引用本文： 劉磊, 姚柏宇, 田忠. 胰島素樣生長因子-Ⅰ在肥胖大鼠行Roux-en-Y胃旁路術后脂肪組織中的表達變化及其作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(12): 1424-1431. doi: 10.7507/1007-9424.20160364 復制
肥胖是一個日益嚴重的全球公共衛生問題，它的發生往往伴隨2型糖尿病、心血管疾病、血脂異常血癥、睡眠呼吸暫停、腫瘤等能嚴重影響人們生活質量的疾病，這些臨床表現即是代謝綜合征的特征性表現。因此，肥胖是一種營養代謝綜合征，它是受遺傳因素與環境因素共同影響的[1]。脂肪細胞的數量增加和體積增大是肥胖患者的主要病理學改變，隨著體質量增加，許多炎癥因子含量也從而增加，因此肥胖被認為是一種慢性炎癥狀態[2]。脂肪組織具有內分泌的功能，能分泌瘦素、胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）、白細胞介素10（IL-10）等。IGF-Ⅰ也叫促生長因子（somatomedin C），是一種結構與胰島素類似的多功能蛋白質，具有調節細胞生長和分化的作用。IGF-Ⅰ在細胞代謝中作用的研究[3-4]結果讓我們將其與肥胖聯系起來。本研究對肥胖的病理生理學過程中及胃旁路手術后IGF-Ⅰ含量的變化進行了檢測，進一步探討了胃旁路手術對肥胖SD大鼠脂肪含量的調控機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料及設備
實驗動物：在肥胖動物模型的研究中人們發現，營養性肥胖大鼠的肥胖發生過程與人類代謝性肥胖過程最為接近[5]，因此本實驗選擇大鼠作為實驗動物。SPF級SD雄性大鼠70只，5~6周齡，體質量180~200 g，購自北京華阜康科技股份有限公司（許可證號：SCXK京2014-0004）。
主要材料：兔抗鼠IGF-Ⅰ多克隆一抗（Abcam公司）；兔抗鼠GAPDH單克隆一抗和辣根過氧化物酶標記（HRP）-山羊抗兔二抗（Proteintech公司）；兔抗鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）多克隆一抗、兔抗鼠磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）多克隆一抗、兔抗鼠蛋白激酶B（AKT）多克隆一抗及兔抗鼠磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）多克隆一抗（Cell signaling公司）；人類IGF-Ⅰ基因過表達質粒及相應空pEX2載體、IGF-ⅠshRNA（沉默基因）及相應空pGPU6/GFP/Neo載體（GenePharma公司）；Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen公司）；Trizol試劑盒（Life Technologies Corporation公司）；BCA蛋白檢測試劑盒（Beyotime Institute of Biotechnology公司）；Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒（BD Biosciences公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，C0009）；PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，Takara公司）。
設備：美國雙杰電子分析天平秤（T2000，常熟市雙杰測試儀器設備廠），倒置顯微鏡（CKX31，日本OLYMPUS公司），細胞恒溫培養箱（BPH-9082，上海一恒科學儀器有限公司），Thermo scientific低溫離心機（legend micro21R，賽默飛世爾科技有限公司），超聲細胞粉碎機（VCX130，德國Dr. Hielscher公司），NanoDrop分光光度計（ND-100，美國Thermo公司），化學發光檢測儀（A1600，美國通用電氣公司）及流式細胞儀（FACScan，美國BD Biosciences公司）。
1.2 建立肥胖大鼠模型
實驗大鼠的飼養過程遵照中國醫科大學附屬盛京醫院動物管理條例。大鼠于SPF級飼養室以普通飼料飼養1周后稱質量（W0），隨機（隨機數字表法）分為空白對照組10只（NC組）和高脂飲食組60只，采用記號筆于鼠尾部標記分組信息，按10只1組分別置于不同籠中飼養。正常對照組大鼠給予已測定能量值的特定配方維持飼料，飼料熱量組成比為：脂肪10%、蛋白質22%及碳水化合物68%；高脂飲食組的60只大鼠所飼飲食為特定配方高脂飼料（D12451，購于北京華阜康公司），熱量組成比為：脂肪45%（主要成分為飽和脂肪酸），蛋白質20%及碳水化合物35%。高脂飲食組大鼠給予特定飲食飼養6周后稱質量（W1），再根據體質量增加情況進行排序（W1-W0），取體質量增加值在前1/3的20只大鼠入組進行實驗，另再取1只大鼠取腹股溝脂肪組織，其余棄去不做深入研究。每周測定體質量，觀察攝食量直至12周[6]。
1.3 動物分組
將20只大鼠隨機（隨機數字表法）分為胃旁路術組（GB組）10只和假手術組（SO組）10只，加上前述的NC組，本實驗共設立3個組別。其中，GB組大鼠接受Roux-en-Y胃旁路術（RYGB），SO組大鼠接受假手術，NC組大鼠不接受任何手術。所有大鼠的手術均由同一術者完成。術前12 h開始禁食水。以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，備皮，將手術大鼠固定于操作臺上，再以75%乙醇消毒腹部，施行手術。術中分別取RYGB組及SO組大鼠右側腹股溝脂肪組織〔代表皮下脂肪組織（subcutaneous adipose tissue，SAT）〕和右側附睪脂肪組織〔代表內臟脂肪組織（visceral adipose tissue，VAT）〕，各取0.5 g，分裝入凍存管以液氮保存，以用于后續檢測組織中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表達。RYGB組大鼠的具體手術方式：取上腹劍突下正中切口約3 cm長，逐層入腹，在保留胃底約20%處將胃底與胃體橫斷，以碘伏消毒斷端后，兩斷端采用6-0無損傷線連續內翻縫合，在胃的上部建立1個胃小囊；再距Treitz韌帶遠端約15 cm處切斷空腸，遠端腸袢經結腸前上提，采用6-0無損傷線與胃小囊行端側吻合，近端腸袢在距胃空腸吻合口遠端約10 cm處和遠端空腸行端側吻合。吻合均采用全層間斷縫合外加漿肌層縫合的方式。SO組大鼠的手術方式為：在胃前壁取-2 cm長的切口，再使用6-0無損傷線連續縫合；距Treitz韌帶遠端約15 cm處切斷空腸后原位吻合，縫合方法及使用絲線同RYGB組。2組大鼠的手術盡量控制在相同時間內完成。吻合后以5×103 u/mL的慶大霉素溶液沖洗腹腔2次，再以2-0絲線逐層關腹。術后禁食48 h，禁水12 h，48 h后不限量進食高脂飼料。每天觀察大鼠飲食活動直至術后12周。于術后12周末時采用股動脈放血法處死3組大鼠，處死大鼠后采用無菌方法取左側腹股溝脂肪組織0.5 g和左側附睪脂肪組織0.5 g，分裝入凍存管以液氮保存，后續檢測組織中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表達。
