引用本文： 成正軍, 何中林. PTEN在膿毒血癥患者外周血單個核細胞的表達及其意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(10): 1243-1248. doi: 10.7507/1007-9424.20160319 復制
膿毒血癥（sepsis）病情兇險，病死率極高，是普通外科感染性疾病（如重癥膽管炎、蜂窩織炎、膿腫等），可引發全身炎性反應綜合征及繼發多器官功能衰竭[1-2]。目前研究[3-4]認為，在膿毒血癥啟動階段，腸道細菌及脂多糖（LPS）移位、炎癥介質紊亂等發揮關鍵性作用，并促進病情持續惡化。通常，細菌和LPS移位至外周血后，即可被固有免疫系統中的免疫細胞識別，并激活其表面Toll受體家族（TLRs），繼而繼續激活下游核因子κB（nuclear fator κB，NF-κB），產生大量的促炎因子如腫瘤壞死因子-α（tumor nec-rosis factor-α，TNF-α）等，打破體內炎癥介質平衡，對機體重要器官形成“雙重打擊” [5-6]。
NF-κB作為轉錄因子，包括Rel、p65、RelB、p50和p52這5個亞單位，而且通過不同的二聚體的形式對不同基因的表達進行精細調節[7]。p65與p50異二聚體是NF-κB最常見的組合方式，細胞在靜息狀態下，NF-κB與錨釘在NF-κB多聚體上的核轉錄因子κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB）形成復合體[8]。當細胞受LPS刺激后，IκB激酶將IκB磷酸化和降解后，可促使NF-κB迅速入核，進一步誘導TNF-α等促炎因子的轉錄和表達[9]。因此，阻斷IκB磷酸化降解過程，可限制細菌或LPS誘導的炎癥反應，對平衡體內炎癥介質具有重要的意義。而新近有文獻[10-11]報道，磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology deletedon chromosome ten，PTEN）在體外炎癥模型中具有降低促炎因子分泌的作用，且與抑制NF-κB表達密切相關。但是，在膿毒血癥休克患者中，PTEN是否參與到細菌和LPS移位至外周血，并通過磷酸化降解IκB調控NF-κB通路以降低體內炎癥反應，目前尚無報道。因此，本研究擬檢測PTEN在急性梗阻性化膿性膽管炎（acute obstructive suppurative cholangitis，AOSC）患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的表達變化，并探討其在AOSC中對NF-κB通路激活的作用。
1 資料和方法
1.1 研究對象
1.1.1 病例來源
均選自2013年9月至2015年9月期間重慶市九龍坡區第二人民醫院普通外科及重慶市第九人民醫院普外一科收治并被診斷為AOSC的患者25例作為研究對象，男10例，女15例；年齡（38.92±13.71）歲。診斷以入院磁共振胰膽管成像（magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP）或計算機斷層掃描（computed tomography，CT）檢查以及結合臨床表現和血清學檢測結果為準，診斷均由兩位具有10年以上肝膽外科經驗的副主任醫師共同決定。診斷標準參考2013版《東京指南》 [12]。同時選取同期至重慶市九龍坡區第二人民醫院普通外科及重慶市第九人民醫院普外一科體檢的健康自愿者15例作為正常對照組，男7例，女8例；年齡（37.54±9.62）歲。
1.1.2 病例入選標準
①重慶市九龍坡區第二人民醫院普通外科及重慶市第九人民醫院普外一科收治診斷為AOSC患者，年齡 < 70歲；②有膽管炎及膽總管梗阻病理基礎，符合膽總管引流術指正；③符合中國嚴重膿毒癥-膿毒性休克治療指南（2014）診斷標準[13]；④此次發病前未接受任何抗感染治療及解除膽管梗阻治療。
