引用本文： 時云, 王耕, 周坤, 李文仿. Mdm2在ERα陽性乳腺癌組織中的表達及其siRNA對MCF-7細胞生物學行為的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(9): 1066-1072. doi: 10.7507/1007-9424.20160275 復制
乳腺癌細胞中雌激素作用于雌激素受體（ER），誘導靶基因轉錄以激活細胞生長，同時刺激Myc基因表達導致細胞存活，且可通過誘導抗調亡基因bcl-2的表達而抑制細胞凋亡[1]。通過清除雌激素以抑制ERα信號通路，則可導致乳腺癌細胞的生長抑制，這是他莫西芬治療乳腺癌的基礎。臨床上有70%的乳腺癌ERα呈陽性表達[2]，盡管以他莫西芬為基礎的內分泌治療對激素依賴性乳腺癌取得了一定的效果，但仍有50%的ERα陽性乳腺癌細胞對激素治療耐藥[2]。而且，部分患者從起初對內分泌治療有效逐步過渡到拮抗內分泌治療，呈現不依賴激素生長的生物學改變。乳腺癌細胞逐步發展到不依賴激素及內分泌治療是腫瘤進展的表現之一，提示乳腺癌細胞能通過改變細胞信號通路而繼續生長[3]。MDM2基因產物即Mdm2可以和野生型p53形成復合體，對p53抑癌蛋白起負調控作用，可使p53受到抑制或完全失活，從而在腫瘤的發生和發展中發揮重要的作用[4]。Mdm2也可與缺氧誘導因子1α（HIF-1α）形成復合物，在誘導血管內皮生長因子（VEGF）形成過程中發揮重要作用，此外Mdm2在轉化因子β1（TGF-β1）介導的乳腺癌細胞轉移過程中也有重要的生物學作用[5]。乳腺癌組織中伴有高的Mdm2表達，抑制MCF-7乳腺癌細胞中Mdm2的表達，可明顯增加化療藥物依托泊甙導致的細胞凋亡，而ERα可調節乳腺癌組織中Mdm2的表達[6]。因此，MDM2基因在ERα陽性乳腺癌中的作用機制、ERα與MDM2基因之間是否存在相互作用及其作用具體機理、MDM2基因是否通過拮抗P53基因影響乳腺癌細胞中ERα表達等均需進一步研究。沉默MDM2基因已經證實對多種腫瘤細胞有生長抑制并促進凋亡的作用[7]。本研究首先采用免疫組化染色方法檢測ERα陽性乳腺癌及乳腺纖維腺瘤組織中Mdm2的表達，并針對MDM2 mRNA序列的不同位點合成siRNA干擾序列，導入ERα陽性MCF-7細胞中，以最大程度抑制MDM2基因的表達。通過基因干擾方式，探討MDM2-siRNA對MCF-7細胞增殖、克隆形成和凋亡的影響，并探討其具體機理，為進一步探索乳腺癌的治療方法提供重要的科學依據。
1 資料和方法
1.1 研究對象
回顧性收集筆者所在醫院2012年6月至2015年10月期間的經病理組織學檢查確診的ERα陽性乳腺癌組織石蠟標本78例（乳腺癌組）及乳腺纖維腺瘤組織石蠟標本10例（乳腺纖維腺瘤組）。乳腺癌組患者均為女性，年齡33～56歲、（44.5±6.3）歲，其中≤45歲35例， > 45歲43例；腫瘤直徑：≤2 cm 20例，2～5 cm 38例， > 5 cm 20例；病理學類型：浸潤性小葉癌34例，浸潤性導管癌42例，其他2例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期25例，Ⅲ期26例，Ⅳ期5例；淋巴結轉移數量：0～3枚30例，4～9枚37例， > 9枚11例；組織學分級：1級24例，2級25例，3級29例。根據免疫組化判斷標準，ER和孕激素受體（PR）表達陽性定義為≥10%腫瘤細胞染色陽性，人類表皮樣生長因子受體2（HER-2）表達陽性定義為≥30%腫瘤細胞染色陽性[8]。乳腺癌組患者中，HER-2陽性20例，陰性58例。乳腺纖維腺瘤組患者均為女性患者，年齡18～42歲、（36.3±7.3）歲。乳腺纖維腺瘤患者均為單發，不合并乳腺癌或其他乳腺疾病。2組患者的年齡比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
1.2 主要材料和設備