1.4 原代脂肪細胞（primary adipose cells，PAC）的提取和培養
PAC培養：實驗中單獨挑選1只實驗組以外的肥胖大鼠取腹股溝脂肪組織，以保證在不影響實驗組大鼠的前提下取到足夠的SAT，將SAT以PBS（phosphate buffered saline）溶液漂洗3次，每次3~5 s，分離剔除肉眼可見的纖維及血管后，剪碎，采用酶消化法原代培養。采用含0.25%胰酶及胎牛血清白蛋白的混合物消化，每30 min搖勻1次，直至90 min。將消化混合液過濾，過濾液以1 500 r/min離心15 min（r=15 cm）后棄去上清，加入紅細胞裂解液混勻后再室溫放置10 min。用含5%胎牛血清的DMEM/F-12培養基于5% CO2恒溫培養箱內培養，培養約1~2周，待細胞融合率達到80%、生長狀態良好時收集PAC細胞進行轉染實驗。
1.5 質粒轉染
將PAC細胞以2.5×104個/mL的密度接種于6孔板中，分為BC組、IGF-Ⅰ（+）空載體組、IGF-Ⅰ（+）組（即基因過表達組）、IGF-Ⅰ（-）空載體組及IGF-Ⅰ（-）組（即基因沉默組），每組設3個復孔。IGF-Ⅰ（+）空載體組及IGF-Ⅰ（+）組采用pEX2載體，IGF-Ⅰ（-）空載體組及IGF-Ⅰ（-）組采用pGPU6/GFP/Neo載體，BC組不加任何試劑。采用Lipofectamine 2000試劑進行質粒轉染，操作根據說明書進行。轉染48 h后進行細胞增殖與凋亡實驗，以檢測細胞增殖能力以及凋亡率，并檢測AKT、p-AKT、p-PI3K、PI3K及GAPDH的表達水平。
此外，按前述操作將細胞分為4組：Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組、Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（-）、Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）及Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）組，轉染載體類型、操作及復孔數量同上。Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組及Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（-）組于轉染后24 h加入0.1 mmol/L Wortmannin（各孔加入20 μL），用于阻斷細胞PI3K信號通路[7]。加入24 h后收樣，檢測AKT、p-AKT、p-PI3K、PI3K及GAPDH的表達水平。
1.6 細胞增殖與凋亡率檢測
細胞增殖實驗使用MTT法進行。細胞消化后用含5%胎牛血清的高糖培養基重懸，以3 000個/孔的密度接種于96孔板中。培養24 h后換液，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL，pH=7.4）20 μL，隨后入恒溫培養箱培養0.5~4.0 h，棄上清培養液；每孔加150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），脫色搖床震蕩10 min。以酶標儀檢測5組細胞于490 nm處的吸光度值（optimal density，OD），每個復孔重復測量3次，取均值。細胞凋亡率檢測采用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒，根據操作說明進行細胞收樣及染色。收集細胞，采用流式細胞儀檢測凋亡率，每個復孔重復測量3次，取均值。
1.7 RNA提取及實時熒光定量PCR
組織及細胞中RNA表達水平用實時熒光定量PCR法檢測。采用Trizol法提取組織及細胞中的總RNA，RNA濃度和質量用NanoDrop分光光度計進行評價。IGF-Ⅰ及GAPDH引物序列見參考文獻[8]。One Step SYBR? Primer ScriptTM RT-PCR Kit反應體系（20.0 μL體系）：2×One Step SYBR? RT-PCR Buffer Ⅲ 10.0 μL，TaKaRa EX Taq HS（5 U/μL）0.4 μL，Primer Script RT enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，總RNA 2.0 μL，RNase Free dH2O 6.0 μL。反應條件：42 ℃ 5 min預變性；95 ℃ 10 s變性；95 ℃ 3 s退火，60 ℃ 30 s延伸，共40個循環。以GAPDH為內參，IGF-ⅠmRNA的表達量用相對定量法（2-△△CT）計算。
1.8 蛋白提取及免疫印跡法
組織及細胞分別加入裂解液，以超聲破碎細胞后（400 w，破5 s、停10 s），離心（17 000 r/min，r=20 cm，20 min），取上清，采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測樣品的蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸5 min。蛋白樣經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠中電泳分離后，轉印到聚偏二氟乙烯膜。將膜轉移至含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液（Tween-Tris-buffered saline）中封閉3 h。再將含有蛋白條帶的聚偏二氟乙烯膜與一抗4 ℃孵育過夜。根據實驗內容不同，一抗包括兔抗鼠IGF-Ⅰ多克隆一抗（1 : 1 000），內參蛋白兔抗鼠GAPDH單克隆一抗（1 : 5 000），PI3K（1 : 1 000）、p-PI3K（1 : 1 000）、AKT（1 : 1 000）及p-AKT（1 : 1 000）兔抗鼠多克隆一抗。再將蛋白膜與相應的HRP-共聚山羊抗兔二抗（1 : 5 000）孵育2 h，免疫復合物用ECL化學發光檢測系統檢測，以FluorChem 2.0軟件計算得到積分灰度值（integrated density value，IDV），以目的蛋白條帶和GAPDH IDV值的比值表示目的蛋白的相對表達量。