1.1.3 病例排除標準
①符合入選標準但拒絕研究安排患者；②年齡 > 70歲；③引起膽管炎或膽管梗阻為腫瘤或先天性硬化性膽管炎；④入院前已經接受抗感染及解除膽管梗阻治療；⑤有心臟等重大器官器質性疾病等手術禁忌證，接受膽管穿刺或膽道手術存在巨大風險。
1.1.4 病例治愈標準
①此次膽管梗阻得以解除；②無膽管梗阻和膿毒血癥的臨床癥狀，即體溫、脈搏、血壓、意識、尿量、血氧飽和度等恢復正常，無腹痛、黃疸等；③血液學檢查指標如白細胞計數及血小板計數正常，膽紅素、PTT、C反應蛋白等恢復正常水平。
1.2 主要試劑、材料及設備
外周血單個核細胞分離液試劑盒（LDS1075）購買于天津灝洋生物公司；總RNA提取試劑盒（CW0597）購買于北京康為世紀公司；RNA逆轉錄試劑盒（RR047a）和cDNA擴增試劑盒（（RR820L）均購買于Takara公司；BCA試劑盒、小鼠抗β-actin抗體（1 : 250，BM0627）、羊抗兔IgG-HRP（1 : 2 000，BM0627）、羊抗小鼠IgG-HRP（1 : 2 000，BA1051）、人TNF-α試劑盒（EK0525）和人IL-10試劑盒檢測（EK0416）均購買于武漢博士德生物科技公司；兔抗PTEN抗體（1 : 500，sc-9145）、兔抗磷酸化磷酸酶和張力蛋白同源物（p-PTEN，1 : 500，sc-31714）、小鼠抗IκB抗體（1 : 500，sc-135945）、兔抗p-IκB（磷酸化核轉錄因子κB抑制因子）抗體（1 : 500，sc-101705）和兔抗NF-κB P65抗體（1 : 500，sc-109）均購買于Santa Cruz公司；人LPS試劑盒（xy-0784E）購買于上海信裕生物。
1.3 PBMC的分離
入組患者簽署知情同意書后分別于治療前1 h及治愈后1周抽取外周靜脈血10 mL，收集血清用于酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，剩余血細胞采用外周血單個核細胞分離液試劑分離PBMC，得到的PBMC繼續用于蛋白印跡法（Western blot法）和實時熒光定量聚合酶鏈反應法（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測。正常對照組在體檢結束時抽取外周靜脈血10 mL并根據上述方法分離PBMC進行相同檢測。
1.4 qRT-PCR檢測PTEN、IκB和NF-κB P65的mRNA表達
提取PBMC總RNA，按照總RNA提取試劑盒說明書操作，用SYBR? Green法[14]行RNA逆轉錄和用Premix Ex TaqⅡ法[15]行SYBR PCR反應。最后以2-△△Ct=2-[(Ct目的-Ct內參）實驗組-（Ct目的-Ct內參）對照組]對PBMC中PTEN、IκB和NF-κB P65的mRNA表達進行半定量分析。表 1為目的基因的引物序列及大小，引物由上海生工生物公司合成。
表1
目的分子引物設計
1.5 Western blot法檢測PTEN、IκB和NF-κB P65的蛋白表達和磷酸化水平
首先提取PBMC總蛋白并用BCA法測得蛋白含量，按每個樣本50 μg的蛋白質上樣，按每孔等質量等體積加入，應用Western blot法檢測PBMC中PTEN、IκB和NF-κB P65的蛋白表達和磷酸化水平（p-PTEN和p-IκB蛋白表達），并應用Image Lab軟件掃描目的條帶和相應的β-actin條帶，并測量其灰度值；然后將目的條帶的灰度值與β-actin的灰度值進行比較，所得的比值為目的蛋白的相對蛋白表達量。
1.6 ELISA檢測血清中LPS、TNF-α和IL-10的含量
收集2組研究對象各時相的血清，分別用人LPS試劑盒、人TNF-α試劑盒和人IL-10試劑盒檢測檢測LPS、TNF-α和IL-10的含量。
1.7 統計學方法
