引用本文： 陳雄飛, 周寧新, 張紅紅. FXYD6在肝門膽管癌中的表達及臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(11): 1344-1347. doi: 10.7507/1007-9424.20160344 復制
FXYD domain-containing ion transport regulator 6（FXYD6）是含95個氨基酸小分子量的Ⅰ型單跨膜蛋白，為鈉鉀泵的調節因子，通過調節鈉鉀泵的活性維持細胞內外離子成分的穩定[1]。研究[2-5]發現，FXYD6與多種腫瘤相關，其可促進膽管癌細胞、胰腺癌細胞、肝癌細胞、骨肉瘤細胞增殖。本研究旨在通過免疫組織化學的方法檢測FXYD6在肝門膽管癌中的表達情況，初步探討其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集滄州市中心醫院和火箭軍總醫院2007年2月至2012年8月期間行手術切除、臨床資料和病理資料相對完整的肝門膽管癌組織蠟塊58例及其癌旁正常膽管組織（鏡下未見癌細胞） 蠟塊30例，正常膽管組織經病理證實無癌細胞殘留。男39例，女19例。年齡30～83歲，平均63歲。所有患者術前未經過化療、放療或生物治療。此項研究獲得滄州市中心醫院和火箭軍總醫院倫理委員會批準，并取到患者或患者家屬同意并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 采用免疫組織化學鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）方法檢測肝門膽管癌組織及其癌旁正常膽管組織中FXYD6蛋白表達情況
SABC試劑盒及3,3-二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。所用鼠抗人FXYD6單克隆抗體由本課題組前期實驗獲得。標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，常規脫蠟、水化、檸檬酸抗原修復后，在0.3% H2O2溶液中37 ℃避光30 min，消除內源性過氧化物酶的活性，5%馬血清封閉1 h后滴加1 ： 300稀釋的鼠抗人FXYD6單克隆抗體，4 ℃過夜，滴加5%正常馬血清稀釋1 ： 200的生物素標記馬抗小鼠IgG后37 ℃孵育1 h，用稀釋1 ： 200的辣根過氧化物標記鏈卵白素37 ℃孵育40 min，DAB顯色，蘇木精復染，逐級脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。以正常腦組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。
1.2.2 結果判定標準
先在低倍（×40）顯微鏡下整體觀察FXYD6在膽管癌組織及其癌旁正常膽管組織中的表達情況，然后轉換成高倍鏡（×200、×400）觀察，綜合著色程度和陽性細胞數進行免疫組織化學染色評分，陽性細胞數≤5%記為0分，陽性細胞數6%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，＞75%記為4分；著色程度為淺黃色為1分，黃色為2分，褐色為3分。陽性細胞數評分與著色程度評分的乘積為最終評分結果，其中0～4分為陰性表達，＞5分為陽性表達。由具有5年以上臨床工作經驗的2位病理醫師閱片，評價結果不一致時，共同商討決定。為了避免假陽性，對組織形態破壞、壞死區域及邊緣的組織不評分。
1.3 統計學方法