1.9 統計學方法
采用SPSS 18.0軟件分析數據。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，統計方法采用配對t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）分析（兩兩比較采用LSD法）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 IGF-ⅠmRNA及其蛋白在脂肪組織中的表達
為了研究IGF-ⅠmRNA及其蛋白在肥胖大鼠手術前后及正常大鼠脂肪組織中的表達水平，筆者進行了實時熒光定量PCR及免疫印跡實驗。由于NC組未接受任何處理，因此可認為其脂肪組織中IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達穩定、變化不大，因此也用于術前3組指標的比較。實時熒光定量PCR和免疫印跡實驗結果表明，在SAT組織中，同NC組比較，GB術前組及SO術前組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平均較高（P < 0.01），SO術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平也較高（P < 0.01），但GB術后組的差異無統計學意義（mRNA：P=0.14；蛋白：P=0.89）；同GB術前組比較，GB術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平均較低（P < 0.01），而SO術前組和SO術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（mRNA：P=0.61；蛋白：P=0.73）；GB術前組和SO術前組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（mRNA：P=0.86；蛋白：P=0.77），但GB術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平較SO術后組均較低（P < 0.01）。在VAT組織中，5組大鼠的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（mRNA：P=0.29；蛋白P=0.45）。見圖 1-3。
圖1
示IGF-ⅠmRNA在大鼠SAT和VAT中的表達結果。與NC組比較，*P < 0.01；與GB術后組比較，#P < 0.01??圖 2?示IGF-Ⅰ蛋白在大鼠SAT和VAT中表達的電泳結果??圖 3?示IGF-Ⅰ蛋白在大鼠SAT和VAT中的表達結果。與NC組比較，*P < 0.01；與GB術后組比較，#P < 0.01
2.2 細胞增殖與凋亡結果
MTT結果表明，與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的OD值比較差異均無統計學意義（P=0.89，P=0.77）；同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的OD值較高、增殖能力升高（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）組的OD值較低、細胞增殖緩慢（P=0.04）。見圖 4。
圖4
示增殖實驗結果。與IGF-Ⅰ（+）空載體組比較，*P < 0.05；與IGF-Ⅰ（-）空載體組比較，#P < 0.05??圖 5?示凋亡實驗結果。與IGF-Ⅰ（+）空載體組比較，*P < 0.05；與IGF-Ⅰ（-）空載體組比較，#P < 0.05??圖 6?示流式細胞儀檢查結果。6A：BC組；6B：IGF-Ⅰ（+）空載體組；6C：IGF-Ⅰ（+）組；6D：IGF-Ⅰ（-）空載體組；6E：IGF-Ⅰ（-）組
流式細胞儀檢測結果示，與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的細胞凋亡率比較差異均無統計學意義（P=0.48，P=62）；同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的細胞凋亡率較低（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）組的細胞凋亡率較高（P=0.04）。見圖 5和圖 6。
2.3 IGF-Ⅰ對PI3K/AKT信號通路的影響
為了研究IGF-Ⅰ下游蛋白水平表達的變化，筆者進行了免疫印跡實驗。因p-PI3K為PI3K的活化形式，而實驗是要檢驗PI3K的活化程度，故最終以p-PI3K/PI3K的比值進行呈現，p-AKT及AKT同理。結果示：與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的p-PI3K/PI3K（P=0.65，P=0.72）和p-AKT/AKT（P=0.58，P=0.75）比值比較差異均無統計學意義；與IGF-Ⅰ（+）空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的p-PI3K/PI3K（P=0.03）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均升高；與IGF-Ⅰ（-）空載體組相比，IGF-Ⅰ（-）組的p-PI3K/PI3K（P=0.04）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均降低，提示IGF-Ⅰ過表達確實能激活PI3K/AKT信號通路。見圖 7和圖 8。
圖7
示轉染后5組細胞的p-AKT、AKT、p-PI3K及PI3K的電泳結果??圖 8?示轉染后5組細胞的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值結果。與IGF-Ⅰ（+）空載體組比較，*P < 0.05；與IGF-Ⅰ（-）空載體組比較，#P < 0.05??圖 9?示Wortmannin抑制實驗中4組細胞的p-AKT和AKT的電泳結果??圖 10?示Wortmannin抑制實驗中4組細胞的p-AKT/AKT比值結果。與Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組相比，*P < 0.05，與Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）組相比，#P < 0.05
