引用本文： 李安強, 史浩, 牛啟兵, 陳泉, 董方. 低分子肝素鈣對急性深靜脈血栓大鼠血清IL-6和TNF-α水平的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(9): 1121-1124. doi: 10.7507/1007-9424.20160286 復制
靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）是臨床三大血栓性疾病（心肌梗塞、缺血性腦卒中和VTE）之一[1]。急性下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）形成是臨床常見的外周血管疾病，若治療不及時，易繼發致命的肺栓塞和慢性靜脈瓣功能不全。炎癥與血栓形成之間存在著密切的聯系，一方面炎癥促進高凝狀態，另一方面血栓形成過程中產生的物質也可引起炎癥。本實驗采用低分子肝素鈣（LMWH）對大鼠DVT模型進行干預后，檢測血清白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平的變化，旨在研究LMWH的抗炎作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和主要材料
57只雄性SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠（體質量約250 g，8周齡），購自蘭州大學醫學實驗中心，批號：9222764。IL-6和TNF-α ELISA試劑盒均購自上海星科生物技術發展有限公司。
1.2 方法
1.2.1 建模及分組
將57只SD大鼠隨機（隨機數字表法）分為空白對照組20只和DVT組37只。所有大鼠均于腹腔內注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，取仰臥位固定、消毒鋪巾；沿左下肢股靜脈走行切開皮膚約3.5 cm長，顯露、游離左側股靜脈，DVT組大鼠采用泰絲（1-0）結扎近心端股靜脈，肉眼見左下肢腫脹，則提示造模成功，空白對照組大鼠不予結扎；采用縫線縫合手術創口。分別于術前、術后36 h行彩色多普勒超聲檢查大鼠左下肢靜脈血栓形成情況。再將DVT大鼠隨機（隨機數字表法）分為實驗對照組18只和LMWH組19只。空白對照組和實驗對照組大鼠均給予2 mL生理鹽水皮下注射，LMWH組大鼠給予2 mL稀釋后的LMWH（3 U/mL）皮下注射，每12小時注射1次，于60 h后停止注射。采用千分尺測量3組大鼠術前、術后36 h和術后72 h時左下肢膝關節上6 mm處的左下肢周徑變化，并于術前、術后36 h和術后72 h取大鼠心臟血液1 mL以檢測血清IL-6和TNF-α水平。
1.2.2 IL-6和TNF-α水平檢測
采用ELISA法檢測血清IL-6和TNF-α水平，具體操作均按照ELISA試劑盒說明書進行，并于450 nm波長處測定吸光度（OD）值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，同時點3組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗；同組內各時點比較采用重復測量資料的方差分析，兩兩比較采用q檢驗。檢驗水準α=0.050。
2 結果
實驗過程中無大鼠死亡，建模前彩色多普勒超聲檢查提示所有大鼠的左下肢深靜脈通暢、無DVT發生；術后36 h行彩色多普勒超聲檢查提示DVT組大鼠均有左下肢DVT形成，進一步證實建模成功（圖 1和圖 2）。
圖1
示左下肢股靜脈和股深靜脈有DVT形成（白箭）?? 圖 2?彩色多普勒超聲檢查提示股靜脈和股深靜脈有DVT形成（紅箭）
2.1 3組大鼠各時點的左下肢周徑
