引用本文： 程康文, 王貴和, 陸朋云. 維生素K2聯合5-氟尿嘧啶對肝癌細胞增殖、遷移與侵襲能力的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(11): 1321-1324. doi: 10.7507/1007-9424.20160339 復制
原發性肝癌中肝細胞癌（以下簡稱肝癌） 占70%～85%，其是世界范圍內男性第5位、女性第7位的常見惡性腫瘤[1]。手術是目前最有效的治療方法，然而，但其術后復發及轉移率仍較高，術后預后較差[2]。盡管化學和分子靶向治療藥物用來抑制肝癌術后復發，但其效果仍然欠佳。因此，肝癌的化學預防治療策略逐漸成為熱點，以降低肝癌術后復發及改善其預后[3]。5-氟尿嘧啶（5-FU）已被用于肝癌的化療，然而其反應率較低（15%～20%） [4]。維生素K （VK）是脂溶性維生素，是人體血液凝固和鈣代謝所必須的[5]，其可以抑制肝癌細胞的生長[6]，而VK2類似物能預防肝癌術后復發，其原理在于抑制肝癌衍生生長因子表達，從而產生較強的抗血管效應[7]。因此，本研究將5-FU與VK2聯合，研究其對肝癌細胞株增殖、遷移及侵襲的影響，為肝癌術后的化療提供策略。
1 材料與方法
1.1 細胞株與主要材料
人肝癌細胞株PLC/RAF/5由中山大學附屬第一醫院外科實驗中心提供；DMEM 培養基、青霉素、鏈霉素購自Hyclone公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibico公司；VK2 （Menaquinone）購自上海聯碩生物科技有限公司，用乙醇配制成10-2 mol/L溶液儲存在-20 ℃冰箱中；5-FU購自南京凱基生物公司；CCK-8購自日本同仁化學研究所。
1.2 細胞培養及分組
用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，待其融合度達到80%以上時傳代，取對數期細胞實驗。根據培養基中所含藥物不同分為對照組（未加入任何藥物）、VK2（100 μmol/L） 組、 5-FU （10 μg/mL） 組、VK2 （100 μmol/L）與5-FU （10 μg/mL）聯合用藥組（簡稱VK2+5-FU組）。
1.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力
在96孔培養板內每孔鋪5 000個細胞，貼壁后各組分別加入相應的藥物，每組設4個復孔，同時設定只含培養基的空白對照。孵育24 h后吸去培養基，每孔加入180 μL不含血清培養基和20 μL CCK-8，繼續孵育2 h后采用酶聯免疫檢測儀測定490 nm處的吸光度（A） 值，去掉其最大值與最小值后取均數。細胞存活率（%） = （A實驗-A空白） / （A對照-A空白）×100%。
1.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力
每塊6孔板孔中加入約5×105個細胞，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養24 h。觀察細胞長滿孔底后用移液器槍頭比著直尺，照著背后的橫線垂直劃痕。再用PBS輕輕地洗細胞3次，去除漂浮及壞死細胞，最后各組分別加入含不同藥物的培養基，放入37 ℃、5% CO2培養箱培養。于0、24 h取樣，用倒置相差顯微鏡拍照并計數劃痕區域的細胞數，以未加藥組遷移細胞數為對照計算相對遷移百分率。
1.5 Matrigel侵襲小室法檢測細胞侵襲能力
用培養基稀釋Matrigel （2 : 1），均勻涂布于Tran-swell小室上室，在24孔板下室加入600 μL含10%血清的培養基。取1×105/mL細胞懸液100 μL加入Transwell小室中，各組分別加入含不同藥物的培養基，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中常規培養24 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養液，用PBS洗2遍，甲醇固定30 min，將小室適當風干。0.1%結晶紫染色20 min，用PBS洗3遍后晾干，移至載玻片上用中心樹膠分片。100倍顯微鏡下隨機觀察5個視野細胞并計數。
1.6 統計學方法