人乳腺癌MCF-7細胞系購自武漢大學細胞庫。培養基為含10%胎牛血清的DMEM培養基，購自美國Gibco公司；Mdm2多克隆抗體購自Abcam公司（產品貨號：ab137413），Western blot顯色試劑購自美國Millipore公司，BCA試劑盒、MTT試劑盒及AnnexinV-FITC試劑盒購自碧云天生物有限公司，LipofectionTM 2000購自Invitrogen公司。MDM2基因的siRNA由上海生物工程有限公司合成，無效干擾siRNA（siRNA NC）也由該公司合成。MDM2-siRNA：5′-GCAGCAAGGCAGTCTTTAAGT-3′，無效干擾RNA沒有相應的mRNA作用靶點，序列為：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。凋亡率檢測采用美國BD公司生產的C6型流式細胞儀，電泳儀器為美國伯樂公司的BIO-RAD Powerpac HC型電泳儀，MTT細胞增殖檢測采用美國賽默飛有限公司生產的酶標儀（型號：9608）。
1.3 方法
1.3.1 免疫組化染色法檢測Mdm2的表達
通過SP免疫組化染色方法檢測ERα陽性乳腺癌及乳腺纖維腺瘤組織中Mdm2的表達。按試劑盒說明步驟，取厚度為3 μm的石蠟切片，經二甲苯脫蠟1 h后，再以濃度梯度為100%、95%及85%的乙醇入水；于加熱至98 ℃的0.1%枸櫞酸鈉溶液中抗原修復15 min，以山羊血清封閉15 min；加入Mdm2兔抗人抗體（1 : 100）4 ℃濕盒過夜，以PBS溶液洗滌3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，37 ℃孵育15 min后，以PBS溶液洗滌3次，每次5 min；滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液1滴，37 ℃孵育15 min；DAB進行顯色，蘇木精染核1 min；60 ℃烤片，85%、95%及100%梯度乙醇脫水，最后以二甲苯透明，中性樹膠封片。以不加Mdm2一抗的PBS溶液作為陰性對照，以已知高表達Mdm2的肝癌石蠟切片作為陽性對照。
1.3.2 免疫組化染色結果判定
參考文獻方法[9]，將染色強度和染色百分比結合以評估染色結果。染色強度：0分，無染色；1分，弱染色；2分，中等染色；3分，強染色。染色百分比：0分，0～20%；1分，21%～40%；2分，41%～60%；3分，61%～80%；4分，81%～100%。最終評分結果為染色強度和染色百分比的乘積，范圍為0～12分，其中0～6分定義為陰性表達，7～12分定義為陽性表達。
1.3.3 MCF-7細胞培養和轉染
采用37 ℃含5% CO2的細胞孵箱培養細胞。將MCF-7細胞分為MDM2-siRNA組、陰性對照組及空白對照組，接種到6孔板中，每組設3個復孔。當生長到80%的融合度時，采用LipofectionTM 2000轉染試劑，按說明轉染最終濃度為100 nmol/L的MDM2-siRNA（MDM2-siRNA組）或無效干擾siRNA（陰性對照組），空白對照組不加入任何試劑。最后，吸去轉染液，換入新鮮培養液繼續培養細胞48 h。
1.3.4 Western blot法檢測Mdm2的表達
上述細胞培養48 h后，采用Western blot法檢測Mdm2的表達，每個復孔重復測量3次，取均值。采用細胞裂解方法提取蛋白，蛋白濃度測定采用BCA試劑盒，具體操作根據試劑盒說明書進行。蛋白上樣量為50 μg，首先以70 V電壓跑積成膠，再以110 V電壓跑分離膠，待顯色劑溴酚藍剛好跑出凝膠時，停止電泳。蛋白轉膜采用尼龍膜，預先在無水的甲醇中浸濕2 min，然后再放在轉膜液中平衡10 min，轉膜時間為1 h。采用PBS溶液洗滌尼龍膜3次，然后加入濃度為1 : 1 000的Mdm2一抗，4 ℃過夜孵育；加入二抗，濃度為1 : 2 000，室溫條件下結合2 h，然后采用PBS溶液洗滌尼龍膜。顯影按顯影試劑盒說明書進行，將按1 : 1比例配置的顯影液滴于尼龍膜行顯色分析，最后以Quality-One軟件分析蛋白濃度，目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對表達量。
