引用本文： 尹彥斌, 王躍生, 張立海, 蘇德望. T2DM大鼠行Roux-en-Y胃旁路術后血清Ghrelin和Visfatin水平的變化及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(12): 1432-1436. doi: 10.7507/1007-9424.20160365 復制
Roux-en-Y胃旁路術（Roux-en-Y gastric bypass surgery，RYGB）作為一種新的治療糖尿病的方法，已得到了醫學界廣泛的認同[1-2]。目前已明確，生長激素釋放肽（Ghrelin）、內脂素（Visfatin）與2型糖尿病（T2DM）之間有著明確的聯系，但其在RYGB后的具體作用機理尚不明確。本實驗基于以上背景，觀察了RYGB前后Ghrelin和Visfatin水平的變化情況，以探究Ghrelin和Visfatin在RYGB后血糖降低中的作用機制及意義。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料和試劑
30只SD健康雄性大鼠，8周齡，體質量240~310 g，購自哈爾濱醫科大學動物實驗室；高脂高糖飼料（5%蔗糖+10%豬油+1.5%膽固醇+0.25%膽酸鈉+83.25%基礎飼料）和大鼠清潔級飼料均購自江蘇省協同醫藥生物工程有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自美國Sigma公司；Ghrelin酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自研域（上海）化學試劑有限公司，Visfatin ELISA試劑盒（1217）購自上海拜力生物技術有限公司。血糖儀及血糖試紙均購自三諾生物技術傳感股份有限公司，Biotek多功能酶標儀系美國Biotek公司產品。
1.2 方法
1.2.1 T2DM大鼠模型的建立
將30只SD大鼠隨機（隨機數字表法）分為糖尿病組22只和空白對照組（CSO組）8只。糖尿病組大鼠給予高脂高糖飲食6周后，再小劑量腹腔注射STZ（35 mg/kg）；3 d后測定血清空腹血糖（FBG），未建模成功者給予半劑量追加給藥。以隨機血糖 > 16.7 mmol/L為T2DM造模成功標準[3]。結果建模成功18只，4只未建模成功。
1.2.2 手術
建模成功后，將18只T2DM大鼠隨機（隨機數字表法）分為RYGB組10只和假手術組（DSO組）8只。術前3組大鼠均采血測定血清FBG、空腹胰島素（FINS）、Ghrelin及Visfatin水平。所有大鼠于術前禁食12 h，給予10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定于解剖臺上。RYGB組：取腹部正中切口約4 cm長，首先分離胃體部，用絲線縫合胃遠端及近端胃小彎側，將胃分出1個袋狀小胃，然后于十二指腸懸韌帶下10 cm處離斷空腸袢，將遠端空腸與近端大彎側吻合；將近端空腸吻合于距胃空腸吻合口遠端10 cm處空腸，完成RYGB。DSO組和CSO組大鼠均行空腸離斷原位吻合術，術前準備、麻醉方式及手術時間均與RYGB組大鼠相似。手術后所有大鼠置于相同環境下，行抗炎治療1周，且術后均給予清潔級飼料。
1.2.3 標本采集
于術前和術后4周，采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉大鼠，麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定于解剖板上，心臟采血約5 mL，靜置2 h后離心（4 000 r/min，r=10 cm，15 min），取上層血清，-80 ℃下保存，待用。
1.2.4 指標測定及方法
采用放射免疫法測定FINS水平，采用快速血糖儀測定FBG水平，采用ELISA法測定空腹血清Visfatin和Ghrelin水平，操作均按說明書進行。于術前和術后4周準確稱量大鼠體質量，測量鼻肛身長，計算肥胖指數：肥胖指數=；按照公式計算胰島素敏感指數（ISI）：ISI=Ln〔1/（FINS×FBG）〕。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）或中位數（M）表示，組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用LSD法）或成組設計兩樣本比較的秩和檢驗；組內比較采用配對t檢驗；相關性分析采用Pearson簡單相關分析。檢驗水準α=0.050。
2 結果
2.1 術后4周3組大鼠的基本情況比較
