引用本文： 楊民, 李媛, 雷長江, 李磊, 馮加銳, 龔小軍, 楊銳. 磷脂酰肌醇蛋白多糖-3對Hippo信號通路的調控機制及其對肝癌Huh7細胞生物學行為的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(11): 1315-1320. doi: 10.7507/1007-9424.20160338 復制
我國是肝細胞癌（以下簡稱肝癌）的發病人數約占全球肝癌總發病人數的55%以上，而死亡率高達45% [1]。因此，了解肝癌的發病機制對靶向治療十分重要。腫瘤的形成是一個十分復雜的病理過程，通常伴隨著細胞的增殖和凋亡，并同時涉及多種細胞增殖凋亡相關基因的異常表達[2-3]。磷脂酰肌醇蛋白多糖-3 （GPC3）是一種癌胚蛋白，可通過調控細胞信號傳導通路促進肝癌的發生、發展[4-6]。Hippo信號通路是近年來新發現的一條細胞信號傳導通路，對細胞增殖和凋亡平衡具有關鍵調節作用[7-8]。YAP1是Hippo信號通路的核心效應因子，在正常機體細胞內發揮信號傳導和基因轉錄調節的作用，有關YAP1促進肝癌細胞增殖的作用已得到證實[9-10]。然而有關GPC3與Hippo信號通路的作用機制及其對肝癌細胞的影響，國內外鮮有報道。本研究通過RNA干擾技術構建GPC3 shRNA和YAP1 shRNA，以脂質體轉染的方式導入人肝癌細胞株Huh7，以觀察GPC3和YAP1對人肝癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
人肝癌Huh7細胞株，中科院上海細胞庫；DMEM高糖培養基，美國HyClone公司；胰蛋白酶，美國Invitrogen公司；胎牛血清（FBS），美國HyClone公司；T4 DNA連接酶，美國Ferments公司；Lipofecta-mine2000和Opti-MEM培養基，美國Invitrogen公司；質粒提取試劑盒，美國Qiagen公司；Trizol RNA提取試劑盒，美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒，美國ABI Applied Biosystems公司；PCR試劑盒，日本TaKaRa公司；兔抗人GPC3、YAP1一抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗以及ECL顯色試劑盒，美國Santa Cruz公司；Cell-LightTM EdU熒光顯微鏡檢測試劑盒，廣州銳博生物科技有限公司；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒，德國Bender公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養傳代
人肝癌Huh7細胞接種于DMEM高糖培養基（10% FBS、105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。 85% 融合時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代。取對數生長期的細胞用于后續實驗。
1.2.2 靶向GPC3和YAP1
shRNA重組質粒的構建參照文獻[11]，根據GPC3基因信息（GenBank，No.NM_001164617），委托上海生物工程技術服務有限公司合成4條與其他基因編碼序列無同源性的shRNA序列。shRNA形成DNA后與pGPU6/gfp/Neo載體連接，構建重組質粒。重組質粒轉化感受態DH5α大腸桿菌，提取質粒，委托上海生物工程技術服務有限公司測序鑒定。參照文獻[12]，根據YAP1基因信息（GenBank，No. NM_006106.2），構建干擾YAP1表達的重組質粒并進行測序鑒定。見表 1。
表1
GPC3和YAP1 shRNA序列
1.2.3 靶向GPC3和YAP1