應用SPSS 17.0 （Chicago，IL，USA）統計軟件對數據進行分析，采用χ2檢驗，雙側檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 FXYD6蛋白在肝門膽管癌組織及其癌旁正常肝門膽管組織中的表達
免疫組織化學染色結果發現，FXYD6蛋白表達彌漫分布于膽管癌細胞的細胞漿和細胞膜中，而細胞核未見著色；在周邊的神經纖維組織中也有FXYD6蛋白廣泛表達，組織中的其余間質成分未見FXYD6蛋白明顯表達（圖 1）。FXYD6蛋白在肝門膽管癌組織中的蛋白表達陽性率為75.9% （44/58），遠遠高于其在癌旁正常膽管組織中（圖 2）的表達陽性率 〔33.3% （10/30）〕，差異有統計學意義（χ2=15.084，P=0.000）。
圖1
FXYD6蛋白在膽管癌組織中的陽性表達（SABC ×200）。1A：在高、中分化膽管癌中高表達；1B：在低分化膽管癌中高表達；1C：在膽管癌細胞和神經纖維中高表達 ? ?2.2 FXYD6在肝門膽管癌中的表達與其臨床病理特征的關系
FXYD6蛋白在肝門膽管癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系見表 1。從表 1可見，FXYD6蛋白在高、中分化膽管癌組織中的表達陽性率明顯高于其在低分化膽管癌組織中的表達陽性率（χ2=5.243，P=0.022），而FXYD6蛋白表達與患者的性別（χ2=0.000，P=1.000）、年齡（χ2=1.248，P=0.264）、T分期（χ2=0.466，P=0.495）、 淋巴結轉移 （χ2=0.357，P=0.550）、病理分期（χ2=0.005，P=0.944）及神經浸潤（χ2=3.016，P=0.082）均無關。
表1
FXYD6蛋白表達與肝門膽管癌患者臨床病理特征的關系
3 討論
肝門膽管癌是起源于膽管黏膜上皮的高度惡性腫瘤，可沿膽管縱軸浸潤，亦可以沿膽管橫軸浸潤，由于肝門膽管的解剖位置，膽管癌穿透膽管壁后可直接侵犯周圍的肝臟和血管，且膽管周圍有豐富的淋巴組織、神經纖維和血管，因而易發生淋巴、神經和血管轉移，且對放化療不敏感，預后較差[6]。目前離子通道調節蛋白在細胞內外、細胞間的信號轉導中的作用，尤其在腫瘤發生的分子網絡調控方面已經引起廣泛重視。已有研究[7-10]發現，FXYD家族中的FXYD3 （MAT-8）及FXYD5與多種腫瘤相關，是兩個腫瘤相關蛋白。FXYD3最初在乳腺癌中被發現，其在乳腺癌組織中的表達較其在正常乳腺組織中明顯上調，其通過調節鈉鉀泵β1亞基發揮生物學作用，與乳腺癌治療抵抗有關，是乳腺癌的潛在治療靶點[11]。FXYD5是一種腫瘤相關膜蛋白，通過下調E-鈣黏素促進腫瘤轉移，在某些腫瘤中被認為是一個獨立的預后因素[12]。
FXYD6 mRNA在大鼠的腦和腎臟中高表達，其蛋白在大鼠大腦神經膠質細胞中不表達，而其在神經元的細胞漿及細胞膜中表達[13]，其可促進神經元網絡的形成，有利于突觸體的信號轉導[14]，有助于維持神經元的功能[15]。我們前期的研究發現，FXYD6 mRNA在正常膽管組織中低表達，在膽管癌組織中高表達，隨著腫瘤分化程度的降低其mRNA表達量上調[16]，而且FXYD6蛋白可促進膽管癌細胞增殖[3]。FXYD6在胰腺癌[17]、鼻咽癌[18]組織中表達上調，與腫瘤淋巴結轉移有關。