本實驗期間無大鼠死亡。建模成功后18只T2DM大鼠逐漸出現糖尿病的多飲、多食及多尿癥狀。相較于術前，RYGB組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平及FINS水平均降低（P < 0.050），ISI值升高（P < 0.001），但手術前后的體長比較差異無統計學意義（P=0.704）；DSO組和CSO組大鼠手術前后的體質量、體長、肥胖指數、FBG水平、FINS水平及ISI值比較差異均無統計學意義（P > 0.050），見表 1。
表1
術后4周3組大鼠的基本情況比較（x±s）
術前除了體長外（P=0.050），RYGB組和DSO組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平及FINS水平均高于CSO組，而ISI值低于CSO組，差異均有統計學意義（P < 0.050），但RYGB組和DSO組的上述指標比較差異均無統計學意義（P > 0.050）。術后4周時，除了體長外（P=0.110），RYGB組、DSO組和CSO組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平、FINS水平及ISI值比較差異均有統計學意義（P < 0.050），DSO組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平和FINS水平均高于RYGB組和CSO組相應指標（P < 0.050），而ISI值卻低于RYGB組和CSO組（P < 0.050）；術后4周RYGB組和CSO組大鼠的上述各指標比較差異均無統計學意義（P > 0.050），見表 1。該結果提示RYGB的降糖效果明顯，減肥作用顯著。
2.2 3組大鼠手術前后的血清Ghrelin和Visfatin水平比較
與術前比較，RYGB組大鼠的Ghrelin水平升高，而Visfatin水平降低，差異均有統計學意義（P < 0.050），但DSO組和CSO組大鼠手術前后的Ghrelin和Visfatin水平比較差異均無統計學意義（P > 0.050）。3組大鼠手術前后的Ghrelin和Visfatin水平的差值比較差異均有統計學意義（P < 0.001），RYGB組的Ghrelin、Visfatin水平的差值較DSO組和CSO組大（P < 0.050），但DSO和CSO組比較差異均無統計學意義（P > 0.050）。見表 2。
表2
3組大鼠手術前后的Ghrelin和Visfatin水平比較
2.3 Ghrelin水平與ISI值、Visfatin水平與肥胖指數的相關性分析
術后4周時RYGB組大鼠的Ghrelin水平與ISI值呈正相關（r=0.771，P=0.003），Visfatin水平與肥胖指數呈負相關（r=-0.746，P=0.005），見圖 1和圖 2。
圖1
示Ghrelin水平與ISI值關系的散點圖??圖 2?示Visfatin水平與肥胖指數關系的散點圖
3 討論
中國人群糖尿病的發病率呈逐年增高趨勢，并且日趨年輕化，據統計有80%的糖尿病患者伴有肥胖癥[4]。在肥胖型糖尿病前期，若能控制體質量，可降低糖尿病發生風險或延緩其進展，甚至扭轉糖尿病發展的進程。在過去幾十年里，減肥手術治療肥胖癥已被廣泛接受，該手術同時對糖尿病的治療效果亦非常顯著，甚至能夠治愈，這其中RYGB的作用效果最為顯著且最為安全[5-7]。RYGB治療T2DM的作用機理尚未完全闡明，但腸-胰島軸學說已得到多數學者的認同[8]。
通過高脂高糖飲食聯合注射小劑量STZ造模成功的糖尿病大鼠模型具有高血糖、高血脂、高胰島素水平等典型肥胖型糖尿病特征。在本實驗中，22只大鼠經過長時間的高脂高糖飲食，有18只建模成功，且建模成功的18只大鼠逐漸出現多飲、多尿及多食癥狀。術后第4周檢測發現，DSO組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平和FINS水平均高于RYGB組和CSO組相應指標（P < 0.050），而ISI值卻低于RYGB組和CSO組（P < 0.050）；RYGB組和CSO組大鼠的上述各指標比較差異均無統計學意義（P > 0.050）。該實驗結果顯示，RYGB在治療肥胖型T2DM上具有良好的降糖效果和減肥作用，此外，還能很好地改善T2DM大鼠的ISI和肥胖指數，可見改善血糖代謝和脂代謝是RYGB治療T2DM的兩個重要機理[9]。而血糖代謝異常和脂代謝異常是導致T2DM的重要機制，并且二者具有協同作用[10-13]。
