引用本文： 李謀, 鄭興菊, 黃子星, 宋彬. 磁敏感成像判斷大鼠肝細胞癌病理分級的價值. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(9): 1132-1135. doi: 10.7507/1007-9424.20160290 復制
肝癌是全球第5大常見的惡性腫瘤，目前我國肝癌的發病人數約占全球的55% [1-3]。肝細胞癌（HCC）是原發性肝癌中最主要的類型，手術干預是其最有效的治療方法[4]。研究[5]證實，腫瘤的病理分級是預測腫瘤術后復發及生存率的主要因素之一，腫瘤分化程度越低的患者，術后生存率越低。磁敏感成像（SWI）技術是基于不同組織磁敏感性的差異，形成不同于傳統T1、T2及質子密度加權成像的新型MRI技術[6]，其對于出血或血液中的脫氧成分極其敏感，能夠提供出血、動靜脈畸形及鐵沉積的確切信息，以實現更快、更準確的診斷，并能確認腫瘤內可能存在的微小出血和靜脈血管，更好地明確腫瘤的生長狀態[7]。本研究通過建立大鼠HCC模型，探究了以SWI劃分HCC病理分級的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
100只健康雄性清潔級Wistar大鼠，體質量100～150 g，6周齡，購自四川達碩實驗動物中心，合格證號為SCXK（川）2013-24。0.1 mg/mL二乙基亞硝胺（DEN）購自Sigma公司，掃描設備是德國西門子公司生產的Magnetom Skyra 3.0 T超導磁共振成像儀。
1.2 建立大鼠HCC模型
運用隨機數字表法將100只大鼠隨機分為實驗組90只和空白對照組10只。在實驗組大鼠飲水中加入DEN喂養12周（自由飲用），以誘導HCC生成，而空白對照組大鼠僅給予蒸餾水[8-10]。所有操作均按照四川大學動物保護指導方針執行。
1.3 掃描及圖像分析
用2%異氟烷對大鼠進行呼吸麻醉后，利用3.0 T磁共振掃描儀掃描大鼠，掃描范圍從膈頂至肝下緣，掃描序列包括T1WI、SWI，以及軸位、冠狀位和矢狀位T2WI序列。經預實驗測試后，序列掃描參數如下。①T2WI：TR 3 000 ms，TE 62 ms，FOV 90 mm× 100 mm，矩陣225×250，空間分辨率0.4 mm×0.4 mm× 1.5 mm，層厚1.5 mm，間隔0.1 mm，帶寬300 Hz，掃描時間203 s。②T1WI：TR 201 ms，TE 4.59 ms，FOV 90 mm×100 mm，矩陣225×250，空間分辨率0.4 mm× 0.4 mm×1.5 mm，層厚1.5 mm，間隔0.1 mm，帶寬300 Hz，掃描時間253 s。③SWI：TR 331 ms，TE 10.51 ms，FOV 110 mm×100 mm，矩陣157×143，空間分辨率0.7 mm×0.7 mm×1.5 mm，層厚1.5 mm，間隔0.5 mm，帶寬300 Hz，掃描時間33 s。由2位腹部影像診斷醫師利用工作站（Version VB35A）獨立分析圖像并記錄測量指標，意見不一致處通過協商最終達成一致。在SWI圖像上，將病灶內的低信號區域定義為瘤內磁敏感信號強度（intratumoral susceptibility signal intensity，ITSS），ITSS的構成成分分為兩種：微血管和出血，其中線狀低信號代表微血管（在病灶連續層面上觀察），點狀低信號（聚集或無聚集）代表出血。采用賦值法描述ITSS的特征[11]，具體如下。①ITSS構成成分判定：A類，無ITSS；B類，主要為點狀（出血）；C類，出血和微血管比例相近（混合狀）；D類，主要為線狀（微血管）。②ITSS在腫瘤內所占比例：0分，無ITSS；1分，比例 < 50%（任意層面）；2分，比例≥50%（至少有1個層面）。
1.4 病理學檢查