采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析。數據均采用均數±標準差（x±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析與LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 VK2和5-FU對PLC/RAF/5細胞增殖的影響
細胞增殖實驗結果顯示，對照組、VK2組、5-FU組及VK2+5-FU組的細胞存活率分別為100%、（88.00±5.72） %、 （47.75±6.60） %及 （35.75±4.35） %。經統計學分析，各組間細胞存活率比較差異有統計學意義（F=94.447，P＜0.05）；多重比較結果顯示，各組細胞存活率VK2組＞5-FU組＞VK2+5-FU組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖 1。VK2+5-FU組細胞存活率最低，結果提示，VK2和5-FU及聯合用藥均能有效抑制PLC/RAF/5細胞的增殖能力。
圖1
各組PLC/RAF/5細胞存活率比較；A：對照組；B：VK2組；C：5-FU 組；D：VK2+5-FU組。組間兩兩比較，*P＜0.05
2.2 VK2和5-FU 對PLC/RAF/5細胞遷移的影響
細胞劃痕實驗結果（圖 2、3）顯示，對照組兩側細胞24 h后融合即細胞遷移率為100%，VK2組、5-FU組及VK2+5-FU組的細胞遷移率分別為（81.00±2.58） %、 （37.50±6.46） %和 （19.50±4.20） %，經統計學分析，各組細胞遷移率比較差異有統計學意義（F=181.773，P＜0.05）；多重比較結果顯示，各組細胞遷移率VK2組＞5-FU組＞VK2+5-FU組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。VK2+5-FU組細胞遷移率最低，結果提示，VK2和5-FU以及聯合用藥均能有效抑制PLC/RAF/5細胞的遷移能力。
圖2
細胞劃痕實驗結果（ ×20）。2A：對照組；2B：VK2組；2C：5-FU組；2D：VK2+5-FU組
圖3
各組PLC/RAF/5細胞遷移率的比較 A：對照組；B：VK2組；C：5-FU 組；D：VK2+5-FU組。組間兩兩比較，*P＜0.05
2.3 VK2和5-FU 對PLC/RAF/5細胞侵襲的影響
Transwell小室侵襲實驗（圖 4、5）結果顯示，對照組、VK2組、5-FU組和VK2+5-FU聯合用藥組侵襲細胞數目分別為115±4、83±3、63±3、21±2，經統計學分析，各組侵襲細胞數目比較差異有統計學意義（F=650.982，P＜0.05）；多重比較結果顯示，各組侵襲細胞數目對照組＞VK2組＞5-FU組＞VK2+5-FU組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。VK2+5-FU組侵襲細胞數目最低，結果提示，VK2和5-FU以及聯合用藥均能抑制PLC/RAF/5細胞的侵襲能力。
圖4
Transwell小室侵襲實驗結果（ ×40）。4A：對照組；4B：VK2組；4C：5-FU組；4D：VK2+5-FU組
圖5
各組PLC/RAF/5細胞侵襲能力比較。A：對照組；B：VK2組；C：5-FU 組；D：VK2+5-FU組。組間兩兩比較，*P＜0.05
3 討論
盡管手術和射頻消融作為肝癌的有效治療手段，但是其術后的5年復發率在肝硬化肝癌患者中超過50%，而中晚期肝癌患者復發率接近75% [8]。肝癌術后復發的主要原因在于肝癌細胞的增殖、侵襲、轉移[9-10]。因此，肝癌術后有效治療或預防術后復發，對改善肝癌根治術后或射頻消融術后的長期生存有著重要的意義。
有許多研究探索新輔助化療或化療在預防肝癌術后復發中的作用，但目前臨床上仍沒有一種明確的獲益化療方案，也沒有一種推薦方案[11]。
5-FU作為抗腫瘤代謝的經典藥物，可以誘導細胞周期靜止和促進細胞凋亡，延緩S、G1期細胞的進程[12]，以5-FU為主的化療方案已嘗試應用于晚期肝癌以及肝癌術后復發、轉移的患者[13-14]。但是近年來由于肝癌細胞對5-FU的敏感性下降或耐藥性等因素，影響了5-FU抗癌療效的發揮[15]，其中細胞凋亡失控即過度增殖是導致對化療耐藥的根源[16]。