Ghrelin與Visfatin是分別反映血糖代謝和脂代謝的重要因子。Ghrelin是Kojima等[14]發現的一種生長激素促泌素受體的內源性配體，是由胃黏膜下層的X/A樣細胞合成和分泌的小分子腦腸肽。研究[15-16]表明，Ghrelin能夠調節食物攝入、體質量和葡萄糖代謝，是T2DM發生的影響因素，并且影響糖尿病以及肥胖癥的發病和病情進展。近期研究[17]表明，Ghrelin與肥胖程度密切相關。RYGB改變了消化道的生理結構后，胃排空加快，使攝入的營養物質提前與低位小腸接觸，導致Ghrelin分泌增加，刺激小腸上的L細胞分泌胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）。Ghrelin分泌的增加同時能抑制胰島素釋放肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）的分泌，該因子亦能通過下丘腦增加胰島素分泌、胰島素敏感性而改善血糖的代謝[18-19]。另外Ghrelin分泌的增加還會導致食欲降低，進食隨之減少，遂能夠達到長期控制體質量的效果[20-23]。Visfatin是新發現的由內臟脂肪細胞分泌的一種脂肪細胞因子，可結合并激活胰島素受體的非胰島素結合部位，激活胰島素受體信號通路，從而模擬胰島素作用，降低機體血糖。Visfatin與T2DM的發生密切相關，有促進脂肪組織分化、脂肪合成和積累的作用；其還能通過激活胰島素受體信號通路，從而模擬胰島素作用，降低血糖水平，并且能夠結合并激活胰島素受體，模擬胰島素的作用。研究[24-26]顯示，T2DM患者的血清Visfatin水平明顯高于非糖尿病人群，且血清Visfatin水平與FBG水平呈正相關，是T2DM發生的危險因素。在將編碼Visfatin基因的質粒轉染到小鼠體內后，小鼠血糖和胰島素水平均顯著下降；而在敲除Visfatin基因的小鼠體內發現，血清Visfatin水平下降，血糖濃度水平升高[27-28]。本實驗結果顯示，RYGB組的Ghrelin水平在術后4周時，與術前相比有明顯升高，并與ISI值呈正相關（r=0.771，P=0.003）；RYGB組的Visfatin水平在術后4周時，與術前相比較含量明顯下降，并與肥胖指數呈負相關（r=-0.746，P=0.005）。
胃轉流手術改變了消化道的正常生理結構，使進入胃部的食物排空加快，從而促進Ghrelin的分泌，Ghrelin分泌的增加最終促使胰島素分泌，起到降低血糖的作用；同時手術使Visfatin水平得以恢復至正常，使脂肪積聚受到抑制，從而起到減肥作用。本實驗結果提示，Ghrelin與Visfatin在RYGB治療肥胖和T2DM的過程中，具有不可或缺的作用，為未來的新藥開發提供了一定的理論基礎。Ghrelin類似物或Visfatin拮抗劑的合成，以及兩者的配合使用，將會是治療T2DM患者的一項重要方法。
Roux-en-Y胃旁路術（Roux-en-Y gastric bypass surgery，RYGB）作為一種新的治療糖尿病的方法，已得到了醫學界廣泛的認同[1-2]。目前已明確，生長激素釋放肽（Ghrelin）、內脂素（Visfatin）與2型糖尿病（T2DM）之間有著明確的聯系，但其在RYGB后的具體作用機理尚不明確。本實驗基于以上背景，觀察了RYGB前后Ghrelin和Visfatin水平的變化情況，以探究Ghrelin和Visfatin在RYGB后血糖降低中的作用機制及意義。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料和試劑
30只SD健康雄性大鼠，8周齡，體質量240~310 g，購自哈爾濱醫科大學動物實驗室；高脂高糖飼料（5%蔗糖+10%豬油+1.5%膽固醇+0.25%膽酸鈉+83.25%基礎飼料）和大鼠清潔級飼料均購自江蘇省協同醫藥生物工程有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自美國Sigma公司；Ghrelin酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自研域（上海）化學試劑有限公司，Visfatin ELISA試劑盒（1217）購自上海拜力生物技術有限公司。血糖儀及血糖試紙均購自三諾生物技術傳感股份有限公司，Biotek多功能酶標儀系美國Biotek公司產品。
1.2 方法
1.2.1 T2DM大鼠模型的建立
將30只SD大鼠隨機（隨機數字表法）分為糖尿病組22只和空白對照組（CSO組）8只。糖尿病組大鼠給予高脂高糖飲食6周后，再小劑量腹腔注射STZ（35 mg/kg）；3 d后測定血清空腹血糖（FBG），未建模成功者給予半劑量追加給藥。以隨機血糖 > 16.7 mmol/L為T2DM造模成功標準[3]。結果建模成功18只，4只未建模成功。
1.2.2 手術