1.3.5 MTT法檢測細胞增殖
細胞分組及處理同1.3.2。轉染后繼續培養細胞，將處于對數生長期的MCF-7細胞以每孔1 000個細胞接種于96孔板中（3組均設3個復孔），置于37℃、5% CO2孵箱中繼續培養。分別于接種細胞后1、2、3和4 d以酶標儀檢測MCF-7細胞的吸光度值（OD值）。主要方法是：在細胞培養板每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h后吸棄孔內培養上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，于酶標儀上測量490 nm波長時的OD值（和增殖率呈正相關）。繪制細胞生長曲線，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標。
1.3.6 克隆形成實驗
細胞分組及處理同1.3.2。將處于對數生長期的MCF-7細胞以每孔1000個細胞接種于6孔板中（3組均設3個復孔），將細胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續培養，連續培養10 d，期間每3天換液1次。然后倒棄培養基，以4%甲醛固定30 min，再以0.1%結晶紫染色，在顯微鏡下觀察計數克隆形成數（計數各孔中的克隆數量）。每個細胞克隆由50個以上細胞組成，被結晶紫染成紫色。
1.3.7 細胞凋亡實驗
細胞分組、復孔數量及處理同1.3.2。每個復孔重復測量3次，取均值。采用AnnexinV-FITC試劑盒檢測細胞凋亡率。收集細胞培養液后，離心5 min（800 r/min，r=8 cm），小心吸去上清液，以預冷的PBS溶液洗細胞2遍，再同條件離心5 min，小心吸凈PBS溶液。加入400 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，使細胞濃度達到1×106個/mL。加入5 μL FITC標記的Annexin V，輕柔混勻，避光5 ℃孵育15 min。再加入5 μL PI，混勻（注意避光）。使用流式細胞儀進行檢測、分析。細胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。
1.4 統計學方法
數據分析采用SPSS 17.0統計分析軟件。乳腺纖維腺瘤組織及乳腺癌組織中Mdm2的表達陽性率比較采用成組χ2檢驗；乳腺癌組織中Mdm2表達與患者臨床病理特征關系的分析采用成組χ2檢驗/精確概率法（二分類資料），或趨勢χ2檢驗（等級資料）；3組細胞的Mdm2表達水平、細胞增殖率、克隆形成數量和凋亡率比較的統計方法采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.050。
2 結果
2.1 ERα陽性乳腺癌組織和乳腺纖維腺瘤組織中Mdm2的表達情況
Mdm2主要表達于乳腺癌細胞的細胞核，陽性表達呈棕黃色，呈塊狀或片狀分布（圖 1）。乳腺纖維腺瘤組織中Mdm2均呈陰性表達，表達陽性率為0；ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2陽性表達38例，陽性表達率為48.7%，高于乳腺纖維腺瘤組織（χ2=12.357，P=0.000）。
圖1
示Mdm2在乳腺纖維腺瘤和ERα陽性乳腺癌組織中的表達（SP ×200）。1A：在乳腺纖維腺瘤組織中呈陰性表達；1B：在乳腺癌組織中呈陰性表達；1C：在乳腺癌組織中呈陽性表達??圖 2示3組細胞中Mdm2的表達。1：空白對照組；2：陰性對照組；3：MDM2-siRNA組??圖 3示各時點3組細胞的細胞增殖率。同時點與空白對照組和陰性對照組比較，*P < 0.050??圖 4示3組細胞的細胞克隆形成結果。4A：空白對照組；4B：陰性對照組；4C：MDM2-siRNA組??圖 5示3組細胞的細胞凋亡率。5A：空白對照組；5B：陰性對照組；5C：MDM2-siRNA組
Figure1.