VK能夠抑制肝癌細胞的生長[6, 17]，其中VK2可使細胞周期靜止和促進細胞凋亡，可抑制肝癌細胞的侵襲和轉移[18]。Azuma等[19]研究發現，VK2通過激活類固醇和外源性受體（SXR）來抑制肝癌細胞的增殖和活力，而SXR是核受體激活不同的外源性和內源性化合物，主要表達于肝臟和小腸。Xia等[20]進一步研究其機制發現，VK2通過抑制PKCα-核因子 （NF）-κB和PKCs-PKD1-NF-κB兩條信號通路的激活，發揮其對肝癌細胞的抑制效應。有研究[21]表明，VK2可增加P53蛋白表達，而P53是抑癌基因，能夠誘導細胞周期靜止、DNA修復、不可逆生長停滯、終末分化和凋亡；同時通過caspase 8激活caspase3誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡。還有研究[7]表明，在肝癌細胞株HepG2、HuH-7和SK-Hep-1中，VK2通過抑制肝癌衍生生長因子（HDGF）表達來抑制細胞的生長，而HDGF被認為在肝癌的形成和進展中起重要作用。但關于VK2抑制肝癌細胞增殖和殺滅細胞活性的具體機制仍不清。
Zhang等[17]在對肝癌細胞株HepG2、Huh7、HLE和Hep3B的研究中發現，VK2可增強5-FU對肝癌細胞生長的抑制作用，其主要機制是VK2聯合5-FU可使肝癌細胞周期停止在G1期，VK2通過抑制5-FU誘導的NF-κB的激活和減少細胞周期蛋白D1的表達。因此，我們推測，對于5-FU耐藥的肝癌細胞可以聯合VK2治療。本研究從肝癌細胞株的體外實驗中證明，VK2聯合5-FU對其增殖、侵襲、轉移作用的研究結果發現，VK2聯合5-FU對肝癌細胞株PLC/RAF/5的增殖能力明顯抑制，聯合用藥時細胞存活率明顯低于5-FU組（P＜0.05），表明5-FU聯合VK2時對肝癌PLC/RAF/5細胞的增殖能力影響最大；細胞遷移實驗結果表明，VK2聯合5-FU組細胞遷移率（19.50±4.20） %）約為5-FU組遷移率 〔（37.50±6.46） %〕 的一半。同樣，細胞侵襲實驗結果也表明聯合用藥組侵襲細胞數目最低。
綜上，VK2聯合5-FU可抑制肝癌細胞株PLC/RAF/5的增殖、侵襲及轉移，為肝癌術后的輔助化療提供重要的體外實踐證據，可能具有重要的臨床研究價值。相信隨著對VK2聯合5-FU作用機理認識的深入，未來肝癌綜合治療的方案將進一步豐富。
原發性肝癌中肝細胞癌（以下簡稱肝癌） 占70%～85%，其是世界范圍內男性第5位、女性第7位的常見惡性腫瘤[1]。手術是目前最有效的治療方法，然而，但其術后復發及轉移率仍較高，術后預后較差[2]。盡管化學和分子靶向治療藥物用來抑制肝癌術后復發，但其效果仍然欠佳。因此，肝癌的化學預防治療策略逐漸成為熱點，以降低肝癌術后復發及改善其預后[3]。5-氟尿嘧啶（5-FU）已被用于肝癌的化療，然而其反應率較低（15%～20%） [4]。維生素K （VK）是脂溶性維生素，是人體血液凝固和鈣代謝所必須的[5]，其可以抑制肝癌細胞的生長[6]，而VK2類似物能預防肝癌術后復發，其原理在于抑制肝癌衍生生長因子表達，從而產生較強的抗血管效應[7]。因此，本研究將5-FU與VK2聯合，研究其對肝癌細胞株增殖、遷移及侵襲的影響，為肝癌術后的化療提供策略。
1 材料與方法
1.1 細胞株與主要材料
人肝癌細胞株PLC/RAF/5由中山大學附屬第一醫院外科實驗中心提供；DMEM 培養基、青霉素、鏈霉素購自Hyclone公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibico公司；VK2 （Menaquinone）購自上海聯碩生物科技有限公司，用乙醇配制成10-2 mol/L溶液儲存在-20 ℃冰箱中；5-FU購自南京凱基生物公司；CCK-8購自日本同仁化學研究所。
1.2 細胞培養及分組
用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，待其融合度達到80%以上時傳代，取對數期細胞實驗。根據培養基中所含藥物不同分為對照組（未加入任何藥物）、VK2（100 μmol/L） 組、 5-FU （10 μg/mL） 組、VK2 （100 μmol/L）與5-FU （10 μg/mL）聯合用藥組（簡稱VK2+5-FU組）。
1.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力