由于Wortmannin為PI3K抑制劑，使用后內源性PI3K活化已被抑制，難以測出。為了明確本實驗中IGF-Ⅰ能否激活PI3K/AKT信號通路，故筆者比較了p-AKT/AKT比值。結果示：與Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組比較，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）組的p-AKT/AKT比值較高（P < 0.05）；與Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）組比較，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）組的p-AKT/AKT比值較低（P < 0.05），見圖 9和圖 10。
3 討論
3.1 手術對于病態性肥胖的作用
病態性肥胖是由環境、基因、內分泌等一系列因素引起的一種病理狀態，指機體脂肪異常或過度沉積。21世紀后，病態性肥胖已經逐漸成為世界性健康和社會問題[9]。肥胖在人群中發病率的升高，將直接導致冠心病、高血壓病、糖尿病，以及惡性腫瘤例如乳腺癌[10]、宮頸癌[11]、結直腸癌[12]等疾病的發病率增加，使人類健康水平受到嚴重影響[13]。
減重手術指通過外科技術改變胃腸道的解剖關系，以改變部分胃、腸激素水平，從而改善病態肥胖患者的全身癥狀如超重、高血壓、高血糖、高血脂等癥狀的治療方法[14]。目前手術治療肥胖通常采用三種術式：RYGB、袖狀胃手術以及胃束帶手術，其中RYGB為目前減重及代謝外科的首選術式。該術式兼有限制性及吸收不良的作用，對病態性肥胖及2型糖尿病均有明顯的治療效果，是目前美國治療肥胖癥合并2型糖尿病的金標準[15-16]。本實驗即采用該種術式，手術時首先在胃底約20%處將胃底與胃體橫斷，使近端形成1個胃小囊，再距Treitz韌帶遠端15 cm處切斷空腸，再行胃腸吻合和腸腸吻合，從而改變了局部消化道的解剖結構，降低了胃排空速度，減少了小腸面積，限制其吸收能力。該種術式具有減重效果顯著、穩定、持久等優點。減重手術是目前治療病態性肥胖及其并發癥的唯一有效手段。隨著基礎研究的深入，除了減重手術的限容和促吸收不良作用外，人們不斷地發現參與調節機體代謝和能量平衡的內在因素，包括胃腸激素、膽汁酸、脂肪因子、腸道菌群和中樞神經系統[17-18]，這些都可能是減重手術改善代謝的潛在機理。尋找這些因素并探究它們的作用機理，對未來的臨床工作有重大意義。
3.2 IGF-Ⅰ與肥胖及內分泌的關系
在造成病態性肥胖的諸多因素中，內分泌因素起著尤為重要的作用，逐漸成為代謝外科關注的焦點[19]。胰島素樣生長因子（IGF）是一類廣泛分布于人體多種組織中的多肽，其結構和胰島素類似[20]。肝細胞分泌了人體中的大部分IGF，其接受垂體分泌的生長激素（GH）的調控[21]。
IGF在促進機體的生長發育、組織細胞分化、組織損傷修復、營養物質代謝等方面均有著至關重要的作用[22]。IGF蛋白由兩種多肽組成：IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF-Ⅰ蛋白主要由肝臟產生。IGF-Ⅰ蛋白的結構和功能與胰島素相似，可促進組織對葡萄糖的攝取，促進糖原異生，促進脂肪及蛋白質合成[23]。有研究[24]證實，IGF-Ⅰ蛋白可以通過作用于內源性脂肪干細胞或祖細胞來誘導脂肪細胞分化。將IGF-Ⅰ緩釋微囊植入C57BL6小鼠腹股溝脂肪墊中，通過控制釋放IGF-Ⅰ可以激活血管基質細胞的Axin2/PPARγ信號通路，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而影響參與脂肪細胞生成的CD31（-）/34（+）/146（-）細胞亞群，促進脂肪細胞再生[24]。除此之外，IGF-Ⅰ蛋白作為一種前脂肪細胞生長分化誘導因子，能夠促進DNA復制和細胞重新進入細胞周期，進行有絲分裂及克隆擴增，進而促進轉錄因子級聯反應和脂肪細胞基因的表達[25]。基于IGF-Ⅰ蛋白對于脂肪細胞富集的重要作用，筆者推測IGF-Ⅰ蛋白參與了肥胖的疾病進程，以及減重手術后的代謝改變。
3.3 IGF-Ⅰ參與減重手術后的代謝改變
在本實驗中，筆者對肥胖SD大鼠模型施行了RYGB以提取腹股溝皮下脂肪及附睪脂肪，通過實時熒光定量PCR及免疫印跡實驗檢測IGF-Ⅰ mRNA及蛋白的表達水平。結果顯示，在SAT組織中，同NC組比較，GB術前組、SO術前組及SO術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平均升高（P < 0.01）；GB術前組和SO術前組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（mRNA：P=0.86；蛋白：P=0.77）；GB術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平均較SO術后組降低（P < 0.01）；同GB術前組比較，GB術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白表達水平降低（P < 0.01），而SO術前組和SO術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），提示IGF-Ⅰ參與了高脂飲食后皮下脂肪的囤積[26]，并且RYGB能夠引起鼠皮下脂肪中IGF-Ⅰ的表達水平降低，這與之前文獻[27]的結果基本符合。但究竟是肝臟合成IGF-Ⅰ增加并運輸至皮下脂肪墊，還是皮下脂肪墊原位合成IGF-Ⅰ增加仍需進一步探究。
同時，筆者在細胞水平也進行了研究。在對過表達IGF-Ⅰ基因及IGF-Ⅰ基因沉默的細胞增殖能力的分析中發現，與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的OD值比較差異均無統計學意義（P=0.89，P=0.77），排除了載體的脫靶效應；同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的增殖能力升高，IGF-Ⅰ（-）組的細胞增殖緩慢。流式細胞儀檢測結果表明，與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的細胞凋亡率比較差異均無統計學意義（P=0.48，P=0.62）；同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的細胞凋亡率較低（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）組的細胞凋亡率較高（P=0.04）。說明對于皮下脂肪來講，IGF-Ⅰ能夠促進脂肪細胞的增殖，同時抑制脂肪細胞凋亡。進一步研究發現，過表達IGF-Ⅰ能激活PI3K/AKT信號通路，觸發促進細胞增殖、抑制凋亡的級聯反應。減重手術通過降低皮下脂肪組織中IGF-Ⅰ的表達水平，達到抑制脂肪細胞囤積的效果，這也是減重術后皮下脂肪組織減少的原因之一。但減重手術下調IGF-Ⅰ表達的原因不盡清楚，可能是由于手術對下丘腦激素信號通路產生影響，從而影響下丘腦-垂體軸[28]，具體機制仍需進一步研究。