shRNA重組質粒的轉染篩選 人肝癌Huh7細胞接種于6孔板后進行轉染實驗。A液：1 μg GPC3-shRNA用50 μL Opti-MEM稀釋，靜置10 min。B液：2 μL Lipofectamine2000用50 μL Opti-MEM稀釋，靜置10 min。混合A、B液，靜置20 min。取出培養的Huh7細胞，棄去原培養液并用無血清培養液漂洗，再加入1 mL無血清培養液和A與B的混合液，孵育6 h。6 h后，棄去轉染液，更換為完全培養基。培養72 h后，觀察細胞轉染情況。將轉染效率最高的重組質粒用于后續實驗。GPC3 shRNA重組質粒轉染實驗分為6組：① 未轉染組：細胞正常培養未進行轉染；② 空載體組：轉染未連接GPC3-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空載體；③ GPC3-714-shRNA組：轉染GPC3-714-shRNA重組質粒；④ GPC3-647-shRNA組：轉染GPC3-647-shRNA重組質粒；⑤ GPC3-1718-shRNA組：轉染GPC3-1718-shRNA重組質粒；⑥ GPC3-2134-shRNA組：轉染GPC3-2134-shRNA重組質粒。以相同方法進行YAP1 shRNA重組質粒轉染實驗，分為6組：① 未轉染組：細胞正常培養未進行轉染；② 空載體組：轉染未連接YAP1-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空載體；③ YAP1-906-shRNA組：轉染YAP1-906-shRNA重組質粒；④ YAP1-1363-shRNA組：轉染YAP1-1363-shRNA重組質粒；⑤ YAP1-1666-shRNA組：轉染YAP1-1666-shRNA重組質粒；⑥ YAP1-2895-shRNA組：轉染YAP1-2895-shRNA重組質粒。
1.2.4 GPC3對Hippo信號通路YAP1的調控
人肝癌Huh7細胞接種于6孔板后進行轉染實驗，分為5組：① 未轉染組：細胞正常培養未進行轉染；② 空載體組：轉染未連接GPC3-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空載體；③ GPC3-1718-shRNA組：轉染GPC3-1718-shRNA重組質粒；④ GPC3-1718-shRNA+rhYAP1組：轉染GPC3-1718-shRNA重組質粒，同時在細胞培養時加入了rhYAP1；⑤ YAP1-1666-shRNA組：轉染YAP1-1666-shRNA重組質粒。轉染72 h后，檢測各組細胞中YAP1 mRNA和蛋白表達。
1.2.5 熒光定量PCR法檢測GPC3
mRNA和YAP1 mRNA表達 Trizol 法提取總RNA，并逆轉錄成cDNA。參照文獻[13-14]，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成GPC3和YAP1引物。GPC3上游引物為5?-CGAGATAAGCACCTTTCACAACC-3?，下游引物為5?-AGAAGAAGCACACCACCGAGA-3?；PCR條件：95℃ 預變性30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火延伸45 s，共40個循環。YAP1上游引物為5?-AATGACGAC-CAATAGCTCAGATCC-3?，下游引物為5?-CACTGT-AGCTGCTCATGCTTAGTCC-3?；PCR條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火延伸31 s，共40個循環。采用2-ΔΔCT法分析GPC3和YAP1 mRNA的相對表達量。
1.2.6 蛋白印跡法檢測GPC3和YAP1蛋白表達
收集各組細胞，PBS淋洗后加入RIPA裂解液裂解，轉移至離心管，15 000 r/min （r=5 cm），離心30 min，取上清于-20 ℃保存備用。50 μg等量總蛋白上樣，經8% SDS-PAGE電泳分離，轉至PVDF膜，TBST淋洗3次，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入GPC3一抗，4 ℃孵育過夜；TBST淋洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h；TBST淋洗3次，DAB顯色。同理，檢測各組YAP1蛋白表達。
1.2.7 Edu細胞增殖檢測
Huh7細胞接種于96孔板，孵育24 h后，每孔加入100 μL的EdU溶液（50 μmol/L）。孵育2 h后棄去培養基，PBS洗滌，每孔加入100 μL 的4%多聚甲醛固定30 min。每孔加入2 mg/mL甘氨酸，振搖10 min后棄去溶液，PBS洗滌。每孔加入100 μL的1×Apollo?染色液，室溫避光振搖30 min，棄去染色液，PBS洗滌。每孔加入100 μL的1×Hoechst 33342反應液，室溫避光振搖30 min，棄去染色液，PBS洗滌。最后在熒光顯微鏡下觀察增殖細胞染色情況。