掃描后次日采用脊椎脫臼法處死大鼠，結合MRI軸位、矢狀位和冠狀位掃描圖像選取目標病灶后用石蠟包埋，常規行HE染色。由2位年資5年以上的病理醫生分別對病灶的HE切片結果進行分析，若病灶為HCC，進一步行Edmondson-Steiner病理分級[12-13]，意見不一致處通過協商最終達成一致。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。采用成組χ2檢驗（二分類資料或無序分類資料）和秩和檢驗（等級資料）分析低級別組和高級別組HCC的ITSS特征有無差異。檢驗水準α=0.050。
2 結果
2.1 大鼠HCC模型建模結果
喂養12周后，實驗組大鼠存活64只，其中26只在喂養過程中因肺炎、腫瘤出血等死亡；空白對照組的10只大鼠均存活。實驗組64只大鼠行MRI掃描時因過度麻醉死亡7只，最終對57只大鼠進行病理取材，結果成功建模48只。
2.2 低級別組和高級別組HCC的ITSS特征比較
48只大鼠HCC模型中，獲取HCC共50個。對50個HCC病灶進行分析，其中18個病灶因圖像偽影干擾而排除，最終納入32個HCC病灶（其中4個無ITSS）。根據Edmondson-Steiner病理分級，32個HCC病灶包括Ⅰ級14個，Ⅱ級4個，Ⅲ級8個，Ⅳ級6個。各病理分級HCC的ITSS特征見表 1。將Ⅰ級和Ⅱ級定義為低級別（低級別組），Ⅲ級和Ⅳ級定義為高級別（高級別組），2組的ITSS特征見表 2。其中，2組的ITSS出現率比較差異無統計學意義（P=0.113）；2組的ITSS構成成分不同（P=0.002），低級別組HCC的ITSS構成主要是微血管（圖 1），而高級別組HCC的ITSS構成以出血為主（圖 2）；2組的ITSS在腫瘤內所占比例也不同（P < 0.001），高級別組的ITSS在腫瘤內所占比例高于低級別組。
圖1
示一病理分級為Ⅰ級的HCC的MRI圖像。1A：T1WI圖像，病灶呈稍高信號；1B：T2WI圖像，病灶呈不均勻高信號；1C：SWI圖像，病灶內見線狀低信號（白箭）??圖 2?示一病理分級為Ⅳ級的HCC的MRI圖像。2A：T1WI圖像，病灶前份呈較均勻稍高信號，后份見大片出血區；2B：T2WI圖像，病灶前份呈高信號，后份見大片不均勻出血區；2C：SWI圖像，病灶內見多發線狀（白箭）、點狀低信號（白箭頭），以及大片出血區（星號）??圖 3?ITSS在腫瘤內所占比例得分劃分高、低級別HCC的ROC曲線
表1
不同病理級別HCC的ITSS特征
表2
低級別組和高級別組HCC的ITSS特征
2.3 ROC分析
綜合文獻[11, 14-15]，選取ITSS在腫瘤內所占比例行ROC曲線分析。ROC曲線分析結果見圖 3。如圖 3所示，當ITSS在腫瘤內所占比例得分為2分時，即至少有1個層面所占比例≥50%時，ROC曲線下面積最大，此時靈敏度和特異度分別為85.7%（95% CI： 74.9%～96.5%）及94.4%（95% CI：83.6%～100%），曲線下面積為0.917。
3 討論
HCC惡性程度的準確評價對于制定治療方案以及評估預后非常重要。對于早期肝癌，最大限度切除腫瘤可以降低腫瘤的復發率，并盡可能保留正常肝臟組織，進而保留患者的殘肝功能。而對于中晚期肝癌患者，多采取姑息治療或肝移植，僅部分基礎情況良好的患者可以考慮腫瘤切除術[16-17]。目前評估肝癌惡性程度的方法存在一定限制，比如HCC多伴有肝硬變，可查見肝硬變相關結節，而CT和超聲對于顯示及鑒別直徑 < 2 cm的病灶很困難[18-19]。評估HCC惡性程度的金標準是組織病理學或細胞學檢查，但該方法為有創檢查，同時存在有采樣誤差、導致并發癥等缺點，因而應用受限[20]。目前，無創的MRI新技術對于HCC的診斷及預后評估越來越重要。