綜上所述，IGF-Ⅰ的變化或許是減重手術后復雜廣泛的代謝改變之一，但它仍為我們深入研究手術機制、以尋找更好的治療方法提供了思路。
肥胖是一個日益嚴重的全球公共衛生問題，它的發生往往伴隨2型糖尿病、心血管疾病、血脂異常血癥、睡眠呼吸暫停、腫瘤等能嚴重影響人們生活質量的疾病，這些臨床表現即是代謝綜合征的特征性表現。因此，肥胖是一種營養代謝綜合征，它是受遺傳因素與環境因素共同影響的[1]。脂肪細胞的數量增加和體積增大是肥胖患者的主要病理學改變，隨著體質量增加，許多炎癥因子含量也從而增加，因此肥胖被認為是一種慢性炎癥狀態[2]。脂肪組織具有內分泌的功能，能分泌瘦素、胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）、白細胞介素10（IL-10）等。IGF-Ⅰ也叫促生長因子（somatomedin C），是一種結構與胰島素類似的多功能蛋白質，具有調節細胞生長和分化的作用。IGF-Ⅰ在細胞代謝中作用的研究[3-4]結果讓我們將其與肥胖聯系起來。本研究對肥胖的病理生理學過程中及胃旁路手術后IGF-Ⅰ含量的變化進行了檢測，進一步探討了胃旁路手術對肥胖SD大鼠脂肪含量的調控機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料及設備
實驗動物：在肥胖動物模型的研究中人們發現，營養性肥胖大鼠的肥胖發生過程與人類代謝性肥胖過程最為接近[5]，因此本實驗選擇大鼠作為實驗動物。SPF級SD雄性大鼠70只，5~6周齡，體質量180~200 g，購自北京華阜康科技股份有限公司（許可證號：SCXK京2014-0004）。
主要材料：兔抗鼠IGF-Ⅰ多克隆一抗（Abcam公司）；兔抗鼠GAPDH單克隆一抗和辣根過氧化物酶標記（HRP）-山羊抗兔二抗（Proteintech公司）；兔抗鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）多克隆一抗、兔抗鼠磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）多克隆一抗、兔抗鼠蛋白激酶B（AKT）多克隆一抗及兔抗鼠磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）多克隆一抗（Cell signaling公司）；人類IGF-Ⅰ基因過表達質粒及相應空pEX2載體、IGF-ⅠshRNA（沉默基因）及相應空pGPU6/GFP/Neo載體（GenePharma公司）；Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen公司）；Trizol試劑盒（Life Technologies Corporation公司）；BCA蛋白檢測試劑盒（Beyotime Institute of Biotechnology公司）；Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒（BD Biosciences公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，C0009）；PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，Takara公司）。
設備：美國雙杰電子分析天平秤（T2000，常熟市雙杰測試儀器設備廠），倒置顯微鏡（CKX31，日本OLYMPUS公司），細胞恒溫培養箱（BPH-9082，上海一恒科學儀器有限公司），Thermo scientific低溫離心機（legend micro21R，賽默飛世爾科技有限公司），超聲細胞粉碎機（VCX130，德國Dr. Hielscher公司），NanoDrop分光光度計（ND-100，美國Thermo公司），化學發光檢測儀（A1600，美國通用電氣公司）及流式細胞儀（FACScan，美國BD Biosciences公司）。
1.2 建立肥胖大鼠模型
實驗大鼠的飼養過程遵照中國醫科大學附屬盛京醫院動物管理條例。大鼠于SPF級飼養室以普通飼料飼養1周后稱質量（W0），隨機（隨機數字表法）分為空白對照組10只（NC組）和高脂飲食組60只，采用記號筆于鼠尾部標記分組信息，按10只1組分別置于不同籠中飼養。正常對照組大鼠給予已測定能量值的特定配方維持飼料，飼料熱量組成比為：脂肪10%、蛋白質22%及碳水化合物68%；高脂飲食組的60只大鼠所飼飲食為特定配方高脂飼料（D12451，購于北京華阜康公司），熱量組成比為：脂肪45%（主要成分為飽和脂肪酸），蛋白質20%及碳水化合物35%。高脂飲食組大鼠給予特定飲食飼養6周后稱質量（W1），再根據體質量增加情況進行排序（W1-W0），取體質量增加值在前1/3的20只大鼠入組進行實驗，另再取1只大鼠取腹股溝脂肪組織，其余棄去不做深入研究。每周測定體質量，觀察攝食量直至12周[6]。
1.3 動物分組
將20只大鼠隨機（隨機數字表法）分為胃旁路術組（GB組）10只和假手術組（SO組）10只，加上前述的NC組，本實驗共設立3個組別。其中，GB組大鼠接受Roux-en-Y胃旁路術（RYGB），SO組大鼠接受假手術，NC組大鼠不接受任何手術。所有大鼠的手術均由同一術者完成。術前12 h開始禁食水。以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，備皮，將手術大鼠固定于操作臺上，再以75%乙醇消毒腹部，施行手術。術中分別取RYGB組及SO組大鼠右側腹股溝脂肪組織〔代表皮下脂肪組織（subcutaneous adipose tissue，SAT）〕和右側附睪脂肪組織〔代表內臟脂肪組織（visceral adipose tissue，VAT）〕，各取0.5 g，分裝入凍存管以液氮保存，以用于后續檢測組織中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表達。RYGB組大鼠的具體手術方式：取上腹劍突下正中切口約3 cm長，逐層入腹，在保留胃底約20%處將胃底與胃體橫斷，以碘伏消毒斷端后，兩斷端采用6-0無損傷線連續內翻縫合，在胃的上部建立1個胃小囊；再距Treitz韌帶遠端約15 cm處切斷空腸，遠端腸袢經結腸前上提，采用6-0無損傷線與胃小囊行端側吻合，近端腸袢在距胃空腸吻合口遠端約10 cm處和遠端空腸行端側吻合。吻合均采用全層間斷縫合外加漿肌層縫合的方式。SO組大鼠的手術方式為：在胃前壁取-2 cm長的切口，再使用6-0無損傷線連續縫合；距Treitz韌帶遠端約15 cm處切斷空腸后原位吻合，縫合方法及使用絲線同RYGB組。2組大鼠的手術盡量控制在相同時間內完成。吻合后以5×103 u/mL的慶大霉素溶液沖洗腹腔2次，再以2-0絲線逐層關腹。術后禁食48 h，禁水12 h，48 h后不限量進食高脂飼料。每天觀察大鼠飲食活動直至術后12周。于術后12周末時采用股動脈放血法處死3組大鼠，處死大鼠后采用無菌方法取左側腹股溝脂肪組織0.5 g和左側附睪脂肪組織0.5 g，分裝入凍存管以液氮保存，后續檢測組織中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表達。