1.2.8 Transwell檢測細胞侵襲能力
Huh7細胞接種于自帶基質膠的Transwell小室上室，下室加入DMEM高糖培養基（10% FBS、105 U/L青霉素、100mg/L鏈霉素），37 ℃，5% CO2孵育12 h，棉簽擦去靠近基底膜內室的細胞，另一面細胞經10%甲醇固定，PBS洗滌，結晶紫染色，PBS洗滌，顯微鏡下觀察細胞并記數。
1.2.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡
將Huh7細胞接種于6孔板培養，轉染24 h后棄去培養基，以PBS淋洗，再用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集細胞以2 000 r/min （r=5 cm），離心10 min，棄上清。按Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作用流式細胞儀檢測。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0 統計學軟件分析所有數據。所有實驗數據均取5次實驗結果的平均值，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用One-Way ANOVO單因素方差分析，組內兩兩比較采用q檢驗，取雙側。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 靶向GPC3和YAP1 shRNA重組質粒的構建結果
構建的重組質粒GPC3-714-shRNA、GPC3-647-shRNA、GPC3-1718-shRNA、GPC3-2134-shRNA和YAP1-906-shRNA、YAP1-1363-shRNA、YAP1-1666-shRNA、YAP1-2895-shRNA送上海生物工程技術服務有限公司測序。測試結果證實重組質粒均構建成功。
2.2 靶向GPC3和YAP1 shRNA重組質粒的轉染篩選
GPC3 shRNA的轉染效率未轉染組為0，空載體組為39.5%，GPC3-714-shRNA組為57.3%；GPC3-647-shRNA組為66.5%，GPC3-1718-shRNA組為87.9%，GPC3-2134-shRNA組為68.9%。YAP1 shRNA的轉染效率未轉染組為0，空載體組為59.7%，YAP1-906-shRNA組為61.4%，YAP1-1363-shRNA組為56.7%，YAP1-1666-shRNA組為89.4%，YAP1-2895-shRNA組為73.8%。
2.3 各組細胞中GPC3 mRNA和蛋白以及YAP1 mRNA和蛋白表達結果
2.3.1 GPC3
mRNA和蛋白表達 GPC3 shRNA各轉染組GPC3 mRNA和蛋白表達均明顯低于未轉染組（P＜0.05）和空載體組（P＜0.05），而GPC3-1718-shRNA組GPC3 mRNA和蛋白表達明顯低于其他轉染組（P＜0.05）。說明GPC3 shRNA可沉默GPC3 mRNA和蛋白表達，尤以GPC3-1718-shRNA沉默效果最好，用于后續實驗。見表 2。
表2
各組細胞中GPC3 mRNA和GPC3蛋白表達結果（x±s）
2.3.2 YAP1
mRNA和蛋白表達 YAP1 shRNA各轉染組YAP1 mRNA和蛋白表達均明顯低于未轉染組（P＜0.05）和空載體組（P＜0.05），而YAP1-1666-shRNA組YAP1 mRNA和蛋白表達明顯低于其他轉染組（P＜0.05）。說明YAP1 shRNA可沉默YAP1 mRNA和蛋白表達，尤以YAP1-1666-shRNA沉默效果最好，用于后續實驗。見表 3。
表3
各組細胞中YAP1 mRNA和YAP1蛋白表達結果（x±s）
2.4 GPC3對Hippo信號通路YAP1的調控下各組細胞YAP1 mRNA和蛋白表達結果
GPC3-1718-shRNA組和YAP1-1666-shRNA組細胞YAP1 mRNA和蛋白表達明顯低于未轉染組（P＜0.05）和空載體組（P＜0.05）。GPC3-1718-shRNA+rhYAP1組YAP1 mRNA和蛋白表達明顯高于GPC3-1718-shRNA組（P＜0.05）和YAP1-1666-shRNA組（P＜0.05）。