術前空白對照組、實驗對照組及LMWH組的左下肢周徑比較差異無統計學意義（P=0.555），但術后36 h和術后72 h時3組的左下肢周徑比較差異均有統計學意義（P=0.000），均是實驗對照組 > LMWH組 > 空白對照組。空白對照組3個時點的左下肢周徑變化不大（P=0.343）；實驗對照組的左下肢周徑遞增，各時點兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.050）；而LMWH組的左下肢周徑在術后36 h升高（P=0.009），術后72 h較術后36 h有所下降（P=0.025），見表 1。
表1
3組大鼠各時點的左下肢周徑（μm，x±s）
2.2 3組大鼠各時點的血清IL-6和TNF-α水平
術前空白對照組、實驗對照組及LMWH組的血清IL-6水平和TNF-α水平比較差異均無統計學意義（P > 0.050），但術后36 h和術后72 h時3組的血清IL-6水平和TNF-α水平比較差異均有統計學意義（P=0.000），均是實驗對照組 > LMWH組 > 空白對照組。空白對照組3個時點的血清IL-6水平變化不大（P=0.052）；實驗對照組的血清IL-6水平遞增，3個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.050）；而LMWH組的血清IL-6水平在術后36 h升高（P < 0.050），術后72 h較術后36 h有所下降（P < 0.050）。空白對照組3個時點的血清TNF-α水平變化不大（P=0.672），但實驗對照組和LMWH組的血清TNF-α水平隨時間延長遞增，3個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.050）。見表 2。
表2
3組大鼠各時點的血清IL-6和TNF-α水平（ng/mL，x±s)
3 討論
DVT系指血液在深靜脈腔內不正常地凝結，阻塞靜脈管腔，從而導致靜脈回流障礙，是創傷、手術、癱瘓等之后常發生的并發癥，好發于下肢。下肢DVT的發生與血液瘀滯、血液高凝狀態和血管壁損傷有關。有研究[2]報道，在美國，DVT發病人數每年超過100萬，其因并發肺栓塞死亡的患者數量超過20萬，危害極大，且高齡（80歲以上）人群的發病率達10.7%。在我國，外科病房住院患者的DVT發病率更高[3]，且大多數患者早期無明顯臨床表現，由于其繼發肺栓塞，造成部分病例猝死[4]，故研究如何早期發現DVT是臨床醫生關注的話題。近幾年研究[5-8]表明，炎癥反應與血栓形成之間存在著密切的聯系[5-6]：一方面炎癥反應易繼發血液高凝狀態，促進血栓形成，受損的血管細胞和激活的局部炎癥細胞（白細胞、單核或巨噬細胞等）能夠釋放一系列的細胞因子及炎癥介質，如TNF-α、IL-6等，經過多種途徑影響靜脈血栓形成過程，其主要的途徑為通過調節靜脈內皮細胞的功能誘發血栓形成[7-8]；另一方面血栓形成過程中引起局部甚至全身炎癥反應，如纖維蛋白沉積引起組織缺血缺氧，從而刺激炎癥因子釋放。二者相互促進，呈級聯放大。同時，在血凝級聯反應過程中發揮重要作用的凝血酶激活單核細胞、內皮細胞等表達黏附分子，釋放炎癥介質[9]。激活的凝血系統與炎癥反應通過多個環節相互作用，相互交織成一個復雜的網絡系統，導致血栓形成。
LMWH是通過化學或酶學解聚的方法從普通肝素中衍生出來的片段，長度約為普通肝素的1/3，平均相對分子質量為4 500×103，其窄譜低分子質量的分布顯著優于常規肝素，具有明顯的抗凝作用，作為抗凝藥在臨床上已廣泛應用，近年來其抗炎活性也受到重視。Wan等[10]報道，給小鼠注射5 000 U/kg LMWH能有效地抑制TNF-α的表達，從而抑制白細胞沿內皮細胞上的黏附和組織浸潤。Celasco等[11]研究發現，連續3 d給大鼠直腸給藥LMWH，從所取鼠脾細胞的觀察中發現，LMWH主要通過抑制干擾素-γ（IFN-γ）的表達而起到抗炎作用，抑制NO的合成[12-13]；此外，其還經小腸屏障作用于腸內微循環后，通過白細胞與內皮細胞的相互作用而達到抗炎作用[14]。
