引用本文： 許文, 吳煒, 高銘, 顧一帆, 費哲為. microRNA-21在不同分期胃癌中的表達及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(11): 1331-1334. doi: 10.7507/1007-9424.20160341 復制
胃癌作為消化系統最常見的惡性腫瘤之一，在各惡性腫瘤中發病率排名第5位，死亡率排名第2位[1]。由于缺乏特異性的癥狀及有效的早期篩查方法，大部分的胃癌患者在診斷時已經處于進展期，甚至出現了遠處轉移[2]。外科胃癌根治術是治愈胃癌的唯一可能的辦法，但也僅限于部分胃癌患者。對于廣泛轉移的患者，手術治療的效果不佳，甚至有利于腫瘤的轉移擴散。因此，術前準確地評估患者胃癌分期顯得尤為重要[3]。而microRNA （miRNA） 作為一種新型腫瘤診斷的生物標志物，已成為學者們研究的熱點[4-6]。目前已有研究[7-8]表明，miRNA-21在胃癌中高表達，可將其運用到胃癌的診斷中。但鮮有文獻進一步研究miRNA-21與胃癌病理分期的關系。本研究通過搜集不同病理分期胃癌患者的組織及血清標本，比較其miRNA-21的表達水平，以進一步探討miRNA-21的表達水平與胃癌患者病理分期的關系，為胃癌的術前評估提供參考價值。
1 資料與方法
1.1 資料來源
選取上海交通大學醫學院附屬新華醫院及其崇明分院普外科2015年1月至2016年1月期間收治且行胃癌根治術治療并經術后石蠟病理明確分期的50例胃癌患者作為研究對象。收集研究對象的血清、胃癌組織、癌旁正常胃組織（距離腫瘤邊緣5 cm以上的胃組織）樣本。均未行術前放化療及輸血治療。年齡＞60歲者15例，年齡≤60歲者35例。女21例，男29例。根據國際公認的美國癌癥聯合委員會第7版胃癌TNM分期[9]，9例為Ⅰ期，11例為Ⅱ期，30例為Ⅲ期。另選擇50例經胃鏡證實非胃癌患者的血清樣本，無慢性基礎疾病、查體未見異常、血清檢查肝腎功能、腫瘤標志物、乙肝兩對半正常，來源于上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院普外科住院患者，其中男30例，女20例，年齡≤60歲者30例，＞60歲者20例。該研究獲得了患者及其家屬的同意，該研究嚴格遵守赫爾辛基宣言，并獲得醫院倫理委員會的同意及批準。
1.2 主要試劑及檢測方法
采用熒光定量PCR法，U6作為內參基因，檢測miRNA-21在胃癌患者的組織及其血清中的表達量，均按說明書嚴格操作。首先，用Trizol試劑（Carlsbad，USA）提取總RNA；然后用Transcript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix （TransGen Bi，China）試劑盒對所得到的總RNA進行反轉錄操作，使其合成穩定的cDNA以便于暫時儲存；最后使用SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ （TaKaRa，China）試劑盒，通過CFX96實時PCR儀（Biorad，USA）進行實時熒光定量PCR操作，測出組織及血清中的miRNA-21及內參U6的Ct值，miRNA-21的相對表達量用2-ΔΔCt [10]表示。為了消除隨機誤差，每份樣本重復操作3次，求其均值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0 （IBM Inc，USA）統計軟件對數據進行分析。對胃癌組織與癌旁正常胃組織、胃癌患者血清與非胃癌患者血清、不同病理分期胃癌患者的組織及血清中miRNA-21的表達水平的比較均采用Mann-Whitney檢驗，各期miRNA-21的相對表達量用中位數（四分位數間距）表示，對血清及組織中miRNA-21表達水平的相關性采用Pearson相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同病理分期胃癌患者胃癌組織中miRNA-21的相對表達量
胃癌組織中miRNA-21的相對表達量明顯高于其在癌旁正常胃組織中的相對表達量（P＜0.05），見圖 1。在9例病理Ⅰ期胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量為2.17 （1.48～2.90），11例病理Ⅱ期胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量為4.08 （2.30～4.86），30例病理Ⅲ期胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量為8.64 （5.82～18.20），其在Ⅲ期胃癌患者癌組織中的相對表達量明顯高于其在Ⅰ期和Ⅱ期胃癌患者癌組織中的相對表達量（P＜0.05），在Ⅱ期胃癌患者癌組織中的相對表達量明顯高于其在Ⅰ期胃癌患者癌組織中的相對表達量（P＜0.05），見圖 2。
圖1
胃癌組組與癌旁正常胃組織中miRNA-21的相對表達量的比較結果。與癌旁正常胃組織比較，*P＜0.05
圖2
不同分期的胃癌患者癌組織中miRNA-21的相對表達量比較結果。與Ⅰ期和Ⅱ期比較，*P＜0.05；與Ⅰ期比較，△ P＜0.05