?
2.2 ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2表達與其臨床病理特征的關系
ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2表達與患者的TNM分期和淋巴結轉移數量均有關（P < 0.050），腫瘤分期越晚、淋巴結轉移數量越多，Mdm2的表達陽性率越高；而Mdm2表達與患者的年齡、腫瘤直徑、病理類型、組織學分級及HER-2表達均無關（P > 0.050），見表 1。
表1
ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2表達與患者臨床病理特征的關系〔例（%）〕
2.3 MDM2-siRNA對MCF-7細胞中Mdm2表達的影響
Western blot電泳結果表明，空白對照組、陰性對照組及MDM2-siRNA組中Mdm2的表達水平均值分別為0.687、0.675及0.156，其中MDM2-siRNA組的表達水平低于空白對照組和陰性對照組（P < 0.050），而空白對照組和陰性對照組比較差異無統計學意義（P > 0.050），見圖 2。
2.4 MDM2-siRNA對MCF-7細胞增殖的影響
空白對照組和陰性對照組的MCF-7細胞轉染1 d后開始穩步生長，2組的生長曲線未見明顯差異，而MDM2-siRNA組細胞的生長曲線低平，從2 d開始始終低于空白對照組和陰性對照組（圖 3）。轉染后1 d時3組細胞的細胞增殖率比較差異無統計學意義（P > 0.050）；在轉染后2、3及4 d時，MDM2-siRNA組的細胞增殖率均低于空白對照組和陰性對照組（P < 0.050），而各時點空白對照組和陰性對照組的細胞增殖率比較差異均無統計學意義（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明顯抑制MCF-7細胞的增殖。
2.5 MDM2-siRNA對MCF-7細胞克隆的影響
空白對照組、陰性對照組組和MDM2-siRNA組的克隆形成均數分別為237、255及58個（圖 4）。MDM2-siRNA組的細胞克隆形成數低于空白對照組和陰性對照組（P < 0.050），但空白對照組和陰性對照組的細胞克隆形成數比較差異無統計學意義（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明顯抑制MCF-7細胞的克隆形成。
2.6 MDM2-siRNA對MCF-7細胞凋亡的影響
空白對照組、陰性對照組和MDM2-siRNA組的凋亡率均值分別為6.68%、6.73%及29.85%。MDM2-siRNA組的細胞凋亡率高于空白對照組和陰性對照組（P < 0.050），但空白對照組和陰性對照組的細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明顯誘導MCF-7細胞的凋亡（圖 5）。
3 討論
MDM2基因是1987年Cahilly-Snyder等[10]首次從一個含有雙微體（double minutes，DM）的自發轉化的BALB/3T3細胞中克隆出來的一個高度擴增的基因。MDM2基因轉錄產物mRNA的長度為5.5 kb，廣泛存在于人體正常的組織器官中，以骨骼肌最多，其次為肝、肺等，與細胞的基本生理活動有關。最近研究[11]表明，在人類許多腫瘤組織中，如肺癌和結腸癌，都有MDM2基因的擴增表達。Mdm2可與p53組成自動調節反饋環[12]，一方面Mdm2能與p53酸性活化域直接結合形成p53-Mdm2復合物，抑制野生型（wild type，wt）p53介導的反式激活功能及其誘導的凋亡功能，導致腫瘤發生，但Mdm2并不能與p53緊密結合；另一方面p53能誘導Mdm2表達，此為快速動力學變化，不需要從頭合成[13]。除抑制p53功能外，Mdm2還抑制另一抑癌基因——視網膜神經膠質瘤基因（Rb），Mdm2與其C端結合，阻止其誘導細胞進入G1期阻滯的能力[14]。本研究結果表明，ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2的表達陽性率較高，而乳腺纖維腺瘤組織中未檢測到Mdm2的表達，提示Mdm2在乳腺癌的進展中扮演重要角色。