在96孔培養板內每孔鋪5 000個細胞，貼壁后各組分別加入相應的藥物，每組設4個復孔，同時設定只含培養基的空白對照。孵育24 h后吸去培養基，每孔加入180 μL不含血清培養基和20 μL CCK-8，繼續孵育2 h后采用酶聯免疫檢測儀測定490 nm處的吸光度（A） 值，去掉其最大值與最小值后取均數。細胞存活率（%） = （A實驗-A空白） / （A對照-A空白）×100%。
1.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力
每塊6孔板孔中加入約5×105個細胞，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養24 h。觀察細胞長滿孔底后用移液器槍頭比著直尺，照著背后的橫線垂直劃痕。再用PBS輕輕地洗細胞3次，去除漂浮及壞死細胞，最后各組分別加入含不同藥物的培養基，放入37 ℃、5% CO2培養箱培養。于0、24 h取樣，用倒置相差顯微鏡拍照并計數劃痕區域的細胞數，以未加藥組遷移細胞數為對照計算相對遷移百分率。
1.5 Matrigel侵襲小室法檢測細胞侵襲能力
用培養基稀釋Matrigel （2 : 1），均勻涂布于Tran-swell小室上室，在24孔板下室加入600 μL含10%血清的培養基。取1×105/mL細胞懸液100 μL加入Transwell小室中，各組分別加入含不同藥物的培養基，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中常規培養24 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養液，用PBS洗2遍，甲醇固定30 min，將小室適當風干。0.1%結晶紫染色20 min，用PBS洗3遍后晾干，移至載玻片上用中心樹膠分片。100倍顯微鏡下隨機觀察5個視野細胞并計數。
1.6 統計學方法
采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析。數據均采用均數±標準差（x±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析與LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 VK2和5-FU對PLC/RAF/5細胞增殖的影響
細胞增殖實驗結果顯示，對照組、VK2組、5-FU組及VK2+5-FU組的細胞存活率分別為100%、（88.00±5.72） %、 （47.75±6.60） %及 （35.75±4.35） %。經統計學分析，各組間細胞存活率比較差異有統計學意義（F=94.447，P＜0.05）；多重比較結果顯示，各組細胞存活率VK2組＞5-FU組＞VK2+5-FU組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖 1。VK2+5-FU組細胞存活率最低，結果提示，VK2和5-FU及聯合用藥均能有效抑制PLC/RAF/5細胞的增殖能力。
圖1
各組PLC/RAF/5細胞存活率比較；A：對照組；B：VK2組；C：5-FU 組；D：VK2+5-FU組。組間兩兩比較，*P＜0.05
2.2 VK2和5-FU 對PLC/RAF/5細胞遷移的影響
細胞劃痕實驗結果（圖 2、3）顯示，對照組兩側細胞24 h后融合即細胞遷移率為100%，VK2組、5-FU組及VK2+5-FU組的細胞遷移率分別為（81.00±2.58） %、 （37.50±6.46） %和 （19.50±4.20） %，經統計學分析，各組細胞遷移率比較差異有統計學意義（F=181.773，P＜0.05）；多重比較結果顯示，各組細胞遷移率VK2組＞5-FU組＞VK2+5-FU組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。VK2+5-FU組細胞遷移率最低，結果提示，VK2和5-FU以及聯合用藥均能有效抑制PLC/RAF/5細胞的遷移能力。
圖2
細胞劃痕實驗結果（ ×20）。2A：對照組；2B：VK2組；2C：5-FU組；2D：VK2+5-FU組
圖3
各組PLC/RAF/5細胞遷移率的比較 A：對照組；B：VK2組；C：5-FU 組；D：VK2+5-FU組。組間兩兩比較，*P＜0.05
