神經損傷的類型、程度、治療有效性等不同，預后也不盡相同，輕者可以自行恢復，重者聲帶則會永久性麻痹，嚴重影響患者的生存質量[17]。有關喉返神經損傷修復的研究是當前研究的熱點之一，而如何使去神經支配的喉內肌恢復神經化是治療的關鍵，因此明確喉返神經橫斷損傷之后其病理生理變化情況對指導神經修復有重要意義。在本實驗中，筆者研究了Wistar大鼠喉返神經橫斷傷后其發聲功能、杓狀軟骨運動、BDNF在甲杓肌中的表達水平及遠端喉返神經斷端軸突數目變化，結果表明，單側喉返神經損傷后存在局限性自我修復，但是效果不佳。
神經橫斷損傷是神經損傷中較常見的一種類型[18]，神經橫斷損傷屬于神經損傷Sunderland分級中的第五級，涉及到神經主干的損傷[19]。有研究[20]表明，喉返神經損傷后，貓右側喉返神經的自我恢復能力優于左側，為了在短時間內觀察到喉返神經修復情況，筆者在本實驗中建立了右側喉返神經橫斷損傷模型。
肌肉是由神經支配的，肌纖維的成熟、分化以及成熟肌纖維正常的結構和功能的維持均依賴于神經所分泌的神經營養因子，肌纖維去神經支配后因神經營養因子丟失導致肌肉形態結構、生理生化、新陳代謝等方面發生改變[12]。喉返神經損傷后，患側肌肉失去神經支配，出現肌肉體積縮小、肌纖維萎縮等病理改變，失去肌肉主動收縮能力，而未受累喉肌的功能增強，以代償受累喉肌的功能[21-22]。甲杓肌作為喉內肌，在發音和呼吸中均發揮著重要作用。當喉返神經橫斷損傷后，甲杓肌失去支配該肌的神經的營養作用，其結構和功能會發生很大的變化。此外，研究[23-24]證實，麻醉對于聲帶運動的影響可以忽略不計。本實驗結果表明，實驗組大鼠喉返神經橫斷損傷后即刻出現聲帶固定，在12周內通過纖維喉鏡觀察未見聲帶活動完全恢復，但隨時間延長杓狀軟骨最大開放角度逐漸增大，相較損傷早期已有部分功能改善，主觀心理聽覺評估發聲也有明顯改善，這可能主要是由于早期完全去神經支配后，患側聲帶肌缺少神經營養因子的作用而導致萎縮，之后隨著神經的自我恢復，以及健側聲帶由于代償作用而增生，使發聲功能得到較大改善。
神經軸突的數目與神經損傷后修復密切相關[25]。喉返神經橫斷損傷后，神經遠端變性尤為明顯，可能與神經元胞體對神經的營養作用喪失有關。本實驗結果表明，在喉返神經橫斷損傷后4~12周觀察到神經再生，軸突數目隨著時間延長而緩慢增加，但術后12周時神經軸突數目仍未達到空白對照組水平，表明神經橫斷損傷后其自我修復存在一定的局限性。神經的再生不僅依賴于周圍微環境[14]，還與軸突生長、相關基因的上調及與神經生長有關的蛋白質的存在密切相關[26]。喉返神經橫斷損傷后，BDNF的表達水平在4~12周期間呈上升趨勢，其變化特點與神經病理生理功能恢復趨勢基本一致，表明BDNF的表達水平與神經修復過程密切相關，因此筆者猜測應用外源性神經營養因子有可能促進神經修復進程。
綜上所述，本研究表明，大鼠單側喉返神經完全損傷后有局限的自我修復能力，其神經所支配的生理功能有一定的改善，且BDNF的表達水平與神經修復過程息息相關。但本研究存在一定的局限性，如動物樣本量小、術后觀測時間較短等；且由于種屬存在差異，Wistar大鼠也不可能完全模擬人類疾病的發生發展過程。此外，本實驗只測定了1種神經營養因子的表達水平，但可能有多種神經營養因子參與神經再生過程，這要進一步的定量分析來確定實驗結果，如Western blot檢測、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）實驗等。本實驗結果對臨床治療喉返神經損傷提供了客觀實驗依據，但仍需進一步研究。