SWI作為MRI新技術之一，最早出現于1997年[21]。其采用3D完全流動補償的梯度回波序列，可同時獲得成對出現的磁距圖和相位圖，二者對應相同的解剖位置。常規MRI僅利用了磁距圖信息，而SWI經過后處理可以將相位圖與磁距圖融合，以顯示磁敏感特性的差別，如靜脈血管、出血、鐵沉積等。靜脈結構成像依賴于靜脈血管內脫氧血紅蛋白所引起的磁場不均勻性和相位差加大。出血的成像主要依賴于脫氧血紅蛋白轉變為高鐵血紅蛋白及含鐵血黃素沉積所導致的順磁性改變。對于出血，SWI比常規梯度回波序列更敏感，甚至能顯示微小出血，這明顯不同于主要顯示壞死和囊變的增強T1加權成像。因此SWI能區分腫瘤復發和術后創傷出血，并能作為目前使用的常規增強MRI的有效補充[7]。
多個研究[22-24]均已證明，SWI在顯示HCC的形態學特征（假包膜等）及腫瘤內部結構（出血和血管）方面有很高的價值，且優于傳統MRI序列以及對比增強MR，但上述研究均未涉及對HCC惡性程度的判斷。目前SWI已應用于判斷腦膠質瘤的病理分級[14]。本研究在Wistar大鼠HCC模型上研究了SWI判斷HCC病理分級的可行性。結果顯示，高、低級別HCC均可出現ITSS，但出現率的差異并無統計學意義，而2組ITSS的構成成分及其在腫瘤內所占比例的差異均存在統計學意義。高級別組HCC以出血為主，在腫瘤內所占比例多超過50%；低級別組HCC則以微血管為主，在腫瘤內所占比例小于50%。腫瘤內新生血管為腫瘤生長及轉移創造了條件，低級別HCC的新生血管較完整（SWI上顯示為線狀），而高級別HCC的生長速度較快，其新生血管多為幼稚血管，內皮及管壁結構不完整，易瘤內出血（SWI上顯示為點狀）[25-26]，這與本研究結果相一致。同時，本研究結果表明，ITSS在腫瘤內所占比例判斷高低級別HCC的曲線下面積為0.917，表明SWI對于區分高低級別HCC的診斷效能較高，臨床應用的可能性比較大，是一種值得期待的MRI新技術。
但本研究尚存在一些不足。第一，受到大鼠HCC模型建模周期較長的限制，樣本量較小。第二，大鼠麻醉后在掃描的同時無法完全避免呼吸偽影的影響，導致部分圖像質量不夠好。但當SWI應用于患者時，可以通過閉氣訓練最大程度避免呼吸偽影，并獲得高質量的圖像。
肝癌是全球第5大常見的惡性腫瘤，目前我國肝癌的發病人數約占全球的55% [1-3]。肝細胞癌（HCC）是原發性肝癌中最主要的類型，手術干預是其最有效的治療方法[4]。研究[5]證實，腫瘤的病理分級是預測腫瘤術后復發及生存率的主要因素之一，腫瘤分化程度越低的患者，術后生存率越低。磁敏感成像（SWI）技術是基于不同組織磁敏感性的差異，形成不同于傳統T1、T2及質子密度加權成像的新型MRI技術[6]，其對于出血或血液中的脫氧成分極其敏感，能夠提供出血、動靜脈畸形及鐵沉積的確切信息，以實現更快、更準確的診斷，并能確認腫瘤內可能存在的微小出血和靜脈血管，更好地明確腫瘤的生長狀態[7]。本研究通過建立大鼠HCC模型，探究了以SWI劃分HCC病理分級的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
100只健康雄性清潔級Wistar大鼠，體質量100～150 g，6周齡，購自四川達碩實驗動物中心，合格證號為SCXK（川）2013-24。0.1 mg/mL二乙基亞硝胺（DEN）購自Sigma公司，掃描設備是德國西門子公司生產的Magnetom Skyra 3.0 T超導磁共振成像儀。
1.2 建立大鼠HCC模型
運用隨機數字表法將100只大鼠隨機分為實驗組90只和空白對照組10只。在實驗組大鼠飲水中加入DEN喂養12周（自由飲用），以誘導HCC生成，而空白對照組大鼠僅給予蒸餾水[8-10]。所有操作均按照四川大學動物保護指導方針執行。
1.3 掃描及圖像分析