采用SPSS 18.0軟件分析。計量資料數據均以均數±標準差（x±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用t檢驗；計數資料比較采用卡方檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 患者一般情況及術后并發癥發生情況
25例AOSC患者的發病時間為（6.523±3.122）d（3 h～12 d）；合并心功能不全1例，肺功能不全1例，乙肝肝硬變2例，腎功能不全1例。既往有膽道病史23例，膽道手術史9例；伴發熱或寒戰22例，黃疸24例，上腹痛25例；20例有典型的Charcot三聯征表現，16例有Reynold五聯征表現。患者均有炎癥反應證據（白細胞計數、C反應蛋白或降鈣素原異常）和肝功能異常。因膽囊結石繼發膽總管結石17例，其中Mirziz綜合征3例；肝膽管結石5例，其中肝內外膽管結石3例，肝內膽管結石2例；單純膽管良性狹窄2例；膽總管下端擴張1例，經手術及抗感染治療患者得以治愈。AOSC組患者入院后治療前的主要炎癥指標白細胞計數、C反應蛋白，降鈣素酶原以及肝功能指標谷丙轉氨酶和總膽紅素水平均明顯高于正常對照組（P < 0.05），治愈后1周時炎癥指標和肝功能指標明顯下降并接近正常水平，具體見表 2。
表2
AOSC組和正常對照組的一般情況
AOSC組25例患者接受治療后均無死亡病例，住院時間（11.4±1.8）d（9～16 d）；其中14例行膽總管切開取石術+T管引流術，6例行膽管穿刺術，3例行膽腸吻合術，2例行肝葉切除術。術后均給予抗炎、保肝、營養支持及補液治療。術后有5例患者出現手術相關嚴重并發癥，其中肺炎2例，調整抗生素后痊愈；肝斷面積液伴感染1例，行穿刺引流術后痊愈；膽汁滲漏2例，保守治療后停止。所有患者痊愈1周后均行MRCP、CT或T管照影檢查以確定此次梗阻已完全解除，且復查相關血清學指標正常。
2.2 血清LPS、TNF-α和IL-10檢測結果
AOSC組患者治療前血清中LPS及促炎因子TNF-α水平均明顯高于正常對照組（P < 0.05），經手術及抗感染治療患者得以治愈，治愈后1周時血清中LPS及TNF-α水平均降至正常水平，與正常對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；AOSC組患者治療前抗炎因子IL-10水平明顯高于正常對照組（P < 0.05），而治愈后1周時其水平也明顯下降，但仍略高于正常對照組，其差異無統計學意義（P > 0.05）。具體見圖 1。以上結果提示，AOSC患者感染期腸道LPS可移位至外周血中，激活炎癥信號通路，破壞了機體促炎因子和抗炎因子的平衡。
圖1
示2組患者血清中LPS（1A）、TNF-α（1B）和IL-10（1C）檢測結果。AOSC組治療前與治療后及正常對照組比較，* P < 0.05
2.3 PBMC中PTEN、IκB和NF-κB P65基因和蛋白表達及磷酸化水平檢測結果
結果見圖 2及圖 3。由圖 2和圖 3可見，AOSC患者治療前PBMC中PTEN mRNA和蛋白的表達量均明顯低于正常對照組（P < 0.05），經過治療后，PTEN的mRNA和蛋白表達恢復正常水平；而PBMC中的PTEN磷酸化水平在AOSC患者治療前升高，但在正常對照組和AOSC組患者治愈后1周時其處于低水平（P < 0.05）。PBMC中IκB基因和蛋白表達的變化趨勢與PTEN相似，而IκB磷酸化水平的變化趨勢與PTEN磷酸化水平相似。PBMC中NF-κB P65基因及蛋白在AOSC患者治療前表達升高（P < 0.05），而在治愈后1周時下降至正常水平。以上結果提示，膿毒血癥發生時，PBMC中的PTEN可能參與調控NF-κB信號通路的激活過程。
圖2
示PBMC中PTEN、p-PTEN、IκB、p-IκB和NF-κB P65蛋白表達電泳圖
圖3