Mdm2直接干擾真核細胞分裂增殖中兩個關鍵的細胞周期調控點，即G1/S和G2/M。G1 /S調控點已證實有多條調節途徑，是細胞周期的關鍵性調控點，參與構成以磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）為中心的調節網絡。Mdm2可影響pRb功能，pRb能被Mdm2有效泛素化，導致功能喪失[13]。G2 /M期DNA損傷檢驗點是細胞進入有絲分裂前修復DNA損傷的最后時機，p53通路是最重要的DNA損傷檢驗修復分子通路之一[14]。正常情況下MDM2基因處于受抑制狀態，細胞無增殖能力，但當有致癌因素時，P53基因發生突變，失去抑癌功能，原癌基因MDM2被激活，表達相應的Mdm2與p53結合，使p53功能喪失，使腫瘤細胞異常增殖，從而促進腫瘤的發生和發展[15]。另外，研究[16]表明，Mdm2還可與多種生物因子相互作用，在乳腺癌的發展中發揮重要作用。Mdm2靶向促進多種蛋白降解，從而促進腫瘤細胞的生物學進展，包括促進P21蛋白酶體降解[17]，此外Mdm2還可與HIF-1α形成復合物誘導VEGF生成[18]。
ER是乳腺癌最常見的預后分子指標之一，2/3的乳腺癌細胞呈雌激素依賴性生長。ERα信號通路調節多種組織生長及發展活性，能促進乳腺癌細胞生長[19]。乳腺癌細胞中雌激素作用于ER，誘導靶基因轉錄而激活細胞生長，同時刺激Myc基因表達導致細胞存活，且與HER-2有交互作用[20]。通過清除雌激素抑制ERα信號通路，從而導致乳腺癌細胞生長抑制，這是他莫西芬治療乳腺癌的基礎。內分泌治療對激素依賴性乳腺癌具有一定的治療效果，但仍有50%的ERα陽性乳腺癌細胞對激素治療耐藥[2]。部分患者從起初對內分泌治療有效逐步過渡到拮抗內分泌治療，呈現不依賴激素生長的生物學改變[21]。乳腺癌患者內分泌治療逐步發展到內分泌治療抵抗，提示乳腺癌細胞通過改變細胞信號通路而繼續生長[22]。本研究結果表明，ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2的表達與年齡、腫瘤直徑、病理類型、組織學分級及HER-2表達均無關，但與患者的TNM分期及淋巴結轉移數量均有關，提示Mdm2參與ERα陽性乳腺癌的生物學進展。然而，本研究并未發現Mdm2表達與ERα陽性乳腺癌的腫瘤直徑有關，這可能與病例選擇及研究樣本量較小有關。
ERα陽性乳腺癌中伴有高的Mdm2表達，且在雌激素作用下Mdm2表達增強[23]。MDM2基因能增強ERα的功能，但機理仍不清楚[24]。在MCF-7細胞中，能通過基因敲除MDM2基因來抑制雌激素誘導的乳腺癌細胞增殖，但同時基因敲除P53并不影響MCF-7細胞的增殖，提示Mdm2并不是通過拮抗p53來促進MCF-7細胞增殖的[25]。T-47D是一種含突變P53的乳腺癌細胞，抑制該細胞中MDM2基因的表達能減弱雌激素促進T-47D細胞的生長作用，證實Mdm2不依賴于p53，還存在其他促進乳腺癌細胞生長的機理[26]。因此，ERα與MDM2基因之間是否存在相互作用、其具體作用機理等并未完全闡明。本研究結果顯示，通過沉默MDM2基因，可明顯抑制MCF-7細胞的增殖和克隆形成，并誘導MCF-7細胞凋亡，提示Mdm2是參與ERα陽性乳腺癌進展的重要生物分子。