用2%異氟烷對大鼠進行呼吸麻醉后，利用3.0 T磁共振掃描儀掃描大鼠，掃描范圍從膈頂至肝下緣，掃描序列包括T1WI、SWI，以及軸位、冠狀位和矢狀位T2WI序列。經預實驗測試后，序列掃描參數如下。①T2WI：TR 3 000 ms，TE 62 ms，FOV 90 mm× 100 mm，矩陣225×250，空間分辨率0.4 mm×0.4 mm× 1.5 mm，層厚1.5 mm，間隔0.1 mm，帶寬300 Hz，掃描時間203 s。②T1WI：TR 201 ms，TE 4.59 ms，FOV 90 mm×100 mm，矩陣225×250，空間分辨率0.4 mm× 0.4 mm×1.5 mm，層厚1.5 mm，間隔0.1 mm，帶寬300 Hz，掃描時間253 s。③SWI：TR 331 ms，TE 10.51 ms，FOV 110 mm×100 mm，矩陣157×143，空間分辨率0.7 mm×0.7 mm×1.5 mm，層厚1.5 mm，間隔0.5 mm，帶寬300 Hz，掃描時間33 s。由2位腹部影像診斷醫師利用工作站（Version VB35A）獨立分析圖像并記錄測量指標，意見不一致處通過協商最終達成一致。在SWI圖像上，將病灶內的低信號區域定義為瘤內磁敏感信號強度（intratumoral susceptibility signal intensity，ITSS），ITSS的構成成分分為兩種：微血管和出血，其中線狀低信號代表微血管（在病灶連續層面上觀察），點狀低信號（聚集或無聚集）代表出血。采用賦值法描述ITSS的特征[11]，具體如下。①ITSS構成成分判定：A類，無ITSS；B類，主要為點狀（出血）；C類，出血和微血管比例相近（混合狀）；D類，主要為線狀（微血管）。②ITSS在腫瘤內所占比例：0分，無ITSS；1分，比例 < 50%（任意層面）；2分，比例≥50%（至少有1個層面）。
1.4 病理學檢查
掃描后次日采用脊椎脫臼法處死大鼠，結合MRI軸位、矢狀位和冠狀位掃描圖像選取目標病灶后用石蠟包埋，常規行HE染色。由2位年資5年以上的病理醫生分別對病灶的HE切片結果進行分析，若病灶為HCC，進一步行Edmondson-Steiner病理分級[12-13]，意見不一致處通過協商最終達成一致。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。采用成組χ2檢驗（二分類資料或無序分類資料）和秩和檢驗（等級資料）分析低級別組和高級別組HCC的ITSS特征有無差異。檢驗水準α=0.050。
2 結果
2.1 大鼠HCC模型建模結果
喂養12周后，實驗組大鼠存活64只，其中26只在喂養過程中因肺炎、腫瘤出血等死亡；空白對照組的10只大鼠均存活。實驗組64只大鼠行MRI掃描時因過度麻醉死亡7只，最終對57只大鼠進行病理取材，結果成功建模48只。
2.2 低級別組和高級別組HCC的ITSS特征比較
48只大鼠HCC模型中，獲取HCC共50個。對50個HCC病灶進行分析，其中18個病灶因圖像偽影干擾而排除，最終納入32個HCC病灶（其中4個無ITSS）。根據Edmondson-Steiner病理分級，32個HCC病灶包括Ⅰ級14個，Ⅱ級4個，Ⅲ級8個，Ⅳ級6個。各病理分級HCC的ITSS特征見表 1。將Ⅰ級和Ⅱ級定義為低級別（低級別組），Ⅲ級和Ⅳ級定義為高級別（高級別組），2組的ITSS特征見表 2。其中，2組的ITSS出現率比較差異無統計學意義（P=0.113）；2組的ITSS構成成分不同（P=0.002），低級別組HCC的ITSS構成主要是微血管（圖 1），而高級別組HCC的ITSS構成以出血為主（圖 2）；2組的ITSS在腫瘤內所占比例也不同（P < 0.001），高級別組的ITSS在腫瘤內所占比例高于低級別組。
圖1