1.4 原代脂肪細胞（primary adipose cells，PAC）的提取和培養
PAC培養：實驗中單獨挑選1只實驗組以外的肥胖大鼠取腹股溝脂肪組織，以保證在不影響實驗組大鼠的前提下取到足夠的SAT，將SAT以PBS（phosphate buffered saline）溶液漂洗3次，每次3~5 s，分離剔除肉眼可見的纖維及血管后，剪碎，采用酶消化法原代培養。采用含0.25%胰酶及胎牛血清白蛋白的混合物消化，每30 min搖勻1次，直至90 min。將消化混合液過濾，過濾液以1 500 r/min離心15 min（r=15 cm）后棄去上清，加入紅細胞裂解液混勻后再室溫放置10 min。用含5%胎牛血清的DMEM/F-12培養基于5% CO2恒溫培養箱內培養，培養約1~2周，待細胞融合率達到80%、生長狀態良好時收集PAC細胞進行轉染實驗。
1.5 質粒轉染
將PAC細胞以2.5×104個/mL的密度接種于6孔板中，分為BC組、IGF-Ⅰ（+）空載體組、IGF-Ⅰ（+）組（即基因過表達組）、IGF-Ⅰ（-）空載體組及IGF-Ⅰ（-）組（即基因沉默組），每組設3個復孔。IGF-Ⅰ（+）空載體組及IGF-Ⅰ（+）組采用pEX2載體，IGF-Ⅰ（-）空載體組及IGF-Ⅰ（-）組采用pGPU6/GFP/Neo載體，BC組不加任何試劑。采用Lipofectamine 2000試劑進行質粒轉染，操作根據說明書進行。轉染48 h后進行細胞增殖與凋亡實驗，以檢測細胞增殖能力以及凋亡率，并檢測AKT、p-AKT、p-PI3K、PI3K及GAPDH的表達水平。
此外，按前述操作將細胞分為4組：Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組、Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（-）、Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）及Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）組，轉染載體類型、操作及復孔數量同上。Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組及Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（-）組于轉染后24 h加入0.1 mmol/L Wortmannin（各孔加入20 μL），用于阻斷細胞PI3K信號通路[7]。加入24 h后收樣，檢測AKT、p-AKT、p-PI3K、PI3K及GAPDH的表達水平。
1.6 細胞增殖與凋亡率檢測
細胞增殖實驗使用MTT法進行。細胞消化后用含5%胎牛血清的高糖培養基重懸，以3 000個/孔的密度接種于96孔板中。培養24 h后換液，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL，pH=7.4）20 μL，隨后入恒溫培養箱培養0.5~4.0 h，棄上清培養液；每孔加150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），脫色搖床震蕩10 min。以酶標儀檢測5組細胞于490 nm處的吸光度值（optimal density，OD），每個復孔重復測量3次，取均值。細胞凋亡率檢測采用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒，根據操作說明進行細胞收樣及染色。收集細胞，采用流式細胞儀檢測凋亡率，每個復孔重復測量3次，取均值。
1.7 RNA提取及實時熒光定量PCR
組織及細胞中RNA表達水平用實時熒光定量PCR法檢測。采用Trizol法提取組織及細胞中的總RNA，RNA濃度和質量用NanoDrop分光光度計進行評價。IGF-Ⅰ及GAPDH引物序列見參考文獻[8]。One Step SYBR? Primer ScriptTM RT-PCR Kit反應體系（20.0 μL體系）：2×One Step SYBR? RT-PCR Buffer Ⅲ 10.0 μL，TaKaRa EX Taq HS（5 U/μL）0.4 μL，Primer Script RT enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，總RNA 2.0 μL，RNase Free dH2O 6.0 μL。反應條件：42 ℃ 5 min預變性；95 ℃ 10 s變性；95 ℃ 3 s退火，60 ℃ 30 s延伸，共40個循環。以GAPDH為內參，IGF-ⅠmRNA的表達量用相對定量法（2-△△CT）計算。
1.8 蛋白提取及免疫印跡法
組織及細胞分別加入裂解液，以超聲破碎細胞后（400 w，破5 s、停10 s），離心（17 000 r/min，r=20 cm，20 min），取上清，采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測樣品的蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸5 min。蛋白樣經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠中電泳分離后，轉印到聚偏二氟乙烯膜。將膜轉移至含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液（Tween-Tris-buffered saline）中封閉3 h。再將含有蛋白條帶的聚偏二氟乙烯膜與一抗4 ℃孵育過夜。根據實驗內容不同，一抗包括兔抗鼠IGF-Ⅰ多克隆一抗（1 : 1 000），內參蛋白兔抗鼠GAPDH單克隆一抗（1 : 5 000），PI3K（1 : 1 000）、p-PI3K（1 : 1 000）、AKT（1 : 1 000）及p-AKT（1 : 1 000）兔抗鼠多克隆一抗。再將蛋白膜與相應的HRP-共聚山羊抗兔二抗（1 : 5 000）孵育2 h，免疫復合物用ECL化學發光檢測系統檢測，以FluorChem 2.0軟件計算得到積分灰度值（integrated density value，IDV），以目的蛋白條帶和GAPDH IDV值的比值表示目的蛋白的相對表達量。
1.9 統計學方法