說明rhYAP1可明顯逆轉由GPC3-1718-shRNA引起的YAP1表達下降（P＜0.05）。見表 4。
表4
GPC3對Hippo信號通路YAP1的調控下YAP1 mRNA和YAP1蛋白表達結果（x±s）
2.5 GPC3及Hippo信號通路YAP1對Huh7細胞
生物學行為的影響將轉染效率最高的GPC3-1718-shRNA通過脂質體轉染導入人肝癌Huh7細胞，結果顯示，與空載體組和未轉染組比較，沉默GPC3可抑制Huh7細胞的增殖（P＜0.05）和侵襲（P＜0.05）并促進其凋亡（P＜0.05），而rhYAP1可明顯抑制因沉默GPC3基因表達而引起的細胞凋亡（P＜0.05）并促進Huh7細胞的增殖（P＜0.05）和侵襲（P＜0.05）。將YAP1-1666-shRNA導入Huh7細胞，結果顯示，在GPC3正常表達而單獨沉默YAP1的情況下，也能夠抑制Huh-7細胞的增殖（P＜0.05）和侵襲（P＜0.05）并促進其凋亡（P＜0.05）。說明GPC3很有可能通過對Hippo信號通路YAP1的調控實現其對Huh7細胞生物學行為的影響。見表 5。
表5
GPC3和YAP1對Huh7 細胞增殖、侵襲及凋亡的影響（x±s）
3 討論
由于肝癌的惡性度高、預后差、死亡率高等特點，因此，早期診斷和治療對延長肝癌患者生存時間、提高生活質量具有十分重要的意義[15]。
GPC3是細胞表面跨膜糖蛋白受體的一種，目前認為GPC3的硫酸乙酰肝素鏈與大量生物效應分子（如生長因子及其受體、細胞外基質蛋白、黏附分子等）相互作用，從而調節細胞增殖、分化、黏附、遷移等，還可能參與抑制或調節大部分中胚層組織和器官的生長[16-17]。大量研究[18-20]證實，正常肝細胞中未見GPC3表達，而肝癌細胞中出現GPC3高表達情況。我們之前的研究[11]發現，GPC3 mRNA在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達率分別為77.1% （37/48）、2.6% （1/39）和0 （0/31）；GPC3蛋白在直徑≤5 cm的肝癌組織中的表達率為52.6% （10/19），而在直徑＞5 cm的肝癌組織中表達率上升至86.2% （25/29）。因此，可推測GPC3與肝癌的發生、發展有關。
目前，國內外已有關于GPC3通過調控細胞信號傳導通路促進肝癌發生、發展的報道。Capurro等[21]發現，GPC3可通過刺激經典的Wnt/β-Catenin信號通路促進肝癌細胞的增殖，GPC3能夠與Wnt結合形成復合物，通過Wnt與受體的作用來進行自身信息的表達，復合物產生的Wnt信號能夠引起肝癌相關基因的表達，最后產生腫瘤。Midorikawa等[22]發現，GPC3能夠與成纖維細胞生長因子-2相結合，從而達到抑制成纖維細胞生長因子-2促進肝癌的發生、發展。Cheng等[23]認為，GPC3能夠通過胰島素樣生長因子2信號途徑刺激肝癌組織生長。然而，有關GPC3與Hippo信號通路的作用和機制及其對肝癌細胞的影響，國內外鮮有報道。有關YAP1與肝癌之間的關系已得到證實。Huo等[24]發現，通過siRNA干擾YAP1表達可促進肝癌細胞凋亡。我們之前的研究[25]也顯示，通過miR-132靶向抑制YAP表達可明顯抑制肝癌細胞的生長。
因此我們提出假說，GPC3有可能通過Hippo通路YAP1對肝癌細胞的生長進行調控。為驗證假說，本研究設計如下實驗：首先，構建靶向GPC3 shRNA和YAP1 shRNA，分別成功篩選出可有效沉默GPC3基因和YAP1基因的GPC3-1718-shRNA和YAP1-1666-shRNA質粒。然后將GPC3-1718-shRNA或YAP1-1666-shRNA轉染導入Huh7細胞，發現肝癌細胞中GPC3 mRNA和蛋白表達均明顯降低（P＜0.05），同時YAP1 mRNA和蛋白的表達也明顯下降（P＜0.05），然而rhYAP1可明顯抑制由GPC3沉默引起的YAP1 mRNA和蛋白表達的下降（P＜0.05）。最后，沉默GPC3可抑制Huh7細胞的增殖和侵襲并促進其凋亡（P＜0.05）；rhYAP1可明顯抑制因沉默GPC3基因表達而引起的細胞凋亡（P＜0.05）；在GPC3正常表達，而單獨沉默YAP1的情況下，也能夠明顯抑制Huh7細胞的增殖和侵襲（P＜0.05）。本實驗結果提示，GPC3很有可能通過對Hippo信號通路YAP1的調控實現其對Huh7細胞生物學行為的影響。