總之，本研究結果表明，ERα陽性乳腺癌組織中存在Mdm2高表達，ERα陽性乳腺癌患者的Mdm2表達與TNM分期及淋巴結轉移數量均有關；siRNA沉默MDM2基因能抑制MCF-7細胞的增殖和克隆形成，并誘導細胞凋亡。該結果提示，Mdm2是ERα陽性乳腺癌的相對特異性的標志物，靶向Mdm2可能在ERα陽性乳腺癌患者的治療中具有一定價值。
乳腺癌細胞中雌激素作用于雌激素受體（ER），誘導靶基因轉錄以激活細胞生長，同時刺激Myc基因表達導致細胞存活，且可通過誘導抗調亡基因bcl-2的表達而抑制細胞凋亡[1]。通過清除雌激素以抑制ERα信號通路，則可導致乳腺癌細胞的生長抑制，這是他莫西芬治療乳腺癌的基礎。臨床上有70%的乳腺癌ERα呈陽性表達[2]，盡管以他莫西芬為基礎的內分泌治療對激素依賴性乳腺癌取得了一定的效果，但仍有50%的ERα陽性乳腺癌細胞對激素治療耐藥[2]。而且，部分患者從起初對內分泌治療有效逐步過渡到拮抗內分泌治療，呈現不依賴激素生長的生物學改變。乳腺癌細胞逐步發展到不依賴激素及內分泌治療是腫瘤進展的表現之一，提示乳腺癌細胞能通過改變細胞信號通路而繼續生長[3]。MDM2基因產物即Mdm2可以和野生型p53形成復合體，對p53抑癌蛋白起負調控作用，可使p53受到抑制或完全失活，從而在腫瘤的發生和發展中發揮重要的作用[4]。Mdm2也可與缺氧誘導因子1α（HIF-1α）形成復合物，在誘導血管內皮生長因子（VEGF）形成過程中發揮重要作用，此外Mdm2在轉化因子β1（TGF-β1）介導的乳腺癌細胞轉移過程中也有重要的生物學作用[5]。乳腺癌組織中伴有高的Mdm2表達，抑制MCF-7乳腺癌細胞中Mdm2的表達，可明顯增加化療藥物依托泊甙導致的細胞凋亡，而ERα可調節乳腺癌組織中Mdm2的表達[6]。因此，MDM2基因在ERα陽性乳腺癌中的作用機制、ERα與MDM2基因之間是否存在相互作用及其作用具體機理、MDM2基因是否通過拮抗P53基因影響乳腺癌細胞中ERα表達等均需進一步研究。沉默MDM2基因已經證實對多種腫瘤細胞有生長抑制并促進凋亡的作用[7]。本研究首先采用免疫組化染色方法檢測ERα陽性乳腺癌及乳腺纖維腺瘤組織中Mdm2的表達，并針對MDM2 mRNA序列的不同位點合成siRNA干擾序列，導入ERα陽性MCF-7細胞中，以最大程度抑制MDM2基因的表達。通過基因干擾方式，探討MDM2-siRNA對MCF-7細胞增殖、克隆形成和凋亡的影響，并探討其具體機理，為進一步探索乳腺癌的治療方法提供重要的科學依據。
1 資料和方法
1.1 研究對象
回顧性收集筆者所在醫院2012年6月至2015年10月期間的經病理組織學檢查確診的ERα陽性乳腺癌組織石蠟標本78例（乳腺癌組）及乳腺纖維腺瘤組織石蠟標本10例（乳腺纖維腺瘤組）。乳腺癌組患者均為女性，年齡33～56歲、（44.5±6.3）歲，其中≤45歲35例， > 45歲43例；腫瘤直徑：≤2 cm 20例，2～5 cm 38例， > 5 cm 20例；病理學類型：浸潤性小葉癌34例，浸潤性導管癌42例，其他2例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期25例，Ⅲ期26例，Ⅳ期5例；淋巴結轉移數量：0～3枚30例，4～9枚37例， > 9枚11例；組織學分級：1級24例，2級25例，3級29例。根據免疫組化判斷標準，ER和孕激素受體（PR）表達陽性定義為≥10%腫瘤細胞染色陽性，人類表皮樣生長因子受體2（HER-2）表達陽性定義為≥30%腫瘤細胞染色陽性[8]。乳腺癌組患者中，HER-2陽性20例，陰性58例。乳腺纖維腺瘤組患者均為女性患者，年齡18～42歲、（36.3±7.3）歲。乳腺纖維腺瘤患者均為單發，不合并乳腺癌或其他乳腺疾病。2組患者的年齡比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
1.2 主要材料和設備