采用SPSS 18.0軟件分析數據。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，統計方法采用配對t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）分析（兩兩比較采用LSD法）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 IGF-ⅠmRNA及其蛋白在脂肪組織中的表達
為了研究IGF-ⅠmRNA及其蛋白在肥胖大鼠手術前后及正常大鼠脂肪組織中的表達水平，筆者進行了實時熒光定量PCR及免疫印跡實驗。由于NC組未接受任何處理，因此可認為其脂肪組織中IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達穩定、變化不大，因此也用于術前3組指標的比較。實時熒光定量PCR和免疫印跡實驗結果表明，在SAT組織中，同NC組比較，GB術前組及SO術前組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平均較高（P < 0.01），SO術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平也較高（P < 0.01），但GB術后組的差異無統計學意義（mRNA：P=0.14；蛋白：P=0.89）；同GB術前組比較，GB術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平均較低（P < 0.01），而SO術前組和SO術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（mRNA：P=0.61；蛋白：P=0.73）；GB術前組和SO術前組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（mRNA：P=0.86；蛋白：P=0.77），但GB術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平較SO術后組均較低（P < 0.01）。在VAT組織中，5組大鼠的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（mRNA：P=0.29；蛋白P=0.45）。見圖 1-3。
圖1
示IGF-ⅠmRNA在大鼠SAT和VAT中的表達結果。與NC組比較，*P < 0.01；與GB術后組比較，#P < 0.01??圖 2?示IGF-Ⅰ蛋白在大鼠SAT和VAT中表達的電泳結果??圖 3?示IGF-Ⅰ蛋白在大鼠SAT和VAT中的表達結果。與NC組比較，*P < 0.01；與GB術后組比較，#P < 0.01
2.2 細胞增殖與凋亡結果
MTT結果表明，與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的OD值比較差異均無統計學意義（P=0.89，P=0.77）；同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的OD值較高、增殖能力升高（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）組的OD值較低、細胞增殖緩慢（P=0.04）。見圖 4。
圖4
示增殖實驗結果。與IGF-Ⅰ（+）空載體組比較，*P < 0.05；與IGF-Ⅰ（-）空載體組比較，#P < 0.05??圖 5?示凋亡實驗結果。與IGF-Ⅰ（+）空載體組比較，*P < 0.05；與IGF-Ⅰ（-）空載體組比較，#P < 0.05??圖 6?示流式細胞儀檢查結果。6A：BC組；6B：IGF-Ⅰ（+）空載體組；6C：IGF-Ⅰ（+）組；6D：IGF-Ⅰ（-）空載體組；6E：IGF-Ⅰ（-）組
流式細胞儀檢測結果示，與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的細胞凋亡率比較差異均無統計學意義（P=0.48，P=62）；同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的細胞凋亡率較低（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）組的細胞凋亡率較高（P=0.04）。見圖 5和圖 6。
2.3 IGF-Ⅰ對PI3K/AKT信號通路的影響
為了研究IGF-Ⅰ下游蛋白水平表達的變化，筆者進行了免疫印跡實驗。因p-PI3K為PI3K的活化形式，而實驗是要檢驗PI3K的活化程度，故最終以p-PI3K/PI3K的比值進行呈現，p-AKT及AKT同理。結果示：與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的p-PI3K/PI3K（P=0.65，P=0.72）和p-AKT/AKT（P=0.58，P=0.75）比值比較差異均無統計學意義；與IGF-Ⅰ（+）空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的p-PI3K/PI3K（P=0.03）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均升高；與IGF-Ⅰ（-）空載體組相比，IGF-Ⅰ（-）組的p-PI3K/PI3K（P=0.04）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均降低，提示IGF-Ⅰ過表達確實能激活PI3K/AKT信號通路。見圖 7和圖 8。
圖7
示轉染后5組細胞的p-AKT、AKT、p-PI3K及PI3K的電泳結果??圖 8?示轉染后5組細胞的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值結果。與IGF-Ⅰ（+）空載體組比較，*P < 0.05；與IGF-Ⅰ（-）空載體組比較，#P < 0.05??圖 9?示Wortmannin抑制實驗中4組細胞的p-AKT和AKT的電泳結果??圖 10?示Wortmannin抑制實驗中4組細胞的p-AKT/AKT比值結果。與Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組相比，*P < 0.05，與Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）組相比，#P < 0.05
由于Wortmannin為PI3K抑制劑，使用后內源性PI3K活化已被抑制，難以測出。為了明確本實驗中IGF-Ⅰ能否激活PI3K/AKT信號通路，故筆者比較了p-AKT/AKT比值。結果示：與Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組比較，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）組的p-AKT/AKT比值較高（P < 0.05）；與Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）組比較，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）組的p-AKT/AKT比值較低（P < 0.05），見圖 9和圖 10。