由于惡性腫瘤的發生、發展通常伴隨著細胞增殖和凋亡，并同時涉及多種細胞增殖、凋亡相關基因的異常表達。因此，對調控細胞增殖凋亡基因的深入研究，對揭示腫瘤發病機制及治療方面均具有重要意義。
我國是肝細胞癌（以下簡稱肝癌）的發病人數約占全球肝癌總發病人數的55%以上，而死亡率高達45% [1]。因此，了解肝癌的發病機制對靶向治療十分重要。腫瘤的形成是一個十分復雜的病理過程，通常伴隨著細胞的增殖和凋亡，并同時涉及多種細胞增殖凋亡相關基因的異常表達[2-3]。磷脂酰肌醇蛋白多糖-3 （GPC3）是一種癌胚蛋白，可通過調控細胞信號傳導通路促進肝癌的發生、發展[4-6]。Hippo信號通路是近年來新發現的一條細胞信號傳導通路，對細胞增殖和凋亡平衡具有關鍵調節作用[7-8]。YAP1是Hippo信號通路的核心效應因子，在正常機體細胞內發揮信號傳導和基因轉錄調節的作用，有關YAP1促進肝癌細胞增殖的作用已得到證實[9-10]。然而有關GPC3與Hippo信號通路的作用機制及其對肝癌細胞的影響，國內外鮮有報道。本研究通過RNA干擾技術構建GPC3 shRNA和YAP1 shRNA，以脂質體轉染的方式導入人肝癌細胞株Huh7，以觀察GPC3和YAP1對人肝癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
人肝癌Huh7細胞株，中科院上海細胞庫；DMEM高糖培養基，美國HyClone公司；胰蛋白酶，美國Invitrogen公司；胎牛血清（FBS），美國HyClone公司；T4 DNA連接酶，美國Ferments公司；Lipofecta-mine2000和Opti-MEM培養基，美國Invitrogen公司；質粒提取試劑盒，美國Qiagen公司；Trizol RNA提取試劑盒，美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒，美國ABI Applied Biosystems公司；PCR試劑盒，日本TaKaRa公司；兔抗人GPC3、YAP1一抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗以及ECL顯色試劑盒，美國Santa Cruz公司；Cell-LightTM EdU熒光顯微鏡檢測試劑盒，廣州銳博生物科技有限公司；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒，德國Bender公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養傳代
人肝癌Huh7細胞接種于DMEM高糖培養基（10% FBS、105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。 85% 融合時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代。取對數生長期的細胞用于后續實驗。
1.2.2 靶向GPC3和YAP1
shRNA重組質粒的構建參照文獻[11]，根據GPC3基因信息（GenBank，No.NM_001164617），委托上海生物工程技術服務有限公司合成4條與其他基因編碼序列無同源性的shRNA序列。shRNA形成DNA后與pGPU6/gfp/Neo載體連接，構建重組質粒。重組質粒轉化感受態DH5α大腸桿菌，提取質粒，委托上海生物工程技術服務有限公司測序鑒定。參照文獻[12]，根據YAP1基因信息（GenBank，No. NM_006106.2），構建干擾YAP1表達的重組質粒并進行測序鑒定。見表 1。
表1
GPC3和YAP1 shRNA序列
1.2.3 靶向GPC3和YAP1
shRNA重組質粒的轉染篩選 人肝癌Huh7細胞接種于6孔板后進行轉染實驗。A液：1 μg GPC3-shRNA用50 μL Opti-MEM稀釋，靜置10 min。B液：2 μL Lipofectamine2000用50 μL Opti-MEM稀釋，靜置10 min。混合A、B液，靜置20 min。取出培養的Huh7細胞，棄去原培養液并用無血清培養液漂洗，再加入1 mL無血清培養液和A與B的混合液，孵育6 h。6 h后，棄去轉染液，更換為完全培養基。培養72 h后，觀察細胞轉染情況。將轉染效率最高的重組質粒用于后續實驗。