IL-6是由免疫細胞、非免疫細胞等多種細胞分泌的作用于血管系統的細胞因子，具有多種生物活性，是炎癥反應的重要介質，是具有廣泛生物效應的多功能細胞因子，可誘導干細胞合成血漿纖維蛋白原（FIB）、C反應蛋白（CRP）等急性期蛋白，從而促進血栓形成[15]。TNF-α是由單核-巨噬細胞系統及淋巴細胞產生的細胞因子，是機體炎癥反應與免疫應答的重要調節因子。有文獻[16]報道，TNF-α在炎癥性腸病中被確定為重要的病理學炎癥介質，是介導免疫應答和炎癥反應的關鍵介質之一。TNF-α能導致內皮細胞形態和活性的改變，并且使單層內皮細胞的通透性增加并釋放大量細胞因子[17]。
本實驗通過結扎股靜脈以建立大鼠DVT模型，且彩色多普勒超聲檢查提示大鼠左下肢DVT建立成功。實驗結果顯示，術后36 h和術后72 h時3組的左下肢周徑比較差異均有統計學意義（P=0.000），均是實驗對照組 > LMWH組 > 空白對照組。分析原因可能是，LMWH組由于LMWH的抗凝作用抑制了DVT的進一步發展，從而導致LMWH組大鼠的左下肢周徑小于同時間點的實驗對照組。此外，本實驗結果還表明，術后36 h和術后72 h時3組的血清IL-6水平和TNF-α水平比較差異均有統計學意義（P=0.000），均是實驗對照組 > LMWH組 > 空白對照組。該結果提示，炎癥因子IL-6和TNF-α在DVT形成中具有重要作用，推測LMWH通過抑制大鼠DVT形成過程中IL-6和TNF-α的表達，從而達到抗炎作用[18-19]，提示抗炎作用是LMWH治療DVT的重要途徑之一，這為臨床部分病例下肢DVT發生后白細胞計數和中性粒細胞升高、經低分子肝素抗凝治療后恢復到正常范圍提供了合理的解釋，為LMWH臨床治療全身無菌性炎癥反應及DVT提供了新的理論支持，為進一步了解LMWH的抗炎作用機理提供了重要依據。此外，LMWH獨特的性質使其有望成為有效且安全的新型抗炎藥物之一。
靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）是臨床三大血栓性疾病（心肌梗塞、缺血性腦卒中和VTE）之一[1]。急性下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）形成是臨床常見的外周血管疾病，若治療不及時，易繼發致命的肺栓塞和慢性靜脈瓣功能不全。炎癥與血栓形成之間存在著密切的聯系，一方面炎癥促進高凝狀態，另一方面血栓形成過程中產生的物質也可引起炎癥。本實驗采用低分子肝素鈣（LMWH）對大鼠DVT模型進行干預后，檢測血清白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平的變化，旨在研究LMWH的抗炎作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和主要材料
57只雄性SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠（體質量約250 g，8周齡），購自蘭州大學醫學實驗中心，批號：9222764。IL-6和TNF-α ELISA試劑盒均購自上海星科生物技術發展有限公司。
1.2 方法
1.2.1 建模及分組