2.2 不同病理分期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量
胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量明顯高于其在非胃癌患者血清中的相對表達量（P＜0.05），見圖 3。在9例病理Ⅰ期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量為31.00 （24.60～37.15），11例病理Ⅱ期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量為39.10 （28.90～39.80），30例病理Ⅲ期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量為44.15 （38.95～56.68），其在病理Ⅲ期胃癌患者血清中的相對表達量明顯高于其在Ⅰ期和Ⅱ期胃癌患者血清中的相對表達量（P＜0.05），在Ⅱ期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量明顯高于其在Ⅰ期胃癌患者血清中的相對表達量（P＜0.05），見圖 4。
圖3
胃癌患者與非胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量。與非胃癌患者比較，*P＜0.05
圖4
不同分期的胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量比較。與Ⅰ期和Ⅱ期比較，*P＜0.05；與Ⅰ期比較，△ P＜0.05
2.3 胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量與血清中miRNA-21的相對表達量的相關性
通過Pearson相關性分析結果發現，胃癌患者血清和癌組織中miRNA-21的相對表達量呈正相關（r=0.86，P＜0.05）。見圖 5。
圖5
胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量與血清中miRNA-21的相對表達量的相關性
3 討論
在各種惡性腫瘤中，胃癌的死亡率排第2位[1]。隨著胃癌診療方法的發展，尤其是通過新檢查方法對胃癌患者進行早期篩查，使得胃癌在某種程度上可防可治[11]。特別是術前準確地評估胃癌分期，能為其新輔助化療方案的制定提供參考，同時也能為手術方式的制定提供依據，進而改善患者的預后[12]。目前，術者僅能通過影像學檢查如增強CT等評估淋巴結轉移情況，通過超聲胃鏡評估腫瘤浸潤深度及大小，但這些檢查由于摻雜閱片人及操作者經驗、CT分辨率等因素影響，嚴重制約著其術前分期評估的準確性。因此，尋找能較為客觀準確地評估胃癌患者術前分期指標具有較高的臨床實用價值。
miRNA是一種由大約20個核苷酸構成的小型非編碼RNA[13]。通過堿基互補配對原理，與mRNA結合來阻止其翻譯，從而調節許多靶基因的表達以影響腫瘤的發生及侵襲[14]。miRNA-21的編碼基因定位于17q23.2，能高表達于肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌、腦癌、頭頸部腫瘤、食管癌、胰腺癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病等惡性腫瘤中[15]，被公認為致癌性小RNA，其在腫瘤發展的所有階段均發揮著重要作用[16]。
在胃癌患者的血清及癌組織中miRNA-21的表達量明顯增加[17-18]，在胃癌患者的胃液中miRNA-21的表達量較健康對照者也高[19]，因此，miRNA-21被許多學者[20-21]認為是診斷胃癌潛在的生物標志物。
胃癌中miRNA-21高表達與腫瘤大小、淋巴結轉移等有關[22]，且miRNA-21高表達提示胃癌患者預后差[23]。胃癌組織中miRNA-21的相對表達量較其在癌旁正常胃組織中高，并且其靈敏度為0.70，特異度為0.78，AUC為0.75[24]。胃癌患者血清中的miRNA-21的相對表達量較非胃癌患者較高，其靈敏度為0.84，特異度為0.81，AUC為0.85 [25]。
在本研究中得到了與上述研究中相同的結論。我們分析了不同病理分期胃癌患者的癌組織及血清中miRNA-21的相對表達量，結果發現，在胃癌組織和血清中，隨著TNM分期越高，miRNA-21的相對表達量越高（P＜0.05）。因此，我們可以通過測miRNA-21的表達量來對患者術前病理分期進行評估。而后，我們進一步通過Pearson相關分析發現，胃癌患者的癌組織與血清中miRNA-21相對表達量呈正相關（r=0.86，P＜0.05），因此，我們可以通過測血清中miRNA-21表達水平來預測癌組織中的表達。本研究也存在一些缺陷，首先，由于我們收集的是行胃癌根治術的患者，未納入Ⅳ期胃癌患者，但是從前Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的比較結果推測Ⅳ期胃癌患者中的表達量可能會更高。其次，由于收集的樣本量有限，我們在對三期比較時發現，各期miRNA-21的表達量并不服從于正態分布，因此我們采用了檢驗效能稍低的Mann-Whitney檢驗，其結果有統計學意義。