建模成功后，將18只T2DM大鼠隨機（隨機數字表法）分為RYGB組10只和假手術組（DSO組）8只。術前3組大鼠均采血測定血清FBG、空腹胰島素（FINS）、Ghrelin及Visfatin水平。所有大鼠于術前禁食12 h，給予10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定于解剖臺上。RYGB組：取腹部正中切口約4 cm長，首先分離胃體部，用絲線縫合胃遠端及近端胃小彎側，將胃分出1個袋狀小胃，然后于十二指腸懸韌帶下10 cm處離斷空腸袢，將遠端空腸與近端大彎側吻合；將近端空腸吻合于距胃空腸吻合口遠端10 cm處空腸，完成RYGB。DSO組和CSO組大鼠均行空腸離斷原位吻合術，術前準備、麻醉方式及手術時間均與RYGB組大鼠相似。手術后所有大鼠置于相同環境下，行抗炎治療1周，且術后均給予清潔級飼料。
1.2.3 標本采集
于術前和術后4周，采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉大鼠，麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定于解剖板上，心臟采血約5 mL，靜置2 h后離心（4 000 r/min，r=10 cm，15 min），取上層血清，-80 ℃下保存，待用。
1.2.4 指標測定及方法
采用放射免疫法測定FINS水平，采用快速血糖儀測定FBG水平，采用ELISA法測定空腹血清Visfatin和Ghrelin水平，操作均按說明書進行。于術前和術后4周準確稱量大鼠體質量，測量鼻肛身長，計算肥胖指數：肥胖指數=；按照公式計算胰島素敏感指數（ISI）：ISI=Ln〔1/（FINS×FBG）〕。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）或中位數（M）表示，組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用LSD法）或成組設計兩樣本比較的秩和檢驗；組內比較采用配對t檢驗；相關性分析采用Pearson簡單相關分析。檢驗水準α=0.050。
2 結果
2.1 術后4周3組大鼠的基本情況比較
本實驗期間無大鼠死亡。建模成功后18只T2DM大鼠逐漸出現糖尿病的多飲、多食及多尿癥狀。相較于術前，RYGB組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平及FINS水平均降低（P < 0.050），ISI值升高（P < 0.001），但手術前后的體長比較差異無統計學意義（P=0.704）；DSO組和CSO組大鼠手術前后的體質量、體長、肥胖指數、FBG水平、FINS水平及ISI值比較差異均無統計學意義（P > 0.050），見表 1。
表1
術后4周3組大鼠的基本情況比較（x±s）
術前除了體長外（P=0.050），RYGB組和DSO組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平及FINS水平均高于CSO組，而ISI值低于CSO組，差異均有統計學意義（P < 0.050），但RYGB組和DSO組的上述指標比較差異均無統計學意義（P > 0.050）。術后4周時，除了體長外（P=0.110），RYGB組、DSO組和CSO組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平、FINS水平及ISI值比較差異均有統計學意義（P < 0.050），DSO組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平和FINS水平均高于RYGB組和CSO組相應指標（P < 0.050），而ISI值卻低于RYGB組和CSO組（P < 0.050）；術后4周RYGB組和CSO組大鼠的上述各指標比較差異均無統計學意義（P > 0.050），見表 1。該結果提示RYGB的降糖效果明顯，減肥作用顯著。
2.2 3組大鼠手術前后的血清Ghrelin和Visfatin水平比較
與術前比較，RYGB組大鼠的Ghrelin水平升高，而Visfatin水平降低，差異均有統計學意義（P < 0.050），但DSO組和CSO組大鼠手術前后的Ghrelin和Visfatin水平比較差異均無統計學意義（P > 0.050）。3組大鼠手術前后的Ghrelin和Visfatin水平的差值比較差異均有統計學意義（P < 0.001），RYGB組的Ghrelin、Visfatin水平的差值較DSO組和CSO組大（P < 0.050），但DSO和CSO組比較差異均無統計學意義（P > 0.050）。見表 2。
表2
3組大鼠手術前后的Ghrelin和Visfatin水平比較
2.3 Ghrelin水平與ISI值、Visfatin水平與肥胖指數的相關性分析