示PTEN、IκB和NF-κB P65基因和蛋白表達及磷酸化水平檢測結果。3A：PTEN、IκB及NF-κB P65 mRNA表達；3B：PTEN蛋白表達；3C：p-PTEN蛋白表達；3D：IκB蛋白表達；3E：p-IκB蛋白表達；3F：NF-κB P65蛋白表達；AOSC組治療前與治療后及正常對照組比較，*P < 0.05
3 討論
本研究檢測了AOSC患者治療前后外周血血清中LPS和炎癥因子TNF-α和IL-10的變化，并檢測了PBMC中PTEN基因和蛋白表達及磷酸化水平的變化，以及NF-κB信號通路激活情況，并與正常對照組進行比較。其結果顯示，AOSC組患者治療前血清中LPS及促炎因子TNF-α水平均明顯高于正常對照組，治愈后1周時血清中LPS及TNF-α水平均降至正常水平，而入院前抗炎因子IL-10水平明顯高于正常對照組，治愈后1周其水平也明顯下降；同時，AOSC患者治療前PBMC中PTEN mRNA和蛋白的表達量明顯低于對照組，經過治療后，PTEN mRNA和蛋白表達恢復正常水平；而PBMC中的PTEN磷酸化水平在AOSC患者治療前升高，但在正常對照組和AOSC組患者治愈后1周時其處于低水平（P < 0.05）。PBMC中IκB基因和蛋白表達的變化趨勢與PTEN相似，而IκB磷酸化水平的變化趨勢與PTEN磷酸化水平相似。PBMC中NF-κB P65基因及蛋白在AOSC患者治療前表達升高（P < 0.05），而在治愈后1周時下降至正常水平。本研究上述結果提示：膿毒血癥的發生可能與腸道LPS的移位密切相關，LPS進入外周血后進一步引起機體促炎因子和抗炎因子的失衡；同時，PTEN磷酸化可能參與了NF-κB信號通路激活，并可能參與了阻斷機體促炎因子產生和增加抗炎因子表達的過程。
PTEN在胞質中表現出雙重特異性磷酸酶活性，參與調節細胞增殖、遷移、分化等過程[16]。PTEN通過阻止細胞生長和分裂進而調控腫瘤細胞增殖，是體內一種重要的腫瘤抑制因子，也是第1個發現具有磷酸酶活性的抑癌基因[17-18]。在肝臟缺血再灌注過程中，PTEN可以促進固有巨噬細胞激活和促炎因子表達，并且促進中性粒細胞的募集[19]。PTEN是PI3K/Akt通路的關鍵負性調控因子，通過磷酸化修飾PI3K后，進一步激活Akt，參與調控生命活動[20]。在炎癥信號激活下，細胞表面的PTEN引起PI3K磷酸化，然后激活Akt，而激活Akt后可進一步誘導IκB磷酸化降解，阻斷TLR4信號通路的轉導[21-22]。在炎癥模型中，PTEN能夠抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的產生[23]；并且，在IFN-γ刺激下，巨噬細胞大量通過下調miR-3473b的表達來提高PTEN含量，進而破壞Akt/GSK3/IL-10負反饋條件環路，促進巨噬細胞激活和免疫反應[24]。本研究觀察到AOSC患者炎癥期血清中LPS含量增加，PBMC內PTEN基因及蛋白表達水平下降，而磷酸化水平（p-PTEN蛋白表達）升高；當患者治愈后，LPS恢復正常水平，PBMC內PTEN基因及蛋白表達水平亦恢復正常。該結果提示，PTEN可能參與了膿毒血癥發生過程中由腸道LPS移位引發的炎癥因子紊亂的過程。
腸道LPS及細菌移位激活PBMC的TLR4信號通路，進一步促進NF-κB炎癥信號放大[25]。NF-κB信號通路是LPS刺激炎癥細胞分泌大量促炎因子如TNF-α的主要機理之一。NF-κB激活需要IκB磷酸化降解，而PTEN可直接參與到IκB磷酸化過程[26]。本研究中也觀察到AOSC患者PBMC的PTEN磷酸化水平升高后，IκB磷酸化水平也提高，同時細胞內IκB的降解，進一步提高了NF-κB P65基因及蛋白的表達，促進了TNF-α的分泌并打破機體炎癥因子的平衡。而Hua等[27]報道，LPS刺激巨噬細胞后，PTEN可通過PI3K/Akt激活NF-κB，促進NF-κB入核。可見，PTEN可通過兩種不同的方式激活NF-κB通路，參與膿毒血癥的發生和發展過程。