人乳腺癌MCF-7細胞系購自武漢大學細胞庫。培養基為含10%胎牛血清的DMEM培養基，購自美國Gibco公司；Mdm2多克隆抗體購自Abcam公司（產品貨號：ab137413），Western blot顯色試劑購自美國Millipore公司，BCA試劑盒、MTT試劑盒及AnnexinV-FITC試劑盒購自碧云天生物有限公司，LipofectionTM 2000購自Invitrogen公司。MDM2基因的siRNA由上海生物工程有限公司合成，無效干擾siRNA（siRNA NC）也由該公司合成。MDM2-siRNA：5′-GCAGCAAGGCAGTCTTTAAGT-3′，無效干擾RNA沒有相應的mRNA作用靶點，序列為：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。凋亡率檢測采用美國BD公司生產的C6型流式細胞儀，電泳儀器為美國伯樂公司的BIO-RAD Powerpac HC型電泳儀，MTT細胞增殖檢測采用美國賽默飛有限公司生產的酶標儀（型號：9608）。
1.3 方法
1.3.1 免疫組化染色法檢測Mdm2的表達
通過SP免疫組化染色方法檢測ERα陽性乳腺癌及乳腺纖維腺瘤組織中Mdm2的表達。按試劑盒說明步驟，取厚度為3 μm的石蠟切片，經二甲苯脫蠟1 h后，再以濃度梯度為100%、95%及85%的乙醇入水；于加熱至98 ℃的0.1%枸櫞酸鈉溶液中抗原修復15 min，以山羊血清封閉15 min；加入Mdm2兔抗人抗體（1 : 100）4 ℃濕盒過夜，以PBS溶液洗滌3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，37 ℃孵育15 min后，以PBS溶液洗滌3次，每次5 min；滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液1滴，37 ℃孵育15 min；DAB進行顯色，蘇木精染核1 min；60 ℃烤片，85%、95%及100%梯度乙醇脫水，最后以二甲苯透明，中性樹膠封片。以不加Mdm2一抗的PBS溶液作為陰性對照，以已知高表達Mdm2的肝癌石蠟切片作為陽性對照。
1.3.2 免疫組化染色結果判定
參考文獻方法[9]，將染色強度和染色百分比結合以評估染色結果。染色強度：0分，無染色；1分，弱染色；2分，中等染色；3分，強染色。染色百分比：0分，0～20%；1分，21%～40%；2分，41%～60%；3分，61%～80%；4分，81%～100%。最終評分結果為染色強度和染色百分比的乘積，范圍為0～12分，其中0～6分定義為陰性表達，7～12分定義為陽性表達。
1.3.3 MCF-7細胞培養和轉染
采用37 ℃含5% CO2的細胞孵箱培養細胞。將MCF-7細胞分為MDM2-siRNA組、陰性對照組及空白對照組，接種到6孔板中，每組設3個復孔。當生長到80%的融合度時，采用LipofectionTM 2000轉染試劑，按說明轉染最終濃度為100 nmol/L的MDM2-siRNA（MDM2-siRNA組）或無效干擾siRNA（陰性對照組），空白對照組不加入任何試劑。最后，吸去轉染液，換入新鮮培養液繼續培養細胞48 h。
1.3.4 Western blot法檢測Mdm2的表達
上述細胞培養48 h后，采用Western blot法檢測Mdm2的表達，每個復孔重復測量3次，取均值。采用細胞裂解方法提取蛋白，蛋白濃度測定采用BCA試劑盒，具體操作根據試劑盒說明書進行。蛋白上樣量為50 μg，首先以70 V電壓跑積成膠，再以110 V電壓跑分離膠，待顯色劑溴酚藍剛好跑出凝膠時，停止電泳。蛋白轉膜采用尼龍膜，預先在無水的甲醇中浸濕2 min，然后再放在轉膜液中平衡10 min，轉膜時間為1 h。采用PBS溶液洗滌尼龍膜3次，然后加入濃度為1 : 1 000的Mdm2一抗，4 ℃過夜孵育；加入二抗，濃度為1 : 2 000，室溫條件下結合2 h，然后采用PBS溶液洗滌尼龍膜。顯影按顯影試劑盒說明書進行，將按1 : 1比例配置的顯影液滴于尼龍膜行顯色分析，最后以Quality-One軟件分析蛋白濃度，目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對表達量。