FXYD6蛋白在肝門膽管癌中的表達情況未見系統報道，本研究對此進行了研究。結果發現，FXYD6蛋白在肝門膽管癌組織中的表達陽性率較其在正常肝門膽管組織中增高，結果提示，FXYD6蛋白可能參與了膽管癌的癌變過程。在對FXYD6與肝門膽管癌的臨床病理特征分析結果中發現，FXYD6蛋白在膽管癌組織中的表達與腫瘤分化程度有關，在低分化膽管癌中FXYD6蛋白表達陽性率明顯低于其在高、中分化膽管癌組織中的表達陽性率。然而我們先前檢測mRNA水平在膽管癌組織中隨著膽管癌分化程度的下降其表達量明顯上升[16]，這與本研究結果不一致。分析其可能的原因是先前對膽管癌組織中的mRNA水平的研究中，組織中間質成分量不同，往往低分化的膽管癌組織中含神經纖維較多；另一方面的原因可能是FXYD6 mRNA在翻譯水平進行調節導致腫瘤細胞的FXYD6在mRNA水平與蛋白水平不一致，這還需在細胞水平上進一步驗證。
膽管癌是高度嗜神經生長的腫瘤，神經浸潤是膽管癌發展的重要組成部分，而且其在早期即可以發生。神經浸潤是膽管癌的一個獨立轉移途徑，與腫瘤大小、浸潤深度及位置有關，是膽管癌的一個不良預后因素[19]。膽管系統鄰近外周神經叢及腹腔神經叢，解剖上的便利條件利于膽管癌神經浸潤的發生[20]。因膽管癌通過神經纖維的轉移途徑，使腫瘤很難達到根治性切除，膽管癌患者預后差。在研究過程中我們發現，FXYD6不僅在大部分膽管癌細胞中表達，而且在神經纖維中表達，我們推測，FXYD6可能與膽管癌神經浸潤有關，因此在本研究中我們對FXYD6蛋白表達與肝門膽管癌神經浸潤的關系進行了方析，然而結果與預期未完合符合，但其表達有與膽管癌神經浸潤有關的趨勢。產生上述結果的原因可能是與樣本量較少有關，不除外取材局限性，膽管癌發病率相對較低，為進一步在組織水平觀察FXYD6與肝門膽管癌神經浸潤的關系需要我們開展多中心大樣本的分組研究。
FXYD蛋白是鈉鉀泵 β1亞基的重要調節因子[21]，其通過調節此亞基參與大鼠嗅覺信號轉導[22]，且鈉鉀泵α1亞基或β1亞基與腫瘤相關，已成為某些腫瘤治療的靶點[23]。基于此，我們推測FXYD6蛋白可能通過調節鈉鉀泵α1亞基或β1亞基參與膽管黏膜上皮癌變的過程，但FXYD6蛋白在膽管癌組織中高表達的機制不清楚，尚需進一步研究。
FXYD domain-containing ion transport regulator 6（FXYD6）是含95個氨基酸小分子量的Ⅰ型單跨膜蛋白，為鈉鉀泵的調節因子，通過調節鈉鉀泵的活性維持細胞內外離子成分的穩定[1]。研究[2-5]發現，FXYD6與多種腫瘤相關，其可促進膽管癌細胞、胰腺癌細胞、肝癌細胞、骨肉瘤細胞增殖。本研究旨在通過免疫組織化學的方法檢測FXYD6在肝門膽管癌中的表達情況，初步探討其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集滄州市中心醫院和火箭軍總醫院2007年2月至2012年8月期間行手術切除、臨床資料和病理資料相對完整的肝門膽管癌組織蠟塊58例及其癌旁正常膽管組織（鏡下未見癌細胞） 蠟塊30例，正常膽管組織經病理證實無癌細胞殘留。男39例，女19例。年齡30～83歲，平均63歲。所有患者術前未經過化療、放療或生物治療。此項研究獲得滄州市中心醫院和火箭軍總醫院倫理委員會批準，并取到患者或患者家屬同意并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 采用免疫組織化學鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）方法檢測肝門膽管癌組織及其癌旁正常膽管組織中FXYD6蛋白表達情況