本研究觀察到，AOSC患者PBMC中IκB及其磷酸化水平以及PTEN及其磷酸化水平與LPS移位入血相關，并促進NF-κB激活和炎癥因子的產生。提示PTEN在膿毒血癥發生過程中可能通過磷酸化降解IκB或直接激活NF-κB，在膿毒血癥發生初期可作為治療靶點之一。
膿毒血癥（sepsis）病情兇險，病死率極高，是普通外科感染性疾病（如重癥膽管炎、蜂窩織炎、膿腫等），可引發全身炎性反應綜合征及繼發多器官功能衰竭[1-2]。目前研究[3-4]認為，在膿毒血癥啟動階段，腸道細菌及脂多糖（LPS）移位、炎癥介質紊亂等發揮關鍵性作用，并促進病情持續惡化。通常，細菌和LPS移位至外周血后，即可被固有免疫系統中的免疫細胞識別，并激活其表面Toll受體家族（TLRs），繼而繼續激活下游核因子κB（nuclear fator κB，NF-κB），產生大量的促炎因子如腫瘤壞死因子-α（tumor nec-rosis factor-α，TNF-α）等，打破體內炎癥介質平衡，對機體重要器官形成“雙重打擊” [5-6]。
NF-κB作為轉錄因子，包括Rel、p65、RelB、p50和p52這5個亞單位，而且通過不同的二聚體的形式對不同基因的表達進行精細調節[7]。p65與p50異二聚體是NF-κB最常見的組合方式，細胞在靜息狀態下，NF-κB與錨釘在NF-κB多聚體上的核轉錄因子κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB）形成復合體[8]。當細胞受LPS刺激后，IκB激酶將IκB磷酸化和降解后，可促使NF-κB迅速入核，進一步誘導TNF-α等促炎因子的轉錄和表達[9]。因此，阻斷IκB磷酸化降解過程，可限制細菌或LPS誘導的炎癥反應，對平衡體內炎癥介質具有重要的意義。而新近有文獻[10-11]報道，磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology deletedon chromosome ten，PTEN）在體外炎癥模型中具有降低促炎因子分泌的作用，且與抑制NF-κB表達密切相關。但是，在膿毒血癥休克患者中，PTEN是否參與到細菌和LPS移位至外周血，并通過磷酸化降解IκB調控NF-κB通路以降低體內炎癥反應，目前尚無報道。因此，本研究擬檢測PTEN在急性梗阻性化膿性膽管炎（acute obstructive suppurative cholangitis，AOSC）患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的表達變化，并探討其在AOSC中對NF-κB通路激活的作用。
1 資料和方法
1.1 研究對象
1.1.1 病例來源
均選自2013年9月至2015年9月期間重慶市九龍坡區第二人民醫院普通外科及重慶市第九人民醫院普外一科收治并被診斷為AOSC的患者25例作為研究對象，男10例，女15例；年齡（38.92±13.71）歲。診斷以入院磁共振胰膽管成像（magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP）或計算機斷層掃描（computed tomography，CT）檢查以及結合臨床表現和血清學檢測結果為準，診斷均由兩位具有10年以上肝膽外科經驗的副主任醫師共同決定。診斷標準參考2013版《東京指南》 [12]。同時選取同期至重慶市九龍坡區第二人民醫院普通外科及重慶市第九人民醫院普外一科體檢的健康自愿者15例作為正常對照組，男7例，女8例；年齡（37.54±9.62）歲。
1.1.2 病例入選標準
①重慶市九龍坡區第二人民醫院普通外科及重慶市第九人民醫院普外一科收治診斷為AOSC患者，年齡 < 70歲；②有膽管炎及膽總管梗阻病理基礎，符合膽總管引流術指正；③符合中國嚴重膿毒癥-膿毒性休克治療指南（2014）診斷標準[13]；④此次發病前未接受任何抗感染治療及解除膽管梗阻治療。
1.1.3 病例排除標準