2.3 VK2和5-FU 對PLC/RAF/5細胞侵襲的影響
Transwell小室侵襲實驗（圖 4、5）結果顯示，對照組、VK2組、5-FU組和VK2+5-FU聯合用藥組侵襲細胞數目分別為115±4、83±3、63±3、21±2，經統計學分析，各組侵襲細胞數目比較差異有統計學意義（F=650.982，P＜0.05）；多重比較結果顯示，各組侵襲細胞數目對照組＞VK2組＞5-FU組＞VK2+5-FU組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。VK2+5-FU組侵襲細胞數目最低，結果提示，VK2和5-FU以及聯合用藥均能抑制PLC/RAF/5細胞的侵襲能力。
圖4
Transwell小室侵襲實驗結果（ ×40）。4A：對照組；4B：VK2組；4C：5-FU組；4D：VK2+5-FU組
圖5
各組PLC/RAF/5細胞侵襲能力比較。A：對照組；B：VK2組；C：5-FU 組；D：VK2+5-FU組。組間兩兩比較，*P＜0.05
3 討論
盡管手術和射頻消融作為肝癌的有效治療手段，但是其術后的5年復發率在肝硬化肝癌患者中超過50%，而中晚期肝癌患者復發率接近75% [8]。肝癌術后復發的主要原因在于肝癌細胞的增殖、侵襲、轉移[9-10]。因此，肝癌術后有效治療或預防術后復發，對改善肝癌根治術后或射頻消融術后的長期生存有著重要的意義。
有許多研究探索新輔助化療或化療在預防肝癌術后復發中的作用，但目前臨床上仍沒有一種明確的獲益化療方案，也沒有一種推薦方案[11]。
5-FU作為抗腫瘤代謝的經典藥物，可以誘導細胞周期靜止和促進細胞凋亡，延緩S、G1期細胞的進程[12]，以5-FU為主的化療方案已嘗試應用于晚期肝癌以及肝癌術后復發、轉移的患者[13-14]。但是近年來由于肝癌細胞對5-FU的敏感性下降或耐藥性等因素，影響了5-FU抗癌療效的發揮[15]，其中細胞凋亡失控即過度增殖是導致對化療耐藥的根源[16]。
VK能夠抑制肝癌細胞的生長[6, 17]，其中VK2可使細胞周期靜止和促進細胞凋亡，可抑制肝癌細胞的侵襲和轉移[18]。Azuma等[19]研究發現，VK2通過激活類固醇和外源性受體（SXR）來抑制肝癌細胞的增殖和活力，而SXR是核受體激活不同的外源性和內源性化合物，主要表達于肝臟和小腸。Xia等[20]進一步研究其機制發現，VK2通過抑制PKCα-核因子 （NF）-κB和PKCs-PKD1-NF-κB兩條信號通路的激活，發揮其對肝癌細胞的抑制效應。有研究[21]表明，VK2可增加P53蛋白表達，而P53是抑癌基因，能夠誘導細胞周期靜止、DNA修復、不可逆生長停滯、終末分化和凋亡；同時通過caspase 8激活caspase3誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡。還有研究[7]表明，在肝癌細胞株HepG2、HuH-7和SK-Hep-1中，VK2通過抑制肝癌衍生生長因子（HDGF）表達來抑制細胞的生長，而HDGF被認為在肝癌的形成和進展中起重要作用。但關于VK2抑制肝癌細胞增殖和殺滅細胞活性的具體機制仍不清。
Zhang等[17]在對肝癌細胞株HepG2、Huh7、HLE和Hep3B的研究中發現，VK2可增強5-FU對肝癌細胞生長的抑制作用，其主要機制是VK2聯合5-FU可使肝癌細胞周期停止在G1期，VK2通過抑制5-FU誘導的NF-κB的激活和減少細胞周期蛋白D1的表達。因此，我們推測，對于5-FU耐藥的肝癌細胞可以聯合VK2治療。本研究從肝癌細胞株的體外實驗中證明，VK2聯合5-FU對其增殖、侵襲、轉移作用的研究結果發現，VK2聯合5-FU對肝癌細胞株PLC/RAF/5的增殖能力明顯抑制，聯合用藥時細胞存活率明顯低于5-FU組（P＜0.05），表明5-FU聯合VK2時對肝癌PLC/RAF/5細胞的增殖能力影響最大；細胞遷移實驗結果表明，VK2聯合5-FU組細胞遷移率（19.50±4.20） %）約為5-FU組遷移率 〔（37.50±6.46） %〕 的一半。同樣，細胞侵襲實驗結果也表明聯合用藥組侵襲細胞數目最低。
綜上，VK2聯合5-FU可抑制肝癌細胞株PLC/RAF/5的增殖、侵襲及轉移，為肝癌術后的輔助化療提供重要的體外實踐證據，可能具有重要的臨床研究價值。相信隨著對VK2聯合5-FU作用機理認識的深入，未來肝癌綜合治療的方案將進一步豐富。