SABC試劑盒及3,3-二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。所用鼠抗人FXYD6單克隆抗體由本課題組前期實驗獲得。標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，常規脫蠟、水化、檸檬酸抗原修復后，在0.3% H2O2溶液中37 ℃避光30 min，消除內源性過氧化物酶的活性，5%馬血清封閉1 h后滴加1 ： 300稀釋的鼠抗人FXYD6單克隆抗體，4 ℃過夜，滴加5%正常馬血清稀釋1 ： 200的生物素標記馬抗小鼠IgG后37 ℃孵育1 h，用稀釋1 ： 200的辣根過氧化物標記鏈卵白素37 ℃孵育40 min，DAB顯色，蘇木精復染，逐級脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。以正常腦組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。
1.2.2 結果判定標準
先在低倍（×40）顯微鏡下整體觀察FXYD6在膽管癌組織及其癌旁正常膽管組織中的表達情況，然后轉換成高倍鏡（×200、×400）觀察，綜合著色程度和陽性細胞數進行免疫組織化學染色評分，陽性細胞數≤5%記為0分，陽性細胞數6%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，＞75%記為4分；著色程度為淺黃色為1分，黃色為2分，褐色為3分。陽性細胞數評分與著色程度評分的乘積為最終評分結果，其中0～4分為陰性表達，＞5分為陽性表達。由具有5年以上臨床工作經驗的2位病理醫師閱片，評價結果不一致時，共同商討決定。為了避免假陽性，對組織形態破壞、壞死區域及邊緣的組織不評分。
1.3 統計學方法
應用SPSS 17.0 （Chicago，IL，USA）統計軟件對數據進行分析，采用χ2檢驗，雙側檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 FXYD6蛋白在肝門膽管癌組織及其癌旁正常肝門膽管組織中的表達
免疫組織化學染色結果發現，FXYD6蛋白表達彌漫分布于膽管癌細胞的細胞漿和細胞膜中，而細胞核未見著色；在周邊的神經纖維組織中也有FXYD6蛋白廣泛表達，組織中的其余間質成分未見FXYD6蛋白明顯表達（圖 1）。FXYD6蛋白在肝門膽管癌組織中的蛋白表達陽性率為75.9% （44/58），遠遠高于其在癌旁正常膽管組織中（圖 2）的表達陽性率 〔33.3% （10/30）〕，差異有統計學意義（χ2=15.084，P=0.000）。
圖1
FXYD6蛋白在膽管癌組織中的陽性表達（SABC ×200）。1A：在高、中分化膽管癌中高表達；1B：在低分化膽管癌中高表達；1C：在膽管癌細胞和神經纖維中高表達 ? ?2.2 FXYD6在肝門膽管癌中的表達與其臨床病理特征的關系
FXYD6蛋白在肝門膽管癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系見表 1。從表 1可見，FXYD6蛋白在高、中分化膽管癌組織中的表達陽性率明顯高于其在低分化膽管癌組織中的表達陽性率（χ2=5.243，P=0.022），而FXYD6蛋白表達與患者的性別（χ2=0.000，P=1.000）、年齡（χ2=1.248，P=0.264）、T分期（χ2=0.466，P=0.495）、 淋巴結轉移 （χ2=0.357，P=0.550）、病理分期（χ2=0.005，P=0.944）及神經浸潤（χ2=3.016，P=0.082）均無關。
表1
FXYD6蛋白表達與肝門膽管癌患者臨床病理特征的關系
3 討論