術后4周時RYGB組大鼠的Ghrelin水平與ISI值呈正相關（r=0.771，P=0.003），Visfatin水平與肥胖指數呈負相關（r=-0.746，P=0.005），見圖 1和圖 2。
圖1
示Ghrelin水平與ISI值關系的散點圖??圖 2?示Visfatin水平與肥胖指數關系的散點圖
3 討論
中國人群糖尿病的發病率呈逐年增高趨勢，并且日趨年輕化，據統計有80%的糖尿病患者伴有肥胖癥[4]。在肥胖型糖尿病前期，若能控制體質量，可降低糖尿病發生風險或延緩其進展，甚至扭轉糖尿病發展的進程。在過去幾十年里，減肥手術治療肥胖癥已被廣泛接受，該手術同時對糖尿病的治療效果亦非常顯著，甚至能夠治愈，這其中RYGB的作用效果最為顯著且最為安全[5-7]。RYGB治療T2DM的作用機理尚未完全闡明，但腸-胰島軸學說已得到多數學者的認同[8]。
通過高脂高糖飲食聯合注射小劑量STZ造模成功的糖尿病大鼠模型具有高血糖、高血脂、高胰島素水平等典型肥胖型糖尿病特征。在本實驗中，22只大鼠經過長時間的高脂高糖飲食，有18只建模成功，且建模成功的18只大鼠逐漸出現多飲、多尿及多食癥狀。術后第4周檢測發現，DSO組大鼠的體質量、肥胖指數、FBG水平和FINS水平均高于RYGB組和CSO組相應指標（P < 0.050），而ISI值卻低于RYGB組和CSO組（P < 0.050）；RYGB組和CSO組大鼠的上述各指標比較差異均無統計學意義（P > 0.050）。該實驗結果顯示，RYGB在治療肥胖型T2DM上具有良好的降糖效果和減肥作用，此外，還能很好地改善T2DM大鼠的ISI和肥胖指數，可見改善血糖代謝和脂代謝是RYGB治療T2DM的兩個重要機理[9]。而血糖代謝異常和脂代謝異常是導致T2DM的重要機制，并且二者具有協同作用[10-13]。
Ghrelin與Visfatin是分別反映血糖代謝和脂代謝的重要因子。Ghrelin是Kojima等[14]發現的一種生長激素促泌素受體的內源性配體，是由胃黏膜下層的X/A樣細胞合成和分泌的小分子腦腸肽。研究[15-16]表明，Ghrelin能夠調節食物攝入、體質量和葡萄糖代謝，是T2DM發生的影響因素，并且影響糖尿病以及肥胖癥的發病和病情進展。近期研究[17]表明，Ghrelin與肥胖程度密切相關。RYGB改變了消化道的生理結構后，胃排空加快，使攝入的營養物質提前與低位小腸接觸，導致Ghrelin分泌增加，刺激小腸上的L細胞分泌胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）。Ghrelin分泌的增加同時能抑制胰島素釋放肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）的分泌，該因子亦能通過下丘腦增加胰島素分泌、胰島素敏感性而改善血糖的代謝[18-19]。另外Ghrelin分泌的增加還會導致食欲降低，進食隨之減少，遂能夠達到長期控制體質量的效果[20-23]。Visfatin是新發現的由內臟脂肪細胞分泌的一種脂肪細胞因子，可結合并激活胰島素受體的非胰島素結合部位，激活胰島素受體信號通路，從而模擬胰島素作用，降低機體血糖。Visfatin與T2DM的發生密切相關，有促進脂肪組織分化、脂肪合成和積累的作用；其還能通過激活胰島素受體信號通路，從而模擬胰島素作用，降低血糖水平，并且能夠結合并激活胰島素受體，模擬胰島素的作用。研究[24-26]顯示，T2DM患者的血清Visfatin水平明顯高于非糖尿病人群，且血清Visfatin水平與FBG水平呈正相關，是T2DM發生的危險因素。在將編碼Visfatin基因的質粒轉染到小鼠體內后，小鼠血糖和胰島素水平均顯著下降；而在敲除Visfatin基因的小鼠體內發現，血清Visfatin水平下降，血糖濃度水平升高[27-28]。本實驗結果顯示，RYGB組的Ghrelin水平在術后4周時，與術前相比有明顯升高，并與ISI值呈正相關（r=0.771，P=0.003）；RYGB組的Visfatin水平在術后4周時，與術前相比較含量明顯下降，并與肥胖指數呈負相關（r=-0.746，P=0.005）。
胃轉流手術改變了消化道的正常生理結構，使進入胃部的食物排空加快，從而促進Ghrelin的分泌，Ghrelin分泌的增加最終促使胰島素分泌，起到降低血糖的作用；同時手術使Visfatin水平得以恢復至正常，使脂肪積聚受到抑制，從而起到減肥作用。本實驗結果提示，Ghrelin與Visfatin在RYGB治療肥胖和T2DM的過程中，具有不可或缺的作用，為未來的新藥開發提供了一定的理論基礎。Ghrelin類似物或Visfatin拮抗劑的合成，以及兩者的配合使用，將會是治療T2DM患者的一項重要方法。