綜上，miRNA-21在胃癌分期較高的患者中的表達明顯增加，且血清與癌組織中miRNA-21的表達呈正相關，結果提示，miRNA-21 可能在胃癌的發生、發展過程中發揮重要作用，檢測miRNA-21 的表達量對胃癌的臨床診斷和治療可能有重要的指導意義。
胃癌作為消化系統最常見的惡性腫瘤之一，在各惡性腫瘤中發病率排名第5位，死亡率排名第2位[1]。由于缺乏特異性的癥狀及有效的早期篩查方法，大部分的胃癌患者在診斷時已經處于進展期，甚至出現了遠處轉移[2]。外科胃癌根治術是治愈胃癌的唯一可能的辦法，但也僅限于部分胃癌患者。對于廣泛轉移的患者，手術治療的效果不佳，甚至有利于腫瘤的轉移擴散。因此，術前準確地評估患者胃癌分期顯得尤為重要[3]。而microRNA （miRNA） 作為一種新型腫瘤診斷的生物標志物，已成為學者們研究的熱點[4-6]。目前已有研究[7-8]表明，miRNA-21在胃癌中高表達，可將其運用到胃癌的診斷中。但鮮有文獻進一步研究miRNA-21與胃癌病理分期的關系。本研究通過搜集不同病理分期胃癌患者的組織及血清標本，比較其miRNA-21的表達水平，以進一步探討miRNA-21的表達水平與胃癌患者病理分期的關系，為胃癌的術前評估提供參考價值。
1 資料與方法
1.1 資料來源
選取上海交通大學醫學院附屬新華醫院及其崇明分院普外科2015年1月至2016年1月期間收治且行胃癌根治術治療并經術后石蠟病理明確分期的50例胃癌患者作為研究對象。收集研究對象的血清、胃癌組織、癌旁正常胃組織（距離腫瘤邊緣5 cm以上的胃組織）樣本。均未行術前放化療及輸血治療。年齡＞60歲者15例，年齡≤60歲者35例。女21例，男29例。根據國際公認的美國癌癥聯合委員會第7版胃癌TNM分期[9]，9例為Ⅰ期，11例為Ⅱ期，30例為Ⅲ期。另選擇50例經胃鏡證實非胃癌患者的血清樣本，無慢性基礎疾病、查體未見異常、血清檢查肝腎功能、腫瘤標志物、乙肝兩對半正常，來源于上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院普外科住院患者，其中男30例，女20例，年齡≤60歲者30例，＞60歲者20例。該研究獲得了患者及其家屬的同意，該研究嚴格遵守赫爾辛基宣言，并獲得醫院倫理委員會的同意及批準。
1.2 主要試劑及檢測方法
采用熒光定量PCR法，U6作為內參基因，檢測miRNA-21在胃癌患者的組織及其血清中的表達量，均按說明書嚴格操作。首先，用Trizol試劑（Carlsbad，USA）提取總RNA；然后用Transcript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix （TransGen Bi，China）試劑盒對所得到的總RNA進行反轉錄操作，使其合成穩定的cDNA以便于暫時儲存；最后使用SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ （TaKaRa，China）試劑盒，通過CFX96實時PCR儀（Biorad，USA）進行實時熒光定量PCR操作，測出組織及血清中的miRNA-21及內參U6的Ct值，miRNA-21的相對表達量用2-ΔΔCt [10]表示。為了消除隨機誤差，每份樣本重復操作3次，求其均值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0 （IBM Inc，USA）統計軟件對數據進行分析。對胃癌組織與癌旁正常胃組織、胃癌患者血清與非胃癌患者血清、不同病理分期胃癌患者的組織及血清中miRNA-21的表達水平的比較均采用Mann-Whitney檢驗，各期miRNA-21的相對表達量用中位數（四分位數間距）表示，對血清及組織中miRNA-21表達水平的相關性采用Pearson相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同病理分期胃癌患者胃癌組織中miRNA-21的相對表達量
胃癌組織中miRNA-21的相對表達量明顯高于其在癌旁正常胃組織中的相對表達量（P＜0.05），見圖 1。在9例病理Ⅰ期胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量為2.17 （1.48～2.90），11例病理Ⅱ期胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量為4.08 （2.30～4.86），30例病理Ⅲ期胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量為8.64 （5.82～18.20），其在Ⅲ期胃癌患者癌組織中的相對表達量明顯高于其在Ⅰ期和Ⅱ期胃癌患者癌組織中的相對表達量（P＜0.05），在Ⅱ期胃癌患者癌組織中的相對表達量明顯高于其在Ⅰ期胃癌患者癌組織中的相對表達量（P＜0.05），見圖 2。
圖1
胃癌組組與癌旁正常胃組織中miRNA-21的相對表達量的比較結果。與癌旁正常胃組織比較，*P＜0.05
圖2
不同分期的胃癌患者癌組織中miRNA-21的相對表達量比較結果。與Ⅰ期和Ⅱ期比較，*P＜0.05；與Ⅰ期比較，△ P＜0.05
2.2 不同病理分期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量
胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量明顯高于其在非胃癌患者血清中的相對表達量（P＜0.05），見圖 3。在9例病理Ⅰ期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量為31.00 （24.60～37.15），11例病理Ⅱ期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量為39.10 （28.90～39.80），30例病理Ⅲ期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量為44.15 （38.95～56.68），其在病理Ⅲ期胃癌患者血清中的相對表達量明顯高于其在Ⅰ期和Ⅱ期胃癌患者血清中的相對表達量（P＜0.05），在Ⅱ期胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量明顯高于其在Ⅰ期胃癌患者血清中的相對表達量（P＜0.05），見圖 4。
圖3
胃癌患者與非胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量。與非胃癌患者比較，*P＜0.05
圖4
不同分期的胃癌患者血清中miRNA-21的相對表達量比較。與Ⅰ期和Ⅱ期比較，*P＜0.05；與Ⅰ期比較，△ P＜0.05
2.3 胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量與血清中miRNA-21的相對表達量的相關性
通過Pearson相關性分析結果發現，胃癌患者血清和癌組織中miRNA-21的相對表達量呈正相關（r=0.86，P＜0.05）。見圖 5。
圖5
胃癌患者的癌組織中miRNA-21的相對表達量與血清中miRNA-21的相對表達量的相關性
3 討論
在各種惡性腫瘤中，胃癌的死亡率排第2位[1]。隨著胃癌診療方法的發展，尤其是通過新檢查方法對胃癌患者進行早期篩查，使得胃癌在某種程度上可防可治[11]。特別是術前準確地評估胃癌分期，能為其新輔助化療方案的制定提供參考，同時也能為手術方式的制定提供依據，進而改善患者的預后[12]。目前，術者僅能通過影像學檢查如增強CT等評估淋巴結轉移情況，通過超聲胃鏡評估腫瘤浸潤深度及大小，但這些檢查由于摻雜閱片人及操作者經驗、CT分辨率等因素影響，嚴重制約著其術前分期評估的準確性。因此，尋找能較為客觀準確地評估胃癌患者術前分期指標具有較高的臨床實用價值。
miRNA是一種由大約20個核苷酸構成的小型非編碼RNA[13]。通過堿基互補配對原理，與mRNA結合來阻止其翻譯，從而調節許多靶基因的表達以影響腫瘤的發生及侵襲[14]。miRNA-21的編碼基因定位于17q23.2，能高表達于肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌、腦癌、頭頸部腫瘤、食管癌、胰腺癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病等惡性腫瘤中[15]，被公認為致癌性小RNA，其在腫瘤發展的所有階段均發揮著重要作用[16]。
在胃癌患者的血清及癌組織中miRNA-21的表達量明顯增加[17-18]，在胃癌患者的胃液中miRNA-21的表達量較健康對照者也高[19]，因此，miRNA-21被許多學者[20-21]認為是診斷胃癌潛在的生物標志物。
胃癌中miRNA-21高表達與腫瘤大小、淋巴結轉移等有關[22]，且miRNA-21高表達提示胃癌患者預后差[23]。胃癌組織中miRNA-21的相對表達量較其在癌旁正常胃組織中高，并且其靈敏度為0.70，特異度為0.78，AUC為0.75[24]。胃癌患者血清中的miRNA-21的相對表達量較非胃癌患者較高，其靈敏度為0.84，特異度為0.81，AUC為0.85 [25]。
在本研究中得到了與上述研究中相同的結論。我們分析了不同病理分期胃癌患者的癌組織及血清中miRNA-21的相對表達量，結果發現，在胃癌組織和血清中，隨著TNM分期越高，miRNA-21的相對表達量越高（P＜0.05）。因此，我們可以通過測miRNA-21的表達量來對患者術前病理分期進行評估。而后，我們進一步通過Pearson相關分析發現，胃癌患者的癌組織與血清中miRNA-21相對表達量呈正相關（r=0.86，P＜0.05），因此，我們可以通過測血清中miRNA-21表達水平來預測癌組織中的表達。本研究也存在一些缺陷，首先，由于我們收集的是行胃癌根治術的患者，未納入Ⅳ期胃癌患者，但是從前Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的比較結果推測Ⅳ期胃癌患者中的表達量可能會更高。其次，由于收集的樣本量有限，我們在對三期比較時發現，各期miRNA-21的表達量并不服從于正態分布，因此我們采用了檢驗效能稍低的Mann-Whitney檢驗，其結果有統計學意義。
綜上，miRNA-21在胃癌分期較高的患者中的表達明顯增加，且血清與癌組織中miRNA-21的表達呈正相關，結果提示，miRNA-21 可能在胃癌的發生、發展過程中發揮重要作用，檢測miRNA-21 的表達量對胃癌的臨床診斷和治療可能有重要的指導意義。