GPC3 shRNA重組質粒轉染實驗分為6組：① 未轉染組：細胞正常培養未進行轉染；② 空載體組：轉染未連接GPC3-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空載體；③ GPC3-714-shRNA組：轉染GPC3-714-shRNA重組質粒；④ GPC3-647-shRNA組：轉染GPC3-647-shRNA重組質粒；⑤ GPC3-1718-shRNA組：轉染GPC3-1718-shRNA重組質粒；⑥ GPC3-2134-shRNA組：轉染GPC3-2134-shRNA重組質粒。以相同方法進行YAP1 shRNA重組質粒轉染實驗，分為6組：① 未轉染組：細胞正常培養未進行轉染；② 空載體組：轉染未連接YAP1-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空載體；③ YAP1-906-shRNA組：轉染YAP1-906-shRNA重組質粒；④ YAP1-1363-shRNA組：轉染YAP1-1363-shRNA重組質粒；⑤ YAP1-1666-shRNA組：轉染YAP1-1666-shRNA重組質粒；⑥ YAP1-2895-shRNA組：轉染YAP1-2895-shRNA重組質粒。
1.2.4 GPC3對Hippo信號通路YAP1的調控
人肝癌Huh7細胞接種于6孔板后進行轉染實驗，分為5組：① 未轉染組：細胞正常培養未進行轉染；② 空載體組：轉染未連接GPC3-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空載體；③ GPC3-1718-shRNA組：轉染GPC3-1718-shRNA重組質粒；④ GPC3-1718-shRNA+rhYAP1組：轉染GPC3-1718-shRNA重組質粒，同時在細胞培養時加入了rhYAP1；⑤ YAP1-1666-shRNA組：轉染YAP1-1666-shRNA重組質粒。轉染72 h后，檢測各組細胞中YAP1 mRNA和蛋白表達。
1.2.5 熒光定量PCR法檢測GPC3
mRNA和YAP1 mRNA表達 Trizol 法提取總RNA，并逆轉錄成cDNA。參照文獻[13-14]，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成GPC3和YAP1引物。GPC3上游引物為5?-CGAGATAAGCACCTTTCACAACC-3?，下游引物為5?-AGAAGAAGCACACCACCGAGA-3?；PCR條件：95℃ 預變性30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火延伸45 s，共40個循環。YAP1上游引物為5?-AATGACGAC-CAATAGCTCAGATCC-3?，下游引物為5?-CACTGT-AGCTGCTCATGCTTAGTCC-3?；PCR條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火延伸31 s，共40個循環。采用2-ΔΔCT法分析GPC3和YAP1 mRNA的相對表達量。
1.2.6 蛋白印跡法檢測GPC3和YAP1蛋白表達
收集各組細胞，PBS淋洗后加入RIPA裂解液裂解，轉移至離心管，15 000 r/min （r=5 cm），離心30 min，取上清于-20 ℃保存備用。50 μg等量總蛋白上樣，經8% SDS-PAGE電泳分離，轉至PVDF膜，TBST淋洗3次，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入GPC3一抗，4 ℃孵育過夜；TBST淋洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h；TBST淋洗3次，DAB顯色。同理，檢測各組YAP1蛋白表達。
1.2.7 Edu細胞增殖檢測
Huh7細胞接種于96孔板，孵育24 h后，每孔加入100 μL的EdU溶液（50 μmol/L）。孵育2 h后棄去培養基，PBS洗滌，每孔加入100 μL 的4%多聚甲醛固定30 min。每孔加入2 mg/mL甘氨酸，振搖10 min后棄去溶液，PBS洗滌。每孔加入100 μL的1×Apollo?染色液，室溫避光振搖30 min，棄去染色液，PBS洗滌。每孔加入100 μL的1×Hoechst 33342反應液，室溫避光振搖30 min，棄去染色液，PBS洗滌。最后在熒光顯微鏡下觀察增殖細胞染色情況。