3 討論
3.1 手術對于病態性肥胖的作用
病態性肥胖是由環境、基因、內分泌等一系列因素引起的一種病理狀態，指機體脂肪異常或過度沉積。21世紀后，病態性肥胖已經逐漸成為世界性健康和社會問題[9]。肥胖在人群中發病率的升高，將直接導致冠心病、高血壓病、糖尿病，以及惡性腫瘤例如乳腺癌[10]、宮頸癌[11]、結直腸癌[12]等疾病的發病率增加，使人類健康水平受到嚴重影響[13]。
減重手術指通過外科技術改變胃腸道的解剖關系，以改變部分胃、腸激素水平，從而改善病態肥胖患者的全身癥狀如超重、高血壓、高血糖、高血脂等癥狀的治療方法[14]。目前手術治療肥胖通常采用三種術式：RYGB、袖狀胃手術以及胃束帶手術，其中RYGB為目前減重及代謝外科的首選術式。該術式兼有限制性及吸收不良的作用，對病態性肥胖及2型糖尿病均有明顯的治療效果，是目前美國治療肥胖癥合并2型糖尿病的金標準[15-16]。本實驗即采用該種術式，手術時首先在胃底約20%處將胃底與胃體橫斷，使近端形成1個胃小囊，再距Treitz韌帶遠端15 cm處切斷空腸，再行胃腸吻合和腸腸吻合，從而改變了局部消化道的解剖結構，降低了胃排空速度，減少了小腸面積，限制其吸收能力。該種術式具有減重效果顯著、穩定、持久等優點。減重手術是目前治療病態性肥胖及其并發癥的唯一有效手段。隨著基礎研究的深入，除了減重手術的限容和促吸收不良作用外，人們不斷地發現參與調節機體代謝和能量平衡的內在因素，包括胃腸激素、膽汁酸、脂肪因子、腸道菌群和中樞神經系統[17-18]，這些都可能是減重手術改善代謝的潛在機理。尋找這些因素并探究它們的作用機理，對未來的臨床工作有重大意義。
3.2 IGF-Ⅰ與肥胖及內分泌的關系
在造成病態性肥胖的諸多因素中，內分泌因素起著尤為重要的作用，逐漸成為代謝外科關注的焦點[19]。胰島素樣生長因子（IGF）是一類廣泛分布于人體多種組織中的多肽，其結構和胰島素類似[20]。肝細胞分泌了人體中的大部分IGF，其接受垂體分泌的生長激素（GH）的調控[21]。
IGF在促進機體的生長發育、組織細胞分化、組織損傷修復、營養物質代謝等方面均有著至關重要的作用[22]。IGF蛋白由兩種多肽組成：IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF-Ⅰ蛋白主要由肝臟產生。IGF-Ⅰ蛋白的結構和功能與胰島素相似，可促進組織對葡萄糖的攝取，促進糖原異生，促進脂肪及蛋白質合成[23]。有研究[24]證實，IGF-Ⅰ蛋白可以通過作用于內源性脂肪干細胞或祖細胞來誘導脂肪細胞分化。將IGF-Ⅰ緩釋微囊植入C57BL6小鼠腹股溝脂肪墊中，通過控制釋放IGF-Ⅰ可以激活血管基質細胞的Axin2/PPARγ信號通路，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而影響參與脂肪細胞生成的CD31（-）/34（+）/146（-）細胞亞群，促進脂肪細胞再生[24]。除此之外，IGF-Ⅰ蛋白作為一種前脂肪細胞生長分化誘導因子，能夠促進DNA復制和細胞重新進入細胞周期，進行有絲分裂及克隆擴增，進而促進轉錄因子級聯反應和脂肪細胞基因的表達[25]。基于IGF-Ⅰ蛋白對于脂肪細胞富集的重要作用，筆者推測IGF-Ⅰ蛋白參與了肥胖的疾病進程，以及減重手術后的代謝改變。
3.3 IGF-Ⅰ參與減重手術后的代謝改變
在本實驗中，筆者對肥胖SD大鼠模型施行了RYGB以提取腹股溝皮下脂肪及附睪脂肪，通過實時熒光定量PCR及免疫印跡實驗檢測IGF-Ⅰ mRNA及蛋白的表達水平。結果顯示，在SAT組織中，同NC組比較，GB術前組、SO術前組及SO術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平均升高（P < 0.01）；GB術前組和SO術前組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（mRNA：P=0.86；蛋白：P=0.77）；GB術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平均較SO術后組降低（P < 0.01）；同GB術前組比較，GB術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白表達水平降低（P < 0.01），而SO術前組和SO術后組的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），提示IGF-Ⅰ參與了高脂飲食后皮下脂肪的囤積[26]，并且RYGB能夠引起鼠皮下脂肪中IGF-Ⅰ的表達水平降低，這與之前文獻[27]的結果基本符合。但究竟是肝臟合成IGF-Ⅰ增加并運輸至皮下脂肪墊，還是皮下脂肪墊原位合成IGF-Ⅰ增加仍需進一步探究。
同時，筆者在細胞水平也進行了研究。在對過表達IGF-Ⅰ基因及IGF-Ⅰ基因沉默的細胞增殖能力的分析中發現，與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的OD值比較差異均無統計學意義（P=0.89，P=0.77），排除了載體的脫靶效應；同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的增殖能力升高，IGF-Ⅰ（-）組的細胞增殖緩慢。流式細胞儀檢測結果表明，與BC組相比，IGF-Ⅰ（+）空載體組與IGF-Ⅰ（-）空載體組的細胞凋亡率比較差異均無統計學意義（P=0.48，P=0.62）；同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的細胞凋亡率較低（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）組的細胞凋亡率較高（P=0.04）。說明對于皮下脂肪來講，IGF-Ⅰ能夠促進脂肪細胞的增殖，同時抑制脂肪細胞凋亡。進一步研究發現，過表達IGF-Ⅰ能激活PI3K/AKT信號通路，觸發促進細胞增殖、抑制凋亡的級聯反應。減重手術通過降低皮下脂肪組織中IGF-Ⅰ的表達水平，達到抑制脂肪細胞囤積的效果，這也是減重術后皮下脂肪組織減少的原因之一。但減重手術下調IGF-Ⅰ表達的原因不盡清楚，可能是由于手術對下丘腦激素信號通路產生影響，從而影響下丘腦-垂體軸[28]，具體機制仍需進一步研究。
綜上所述，IGF-Ⅰ的變化或許是減重手術后復雜廣泛的代謝改變之一，但它仍為我們深入研究手術機制、以尋找更好的治療方法提供了思路。