①符合入選標準但拒絕研究安排患者；②年齡 > 70歲；③引起膽管炎或膽管梗阻為腫瘤或先天性硬化性膽管炎；④入院前已經接受抗感染及解除膽管梗阻治療；⑤有心臟等重大器官器質性疾病等手術禁忌證，接受膽管穿刺或膽道手術存在巨大風險。
1.1.4 病例治愈標準
①此次膽管梗阻得以解除；②無膽管梗阻和膿毒血癥的臨床癥狀，即體溫、脈搏、血壓、意識、尿量、血氧飽和度等恢復正常，無腹痛、黃疸等；③血液學檢查指標如白細胞計數及血小板計數正常，膽紅素、PTT、C反應蛋白等恢復正常水平。
1.2 主要試劑、材料及設備
外周血單個核細胞分離液試劑盒（LDS1075）購買于天津灝洋生物公司；總RNA提取試劑盒（CW0597）購買于北京康為世紀公司；RNA逆轉錄試劑盒（RR047a）和cDNA擴增試劑盒（（RR820L）均購買于Takara公司；BCA試劑盒、小鼠抗β-actin抗體（1 : 250，BM0627）、羊抗兔IgG-HRP（1 : 2 000，BM0627）、羊抗小鼠IgG-HRP（1 : 2 000，BA1051）、人TNF-α試劑盒（EK0525）和人IL-10試劑盒檢測（EK0416）均購買于武漢博士德生物科技公司；兔抗PTEN抗體（1 : 500，sc-9145）、兔抗磷酸化磷酸酶和張力蛋白同源物（p-PTEN，1 : 500，sc-31714）、小鼠抗IκB抗體（1 : 500，sc-135945）、兔抗p-IκB（磷酸化核轉錄因子κB抑制因子）抗體（1 : 500，sc-101705）和兔抗NF-κB P65抗體（1 : 500，sc-109）均購買于Santa Cruz公司；人LPS試劑盒（xy-0784E）購買于上海信裕生物。
1.3 PBMC的分離
入組患者簽署知情同意書后分別于治療前1 h及治愈后1周抽取外周靜脈血10 mL，收集血清用于酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，剩余血細胞采用外周血單個核細胞分離液試劑分離PBMC，得到的PBMC繼續用于蛋白印跡法（Western blot法）和實時熒光定量聚合酶鏈反應法（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測。正常對照組在體檢結束時抽取外周靜脈血10 mL并根據上述方法分離PBMC進行相同檢測。
1.4 qRT-PCR檢測PTEN、IκB和NF-κB P65的mRNA表達
提取PBMC總RNA，按照總RNA提取試劑盒說明書操作，用SYBR? Green法[14]行RNA逆轉錄和用Premix Ex TaqⅡ法[15]行SYBR PCR反應。最后以2-△△Ct=2-[(Ct目的-Ct內參）實驗組-（Ct目的-Ct內參）對照組]對PBMC中PTEN、IκB和NF-κB P65的mRNA表達進行半定量分析。表 1為目的基因的引物序列及大小，引物由上海生工生物公司合成。
表1
目的分子引物設計
1.5 Western blot法檢測PTEN、IκB和NF-κB P65的蛋白表達和磷酸化水平
首先提取PBMC總蛋白并用BCA法測得蛋白含量，按每個樣本50 μg的蛋白質上樣，按每孔等質量等體積加入，應用Western blot法檢測PBMC中PTEN、IκB和NF-κB P65的蛋白表達和磷酸化水平（p-PTEN和p-IκB蛋白表達），并應用Image Lab軟件掃描目的條帶和相應的β-actin條帶，并測量其灰度值；然后將目的條帶的灰度值與β-actin的灰度值進行比較，所得的比值為目的蛋白的相對蛋白表達量。
1.6 ELISA檢測血清中LPS、TNF-α和IL-10的含量
收集2組研究對象各時相的血清，分別用人LPS試劑盒、人TNF-α試劑盒和人IL-10試劑盒檢測檢測LPS、TNF-α和IL-10的含量。
1.7 統計學方法
采用SPSS 18.0軟件分析。計量資料數據均以均數±標準差（x±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用t檢驗；計數資料比較采用卡方檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 患者一般情況及術后并發癥發生情況