將57只SD大鼠隨機（隨機數字表法）分為空白對照組20只和DVT組37只。所有大鼠均于腹腔內注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，取仰臥位固定、消毒鋪巾；沿左下肢股靜脈走行切開皮膚約3.5 cm長，顯露、游離左側股靜脈，DVT組大鼠采用泰絲（1-0）結扎近心端股靜脈，肉眼見左下肢腫脹，則提示造模成功，空白對照組大鼠不予結扎；采用縫線縫合手術創口。分別于術前、術后36 h行彩色多普勒超聲檢查大鼠左下肢靜脈血栓形成情況。再將DVT大鼠隨機（隨機數字表法）分為實驗對照組18只和LMWH組19只。空白對照組和實驗對照組大鼠均給予2 mL生理鹽水皮下注射，LMWH組大鼠給予2 mL稀釋后的LMWH（3 U/mL）皮下注射，每12小時注射1次，于60 h后停止注射。采用千分尺測量3組大鼠術前、術后36 h和術后72 h時左下肢膝關節上6 mm處的左下肢周徑變化，并于術前、術后36 h和術后72 h取大鼠心臟血液1 mL以檢測血清IL-6和TNF-α水平。
1.2.2 IL-6和TNF-α水平檢測
采用ELISA法檢測血清IL-6和TNF-α水平，具體操作均按照ELISA試劑盒說明書進行，并于450 nm波長處測定吸光度（OD）值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，同時點3組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗；同組內各時點比較采用重復測量資料的方差分析，兩兩比較采用q檢驗。檢驗水準α=0.050。
2 結果
實驗過程中無大鼠死亡，建模前彩色多普勒超聲檢查提示所有大鼠的左下肢深靜脈通暢、無DVT發生；術后36 h行彩色多普勒超聲檢查提示DVT組大鼠均有左下肢DVT形成，進一步證實建模成功（圖 1和圖 2）。
圖1
示左下肢股靜脈和股深靜脈有DVT形成（白箭）?? 圖 2?彩色多普勒超聲檢查提示股靜脈和股深靜脈有DVT形成（紅箭）
2.1 3組大鼠各時點的左下肢周徑
術前空白對照組、實驗對照組及LMWH組的左下肢周徑比較差異無統計學意義（P=0.555），但術后36 h和術后72 h時3組的左下肢周徑比較差異均有統計學意義（P=0.000），均是實驗對照組 > LMWH組 > 空白對照組。空白對照組3個時點的左下肢周徑變化不大（P=0.343）；實驗對照組的左下肢周徑遞增，各時點兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.050）；而LMWH組的左下肢周徑在術后36 h升高（P=0.009），術后72 h較術后36 h有所下降（P=0.025），見表 1。
表1
3組大鼠各時點的左下肢周徑（μm，x±s）
2.2 3組大鼠各時點的血清IL-6和TNF-α水平
術前空白對照組、實驗對照組及LMWH組的血清IL-6水平和TNF-α水平比較差異均無統計學意義（P > 0.050），但術后36 h和術后72 h時3組的血清IL-6水平和TNF-α水平比較差異均有統計學意義（P=0.000），均是實驗對照組 > LMWH組 > 空白對照組。空白對照組3個時點的血清IL-6水平變化不大（P=0.052）；實驗對照組的血清IL-6水平遞增，3個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.050）；而LMWH組的血清IL-6水平在術后36 h升高（P < 0.050），術后72 h較術后36 h有所下降（P < 0.050）。空白對照組3個時點的血清TNF-α水平變化不大（P=0.672），但實驗對照組和LMWH組的血清TNF-α水平隨時間延長遞增，3個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.050）。見表 2。
表2
3組大鼠各時點的血清IL-6和TNF-α水平（ng/mL，x±s)
3 討論