肝門膽管癌是起源于膽管黏膜上皮的高度惡性腫瘤，可沿膽管縱軸浸潤，亦可以沿膽管橫軸浸潤，由于肝門膽管的解剖位置，膽管癌穿透膽管壁后可直接侵犯周圍的肝臟和血管，且膽管周圍有豐富的淋巴組織、神經纖維和血管，因而易發生淋巴、神經和血管轉移，且對放化療不敏感，預后較差[6]。目前離子通道調節蛋白在細胞內外、細胞間的信號轉導中的作用，尤其在腫瘤發生的分子網絡調控方面已經引起廣泛重視。已有研究[7-10]發現，FXYD家族中的FXYD3 （MAT-8）及FXYD5與多種腫瘤相關，是兩個腫瘤相關蛋白。FXYD3最初在乳腺癌中被發現，其在乳腺癌組織中的表達較其在正常乳腺組織中明顯上調，其通過調節鈉鉀泵β1亞基發揮生物學作用，與乳腺癌治療抵抗有關，是乳腺癌的潛在治療靶點[11]。FXYD5是一種腫瘤相關膜蛋白，通過下調E-鈣黏素促進腫瘤轉移，在某些腫瘤中被認為是一個獨立的預后因素[12]。
FXYD6 mRNA在大鼠的腦和腎臟中高表達，其蛋白在大鼠大腦神經膠質細胞中不表達，而其在神經元的細胞漿及細胞膜中表達[13]，其可促進神經元網絡的形成，有利于突觸體的信號轉導[14]，有助于維持神經元的功能[15]。我們前期的研究發現，FXYD6 mRNA在正常膽管組織中低表達，在膽管癌組織中高表達，隨著腫瘤分化程度的降低其mRNA表達量上調[16]，而且FXYD6蛋白可促進膽管癌細胞增殖[3]。FXYD6在胰腺癌[17]、鼻咽癌[18]組織中表達上調，與腫瘤淋巴結轉移有關。
FXYD6蛋白在肝門膽管癌中的表達情況未見系統報道，本研究對此進行了研究。結果發現，FXYD6蛋白在肝門膽管癌組織中的表達陽性率較其在正常肝門膽管組織中增高，結果提示，FXYD6蛋白可能參與了膽管癌的癌變過程。在對FXYD6與肝門膽管癌的臨床病理特征分析結果中發現，FXYD6蛋白在膽管癌組織中的表達與腫瘤分化程度有關，在低分化膽管癌中FXYD6蛋白表達陽性率明顯低于其在高、中分化膽管癌組織中的表達陽性率。然而我們先前檢測mRNA水平在膽管癌組織中隨著膽管癌分化程度的下降其表達量明顯上升[16]，這與本研究結果不一致。分析其可能的原因是先前對膽管癌組織中的mRNA水平的研究中，組織中間質成分量不同，往往低分化的膽管癌組織中含神經纖維較多；另一方面的原因可能是FXYD6 mRNA在翻譯水平進行調節導致腫瘤細胞的FXYD6在mRNA水平與蛋白水平不一致，這還需在細胞水平上進一步驗證。
膽管癌是高度嗜神經生長的腫瘤，神經浸潤是膽管癌發展的重要組成部分，而且其在早期即可以發生。神經浸潤是膽管癌的一個獨立轉移途徑，與腫瘤大小、浸潤深度及位置有關，是膽管癌的一個不良預后因素[19]。膽管系統鄰近外周神經叢及腹腔神經叢，解剖上的便利條件利于膽管癌神經浸潤的發生[20]。因膽管癌通過神經纖維的轉移途徑，使腫瘤很難達到根治性切除，膽管癌患者預后差。在研究過程中我們發現，FXYD6不僅在大部分膽管癌細胞中表達，而且在神經纖維中表達，我們推測，FXYD6可能與膽管癌神經浸潤有關，因此在本研究中我們對FXYD6蛋白表達與肝門膽管癌神經浸潤的關系進行了方析，然而結果與預期未完合符合，但其表達有與膽管癌神經浸潤有關的趨勢。產生上述結果的原因可能是與樣本量較少有關，不除外取材局限性，膽管癌發病率相對較低，為進一步在組織水平觀察FXYD6與肝門膽管癌神經浸潤的關系需要我們開展多中心大樣本的分組研究。
FXYD蛋白是鈉鉀泵 β1亞基的重要調節因子[21]，其通過調節此亞基參與大鼠嗅覺信號轉導[22]，且鈉鉀泵α1亞基或β1亞基與腫瘤相關，已成為某些腫瘤治療的靶點[23]。基于此，我們推測FXYD6蛋白可能通過調節鈉鉀泵α1亞基或β1亞基參與膽管黏膜上皮癌變的過程，但FXYD6蛋白在膽管癌組織中高表達的機制不清楚，尚需進一步研究。