25例AOSC患者的發病時間為（6.523±3.122）d（3 h～12 d）；合并心功能不全1例，肺功能不全1例，乙肝肝硬變2例，腎功能不全1例。既往有膽道病史23例，膽道手術史9例；伴發熱或寒戰22例，黃疸24例，上腹痛25例；20例有典型的Charcot三聯征表現，16例有Reynold五聯征表現。患者均有炎癥反應證據（白細胞計數、C反應蛋白或降鈣素原異常）和肝功能異常。因膽囊結石繼發膽總管結石17例，其中Mirziz綜合征3例；肝膽管結石5例，其中肝內外膽管結石3例，肝內膽管結石2例；單純膽管良性狹窄2例；膽總管下端擴張1例，經手術及抗感染治療患者得以治愈。AOSC組患者入院后治療前的主要炎癥指標白細胞計數、C反應蛋白，降鈣素酶原以及肝功能指標谷丙轉氨酶和總膽紅素水平均明顯高于正常對照組（P < 0.05），治愈后1周時炎癥指標和肝功能指標明顯下降并接近正常水平，具體見表 2。
表2
AOSC組和正常對照組的一般情況
AOSC組25例患者接受治療后均無死亡病例，住院時間（11.4±1.8）d（9～16 d）；其中14例行膽總管切開取石術+T管引流術，6例行膽管穿刺術，3例行膽腸吻合術，2例行肝葉切除術。術后均給予抗炎、保肝、營養支持及補液治療。術后有5例患者出現手術相關嚴重并發癥，其中肺炎2例，調整抗生素后痊愈；肝斷面積液伴感染1例，行穿刺引流術后痊愈；膽汁滲漏2例，保守治療后停止。所有患者痊愈1周后均行MRCP、CT或T管照影檢查以確定此次梗阻已完全解除，且復查相關血清學指標正常。
2.2 血清LPS、TNF-α和IL-10檢測結果
AOSC組患者治療前血清中LPS及促炎因子TNF-α水平均明顯高于正常對照組（P < 0.05），經手術及抗感染治療患者得以治愈，治愈后1周時血清中LPS及TNF-α水平均降至正常水平，與正常對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；AOSC組患者治療前抗炎因子IL-10水平明顯高于正常對照組（P < 0.05），而治愈后1周時其水平也明顯下降，但仍略高于正常對照組，其差異無統計學意義（P > 0.05）。具體見圖 1。以上結果提示，AOSC患者感染期腸道LPS可移位至外周血中，激活炎癥信號通路，破壞了機體促炎因子和抗炎因子的平衡。
圖1
示2組患者血清中LPS（1A）、TNF-α（1B）和IL-10（1C）檢測結果。AOSC組治療前與治療后及正常對照組比較，* P < 0.05
2.3 PBMC中PTEN、IκB和NF-κB P65基因和蛋白表達及磷酸化水平檢測結果
結果見圖 2及圖 3。由圖 2和圖 3可見，AOSC患者治療前PBMC中PTEN mRNA和蛋白的表達量均明顯低于正常對照組（P < 0.05），經過治療后，PTEN的mRNA和蛋白表達恢復正常水平；而PBMC中的PTEN磷酸化水平在AOSC患者治療前升高，但在正常對照組和AOSC組患者治愈后1周時其處于低水平（P < 0.05）。PBMC中IκB基因和蛋白表達的變化趨勢與PTEN相似，而IκB磷酸化水平的變化趨勢與PTEN磷酸化水平相似。PBMC中NF-κB P65基因及蛋白在AOSC患者治療前表達升高（P < 0.05），而在治愈后1周時下降至正常水平。以上結果提示，膿毒血癥發生時，PBMC中的PTEN可能參與調控NF-κB信號通路的激活過程。
圖2
示PBMC中PTEN、p-PTEN、IκB、p-IκB和NF-κB P65蛋白表達電泳圖
圖3
示PTEN、IκB和NF-κB P65基因和蛋白表達及磷酸化水平檢測結果。3A：PTEN、IκB及NF-κB P65 mRNA表達；3B：PTEN蛋白表達；3C：p-PTEN蛋白表達；3D：IκB蛋白表達；3E：p-IκB蛋白表達；3F：NF-κB P65蛋白表達；AOSC組治療前與治療后及正常對照組比較，*P < 0.05