示一病理分級為Ⅰ級的HCC的MRI圖像。1A：T1WI圖像，病灶呈稍高信號；1B：T2WI圖像，病灶呈不均勻高信號；1C：SWI圖像，病灶內見線狀低信號（白箭）??圖 2?示一病理分級為Ⅳ級的HCC的MRI圖像。2A：T1WI圖像，病灶前份呈較均勻稍高信號，后份見大片出血區；2B：T2WI圖像，病灶前份呈高信號，后份見大片不均勻出血區；2C：SWI圖像，病灶內見多發線狀（白箭）、點狀低信號（白箭頭），以及大片出血區（星號）??圖 3?ITSS在腫瘤內所占比例得分劃分高、低級別HCC的ROC曲線
表1
不同病理級別HCC的ITSS特征
表2
低級別組和高級別組HCC的ITSS特征
2.3 ROC分析
綜合文獻[11, 14-15]，選取ITSS在腫瘤內所占比例行ROC曲線分析。ROC曲線分析結果見圖 3。如圖 3所示，當ITSS在腫瘤內所占比例得分為2分時，即至少有1個層面所占比例≥50%時，ROC曲線下面積最大，此時靈敏度和特異度分別為85.7%（95% CI： 74.9%～96.5%）及94.4%（95% CI：83.6%～100%），曲線下面積為0.917。
3 討論
HCC惡性程度的準確評價對于制定治療方案以及評估預后非常重要。對于早期肝癌，最大限度切除腫瘤可以降低腫瘤的復發率，并盡可能保留正常肝臟組織，進而保留患者的殘肝功能。而對于中晚期肝癌患者，多采取姑息治療或肝移植，僅部分基礎情況良好的患者可以考慮腫瘤切除術[16-17]。目前評估肝癌惡性程度的方法存在一定限制，比如HCC多伴有肝硬變，可查見肝硬變相關結節，而CT和超聲對于顯示及鑒別直徑 < 2 cm的病灶很困難[18-19]。評估HCC惡性程度的金標準是組織病理學或細胞學檢查，但該方法為有創檢查，同時存在有采樣誤差、導致并發癥等缺點，因而應用受限[20]。目前，無創的MRI新技術對于HCC的診斷及預后評估越來越重要。
SWI作為MRI新技術之一，最早出現于1997年[21]。其采用3D完全流動補償的梯度回波序列，可同時獲得成對出現的磁距圖和相位圖，二者對應相同的解剖位置。常規MRI僅利用了磁距圖信息，而SWI經過后處理可以將相位圖與磁距圖融合，以顯示磁敏感特性的差別，如靜脈血管、出血、鐵沉積等。靜脈結構成像依賴于靜脈血管內脫氧血紅蛋白所引起的磁場不均勻性和相位差加大。出血的成像主要依賴于脫氧血紅蛋白轉變為高鐵血紅蛋白及含鐵血黃素沉積所導致的順磁性改變。對于出血，SWI比常規梯度回波序列更敏感，甚至能顯示微小出血，這明顯不同于主要顯示壞死和囊變的增強T1加權成像。因此SWI能區分腫瘤復發和術后創傷出血，并能作為目前使用的常規增強MRI的有效補充[7]。
多個研究[22-24]均已證明，SWI在顯示HCC的形態學特征（假包膜等）及腫瘤內部結構（出血和血管）方面有很高的價值，且優于傳統MRI序列以及對比增強MR，但上述研究均未涉及對HCC惡性程度的判斷。目前SWI已應用于判斷腦膠質瘤的病理分級[14]。本研究在Wistar大鼠HCC模型上研究了SWI判斷HCC病理分級的可行性。結果顯示，高、低級別HCC均可出現ITSS，但出現率的差異并無統計學意義，而2組ITSS的構成成分及其在腫瘤內所占比例的差異均存在統計學意義。高級別組HCC以出血為主，在腫瘤內所占比例多超過50%；低級別組HCC則以微血管為主，在腫瘤內所占比例小于50%。腫瘤內新生血管為腫瘤生長及轉移創造了條件，低級別HCC的新生血管較完整（SWI上顯示為線狀），而高級別HCC的生長速度較快，其新生血管多為幼稚血管，內皮及管壁結構不完整，易瘤內出血（SWI上顯示為點狀）[25-26]，這與本研究結果相一致。同時，本研究結果表明，ITSS在腫瘤內所占比例判斷高低級別HCC的曲線下面積為0.917，表明SWI對于區分高低級別HCC的診斷效能較高，臨床應用的可能性比較大，是一種值得期待的MRI新技術。
但本研究尚存在一些不足。第一，受到大鼠HCC模型建模周期較長的限制，樣本量較小。第二，大鼠麻醉后在掃描的同時無法完全避免呼吸偽影的影響，導致部分圖像質量不夠好。但當SWI應用于患者時，可以通過閉氣訓練最大程度避免呼吸偽影，并獲得高質量的圖像。