DVT系指血液在深靜脈腔內不正常地凝結，阻塞靜脈管腔，從而導致靜脈回流障礙，是創傷、手術、癱瘓等之后常發生的并發癥，好發于下肢。下肢DVT的發生與血液瘀滯、血液高凝狀態和血管壁損傷有關。有研究[2]報道，在美國，DVT發病人數每年超過100萬，其因并發肺栓塞死亡的患者數量超過20萬，危害極大，且高齡（80歲以上）人群的發病率達10.7%。在我國，外科病房住院患者的DVT發病率更高[3]，且大多數患者早期無明顯臨床表現，由于其繼發肺栓塞，造成部分病例猝死[4]，故研究如何早期發現DVT是臨床醫生關注的話題。近幾年研究[5-8]表明，炎癥反應與血栓形成之間存在著密切的聯系[5-6]：一方面炎癥反應易繼發血液高凝狀態，促進血栓形成，受損的血管細胞和激活的局部炎癥細胞（白細胞、單核或巨噬細胞等）能夠釋放一系列的細胞因子及炎癥介質，如TNF-α、IL-6等，經過多種途徑影響靜脈血栓形成過程，其主要的途徑為通過調節靜脈內皮細胞的功能誘發血栓形成[7-8]；另一方面血栓形成過程中引起局部甚至全身炎癥反應，如纖維蛋白沉積引起組織缺血缺氧，從而刺激炎癥因子釋放。二者相互促進，呈級聯放大。同時，在血凝級聯反應過程中發揮重要作用的凝血酶激活單核細胞、內皮細胞等表達黏附分子，釋放炎癥介質[9]。激活的凝血系統與炎癥反應通過多個環節相互作用，相互交織成一個復雜的網絡系統，導致血栓形成。
LMWH是通過化學或酶學解聚的方法從普通肝素中衍生出來的片段，長度約為普通肝素的1/3，平均相對分子質量為4 500×103，其窄譜低分子質量的分布顯著優于常規肝素，具有明顯的抗凝作用，作為抗凝藥在臨床上已廣泛應用，近年來其抗炎活性也受到重視。Wan等[10]報道，給小鼠注射5 000 U/kg LMWH能有效地抑制TNF-α的表達，從而抑制白細胞沿內皮細胞上的黏附和組織浸潤。Celasco等[11]研究發現，連續3 d給大鼠直腸給藥LMWH，從所取鼠脾細胞的觀察中發現，LMWH主要通過抑制干擾素-γ（IFN-γ）的表達而起到抗炎作用，抑制NO的合成[12-13]；此外，其還經小腸屏障作用于腸內微循環后，通過白細胞與內皮細胞的相互作用而達到抗炎作用[14]。
IL-6是由免疫細胞、非免疫細胞等多種細胞分泌的作用于血管系統的細胞因子，具有多種生物活性，是炎癥反應的重要介質，是具有廣泛生物效應的多功能細胞因子，可誘導干細胞合成血漿纖維蛋白原（FIB）、C反應蛋白（CRP）等急性期蛋白，從而促進血栓形成[15]。TNF-α是由單核-巨噬細胞系統及淋巴細胞產生的細胞因子，是機體炎癥反應與免疫應答的重要調節因子。有文獻[16]報道，TNF-α在炎癥性腸病中被確定為重要的病理學炎癥介質，是介導免疫應答和炎癥反應的關鍵介質之一。TNF-α能導致內皮細胞形態和活性的改變，并且使單層內皮細胞的通透性增加并釋放大量細胞因子[17]。
本實驗通過結扎股靜脈以建立大鼠DVT模型，且彩色多普勒超聲檢查提示大鼠左下肢DVT建立成功。實驗結果顯示，術后36 h和術后72 h時3組的左下肢周徑比較差異均有統計學意義（P=0.000），均是實驗對照組 > LMWH組 > 空白對照組。分析原因可能是，LMWH組由于LMWH的抗凝作用抑制了DVT的進一步發展，從而導致LMWH組大鼠的左下肢周徑小于同時間點的實驗對照組。此外，本實驗結果還表明，術后36 h和術后72 h時3組的血清IL-6水平和TNF-α水平比較差異均有統計學意義（P=0.000），均是實驗對照組 > LMWH組 > 空白對照組。該結果提示，炎癥因子IL-6和TNF-α在DVT形成中具有重要作用，推測LMWH通過抑制大鼠DVT形成過程中IL-6和TNF-α的表達，從而達到抗炎作用[18-19]，提示抗炎作用是LMWH治療DVT的重要途徑之一，這為臨床部分病例下肢DVT發生后白細胞計數和中性粒細胞升高、經低分子肝素抗凝治療后恢復到正常范圍提供了合理的解釋，為LMWH臨床治療全身無菌性炎癥反應及DVT提供了新的理論支持，為進一步了解LMWH的抗炎作用機理提供了重要依據。此外，LMWH獨特的性質使其有望成為有效且安全的新型抗炎藥物之一。