3 討論
本研究檢測了AOSC患者治療前后外周血血清中LPS和炎癥因子TNF-α和IL-10的變化，并檢測了PBMC中PTEN基因和蛋白表達及磷酸化水平的變化，以及NF-κB信號通路激活情況，并與正常對照組進行比較。其結果顯示，AOSC組患者治療前血清中LPS及促炎因子TNF-α水平均明顯高于正常對照組，治愈后1周時血清中LPS及TNF-α水平均降至正常水平，而入院前抗炎因子IL-10水平明顯高于正常對照組，治愈后1周其水平也明顯下降；同時，AOSC患者治療前PBMC中PTEN mRNA和蛋白的表達量明顯低于對照組，經過治療后，PTEN mRNA和蛋白表達恢復正常水平；而PBMC中的PTEN磷酸化水平在AOSC患者治療前升高，但在正常對照組和AOSC組患者治愈后1周時其處于低水平（P < 0.05）。PBMC中IκB基因和蛋白表達的變化趨勢與PTEN相似，而IκB磷酸化水平的變化趨勢與PTEN磷酸化水平相似。PBMC中NF-κB P65基因及蛋白在AOSC患者治療前表達升高（P < 0.05），而在治愈后1周時下降至正常水平。本研究上述結果提示：膿毒血癥的發生可能與腸道LPS的移位密切相關，LPS進入外周血后進一步引起機體促炎因子和抗炎因子的失衡；同時，PTEN磷酸化可能參與了NF-κB信號通路激活，并可能參與了阻斷機體促炎因子產生和增加抗炎因子表達的過程。
PTEN在胞質中表現出雙重特異性磷酸酶活性，參與調節細胞增殖、遷移、分化等過程[16]。PTEN通過阻止細胞生長和分裂進而調控腫瘤細胞增殖，是體內一種重要的腫瘤抑制因子，也是第1個發現具有磷酸酶活性的抑癌基因[17-18]。在肝臟缺血再灌注過程中，PTEN可以促進固有巨噬細胞激活和促炎因子表達，并且促進中性粒細胞的募集[19]。PTEN是PI3K/Akt通路的關鍵負性調控因子，通過磷酸化修飾PI3K后，進一步激活Akt，參與調控生命活動[20]。在炎癥信號激活下，細胞表面的PTEN引起PI3K磷酸化，然后激活Akt，而激活Akt后可進一步誘導IκB磷酸化降解，阻斷TLR4信號通路的轉導[21-22]。在炎癥模型中，PTEN能夠抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的產生[23]；并且，在IFN-γ刺激下，巨噬細胞大量通過下調miR-3473b的表達來提高PTEN含量，進而破壞Akt/GSK3/IL-10負反饋條件環路，促進巨噬細胞激活和免疫反應[24]。本研究觀察到AOSC患者炎癥期血清中LPS含量增加，PBMC內PTEN基因及蛋白表達水平下降，而磷酸化水平（p-PTEN蛋白表達）升高；當患者治愈后，LPS恢復正常水平，PBMC內PTEN基因及蛋白表達水平亦恢復正常。該結果提示，PTEN可能參與了膿毒血癥發生過程中由腸道LPS移位引發的炎癥因子紊亂的過程。
腸道LPS及細菌移位激活PBMC的TLR4信號通路，進一步促進NF-κB炎癥信號放大[25]。NF-κB信號通路是LPS刺激炎癥細胞分泌大量促炎因子如TNF-α的主要機理之一。NF-κB激活需要IκB磷酸化降解，而PTEN可直接參與到IκB磷酸化過程[26]。本研究中也觀察到AOSC患者PBMC的PTEN磷酸化水平升高后，IκB磷酸化水平也提高，同時細胞內IκB的降解，進一步提高了NF-κB P65基因及蛋白的表達，促進了TNF-α的分泌并打破機體炎癥因子的平衡。而Hua等[27]報道，LPS刺激巨噬細胞后，PTEN可通過PI3K/Akt激活NF-κB，促進NF-κB入核。可見，PTEN可通過兩種不同的方式激活NF-κB通路，參與膿毒血癥的發生和發展過程。
本研究觀察到，AOSC患者PBMC中IκB及其磷酸化水平以及PTEN及其磷酸化水平與LPS移位入血相關，并促進NF-κB激活和炎癥因子的產生。提示PTEN在膿毒血癥發生過程中可能通過磷酸化降解IκB或直接激活NF-κB，在膿毒血癥發生初期可作為治療靶點之一。