1.2.8 Transwell檢測細胞侵襲能力
Huh7細胞接種于自帶基質膠的Transwell小室上室，下室加入DMEM高糖培養基（10% FBS、105 U/L青霉素、100mg/L鏈霉素），37 ℃，5% CO2孵育12 h，棉簽擦去靠近基底膜內室的細胞，另一面細胞經10%甲醇固定，PBS洗滌，結晶紫染色，PBS洗滌，顯微鏡下觀察細胞并記數。
1.2.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡
將Huh7細胞接種于6孔板培養，轉染24 h后棄去培養基，以PBS淋洗，再用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集細胞以2 000 r/min （r=5 cm），離心10 min，棄上清。按Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作用流式細胞儀檢測。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0 統計學軟件分析所有數據。所有實驗數據均取5次實驗結果的平均值，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用One-Way ANOVO單因素方差分析，組內兩兩比較采用q檢驗，取雙側。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 靶向GPC3和YAP1 shRNA重組質粒的構建結果
構建的重組質粒GPC3-714-shRNA、GPC3-647-shRNA、GPC3-1718-shRNA、GPC3-2134-shRNA和YAP1-906-shRNA、YAP1-1363-shRNA、YAP1-1666-shRNA、YAP1-2895-shRNA送上海生物工程技術服務有限公司測序。測試結果證實重組質粒均構建成功。
2.2 靶向GPC3和YAP1 shRNA重組質粒的轉染篩選
GPC3 shRNA的轉染效率未轉染組為0，空載體組為39.5%，GPC3-714-shRNA組為57.3%；GPC3-647-shRNA組為66.5%，GPC3-1718-shRNA組為87.9%，GPC3-2134-shRNA組為68.9%。YAP1 shRNA的轉染效率未轉染組為0，空載體組為59.7%，YAP1-906-shRNA組為61.4%，YAP1-1363-shRNA組為56.7%，YAP1-1666-shRNA組為89.4%，YAP1-2895-shRNA組為73.8%。
2.3 各組細胞中GPC3 mRNA和蛋白以及YAP1 mRNA和蛋白表達結果
2.3.1 GPC3
mRNA和蛋白表達 GPC3 shRNA各轉染組GPC3 mRNA和蛋白表達均明顯低于未轉染組（P＜0.05）和空載體組（P＜0.05），而GPC3-1718-shRNA組GPC3 mRNA和蛋白表達明顯低于其他轉染組（P＜0.05）。說明GPC3 shRNA可沉默GPC3 mRNA和蛋白表達，尤以GPC3-1718-shRNA沉默效果最好，用于后續實驗。見表 2。
表2
各組細胞中GPC3 mRNA和GPC3蛋白表達結果（x±s）
2.3.2 YAP1
mRNA和蛋白表達 YAP1 shRNA各轉染組YAP1 mRNA和蛋白表達均明顯低于未轉染組（P＜0.05）和空載體組（P＜0.05），而YAP1-1666-shRNA組YAP1 mRNA和蛋白表達明顯低于其他轉染組（P＜0.05）。說明YAP1 shRNA可沉默YAP1 mRNA和蛋白表達，尤以YAP1-1666-shRNA沉默效果最好，用于后續實驗。見表 3。
表3
各組細胞中YAP1 mRNA和YAP1蛋白表達結果（x±s）
2.4 GPC3對Hippo信號通路YAP1的調控下各組細胞YAP1 mRNA和蛋白表達結果
GPC3-1718-shRNA組和YAP1-1666-shRNA組細胞YAP1 mRNA和蛋白表達明顯低于未轉染組（P＜0.05）和空載體組（P＜0.05）。GPC3-1718-shRNA+rhYAP1組YAP1 mRNA和蛋白表達明顯高于GPC3-1718-shRNA組（P＜0.05）和YAP1-1666-shRNA組（P＜0.05）。
說明rhYAP1可明顯逆轉由GPC3-1718-shRNA引起的YAP1表達下降（P＜0.05）。見表 4。
表4
GPC3對Hippo信號通路YAP1的調控下YAP1 mRNA和YAP1蛋白表達結果（x±s）
2.5 GPC3及Hippo信號通路YAP1對Huh7細胞
生物學行為的影響將轉染效率最高的GPC3-1718-shRNA通過脂質體轉染導入人肝癌Huh7細胞，結果顯示，與空載體組和未轉染組比較，沉默GPC3可抑制Huh7細胞的增殖（P＜0.05）和侵襲（P＜0.05）并促進其凋亡（P＜0.05），而rhYAP1可明顯抑制因沉默GPC3基因表達而引起的細胞凋亡（P＜0.05）并促進Huh7細胞的增殖（P＜0.05）和侵襲（P＜0.05）。將YAP1-1666-shRNA導入Huh7細胞，結果顯示，在GPC3正常表達而單獨沉默YAP1的情況下，也能夠抑制Huh-7細胞的增殖（P＜0.05）和侵襲（P＜0.05）并促進其凋亡（P＜0.05）。說明GPC3很有可能通過對Hippo信號通路YAP1的調控實現其對Huh7細胞生物學行為的影響。見表 5。
表5
GPC3和YAP1對Huh7 細胞增殖、侵襲及凋亡的影響（x±s）
3 討論
由于肝癌的惡性度高、預后差、死亡率高等特點，因此，早期診斷和治療對延長肝癌患者生存時間、提高生活質量具有十分重要的意義[15]。
GPC3是細胞表面跨膜糖蛋白受體的一種，目前認為GPC3的硫酸乙酰肝素鏈與大量生物效應分子（如生長因子及其受體、細胞外基質蛋白、黏附分子等）相互作用，從而調節細胞增殖、分化、黏附、遷移等，還可能參與抑制或調節大部分中胚層組織和器官的生長[16-17]。大量研究[18-20]證實，正常肝細胞中未見GPC3表達，而肝癌細胞中出現GPC3高表達情況。我們之前的研究[11]發現，GPC3 mRNA在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達率分別為77.1% （37/48）、2.6% （1/39）和0 （0/31）；GPC3蛋白在直徑≤5 cm的肝癌組織中的表達率為52.6% （10/19），而在直徑＞5 cm的肝癌組織中表達率上升至86.2% （25/29）。因此，可推測GPC3與肝癌的發生、發展有關。
目前，國內外已有關于GPC3通過調控細胞信號傳導通路促進肝癌發生、發展的報道。Capurro等[21]發現，GPC3可通過刺激經典的Wnt/β-Catenin信號通路促進肝癌細胞的增殖，GPC3能夠與Wnt結合形成復合物，通過Wnt與受體的作用來進行自身信息的表達，復合物產生的Wnt信號能夠引起肝癌相關基因的表達，最后產生腫瘤。Midorikawa等[22]發現，GPC3能夠與成纖維細胞生長因子-2相結合，從而達到抑制成纖維細胞生長因子-2促進肝癌的發生、發展。Cheng等[23]認為，GPC3能夠通過胰島素樣生長因子2信號途徑刺激肝癌組織生長。然而，有關GPC3與Hippo信號通路的作用和機制及其對肝癌細胞的影響，國內外鮮有報道。有關YAP1與肝癌之間的關系已得到證實。Huo等[24]發現，通過siRNA干擾YAP1表達可促進肝癌細胞凋亡。我們之前的研究[25]也顯示，通過miR-132靶向抑制YAP表達可明顯抑制肝癌細胞的生長。
因此我們提出假說，GPC3有可能通過Hippo通路YAP1對肝癌細胞的生長進行調控。為驗證假說，本研究設計如下實驗：首先，構建靶向GPC3 shRNA和YAP1 shRNA，分別成功篩選出可有效沉默GPC3基因和YAP1基因的GPC3-1718-shRNA和YAP1-1666-shRNA質粒。然后將GPC3-1718-shRNA或YAP1-1666-shRNA轉染導入Huh7細胞，發現肝癌細胞中GPC3 mRNA和蛋白表達均明顯降低（P＜0.05），同時YAP1 mRNA和蛋白的表達也明顯下降（P＜0.05），然而rhYAP1可明顯抑制由GPC3沉默引起的YAP1 mRNA和蛋白表達的下降（P＜0.05）。最后，沉默GPC3可抑制Huh7細胞的增殖和侵襲并促進其凋亡（P＜0.05）；rhYAP1可明顯抑制因沉默GPC3基因表達而引起的細胞凋亡（P＜0.05）；在GPC3正常表達，而單獨沉默YAP1的情況下，也能夠明顯抑制Huh7細胞的增殖和侵襲（P＜0.05）。本實驗結果提示，GPC3很有可能通過對Hippo信號通路YAP1的調控實現其對Huh7細胞生物學行為的影響。
由于惡性腫瘤的發生、發展通常伴隨著細胞增殖和凋亡，并同時涉及多種細胞增殖、凋亡相關基因的異常表達。因此，對調控細胞增殖凋亡基因的深入研究，對揭示腫瘤發病機制及治療方面均具有重要意義。