1.3.5 MTT法檢測細胞增殖
細胞分組及處理同1.3.2。轉染后繼續培養細胞，將處于對數生長期的MCF-7細胞以每孔1 000個細胞接種于96孔板中（3組均設3個復孔），置于37℃、5% CO2孵箱中繼續培養。分別于接種細胞后1、2、3和4 d以酶標儀檢測MCF-7細胞的吸光度值（OD值）。主要方法是：在細胞培養板每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h后吸棄孔內培養上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，于酶標儀上測量490 nm波長時的OD值（和增殖率呈正相關）。繪制細胞生長曲線，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標。
1.3.6 克隆形成實驗
細胞分組及處理同1.3.2。將處于對數生長期的MCF-7細胞以每孔1000個細胞接種于6孔板中（3組均設3個復孔），將細胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續培養，連續培養10 d，期間每3天換液1次。然后倒棄培養基，以4%甲醛固定30 min，再以0.1%結晶紫染色，在顯微鏡下觀察計數克隆形成數（計數各孔中的克隆數量）。每個細胞克隆由50個以上細胞組成，被結晶紫染成紫色。
1.3.7 細胞凋亡實驗
細胞分組、復孔數量及處理同1.3.2。每個復孔重復測量3次，取均值。采用AnnexinV-FITC試劑盒檢測細胞凋亡率。收集細胞培養液后，離心5 min（800 r/min，r=8 cm），小心吸去上清液，以預冷的PBS溶液洗細胞2遍，再同條件離心5 min，小心吸凈PBS溶液。加入400 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，使細胞濃度達到1×106個/mL。加入5 μL FITC標記的Annexin V，輕柔混勻，避光5 ℃孵育15 min。再加入5 μL PI，混勻（注意避光）。使用流式細胞儀進行檢測、分析。細胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。
1.4 統計學方法
數據分析采用SPSS 17.0統計分析軟件。乳腺纖維腺瘤組織及乳腺癌組織中Mdm2的表達陽性率比較采用成組χ2檢驗；乳腺癌組織中Mdm2表達與患者臨床病理特征關系的分析采用成組χ2檢驗/精確概率法（二分類資料），或趨勢χ2檢驗（等級資料）；3組細胞的Mdm2表達水平、細胞增殖率、克隆形成數量和凋亡率比較的統計方法采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.050。
2 結果
2.1 ERα陽性乳腺癌組織和乳腺纖維腺瘤組織中Mdm2的表達情況
Mdm2主要表達于乳腺癌細胞的細胞核，陽性表達呈棕黃色，呈塊狀或片狀分布（圖 1）。乳腺纖維腺瘤組織中Mdm2均呈陰性表達，表達陽性率為0；ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2陽性表達38例，陽性表達率為48.7%，高于乳腺纖維腺瘤組織（χ2=12.357，P=0.000）。
圖1
示Mdm2在乳腺纖維腺瘤和ERα陽性乳腺癌組織中的表達（SP ×200）。1A：在乳腺纖維腺瘤組織中呈陰性表達；1B：在乳腺癌組織中呈陰性表達；1C：在乳腺癌組織中呈陽性表達??圖 2示3組細胞中Mdm2的表達。1：空白對照組；2：陰性對照組；3：MDM2-siRNA組??圖 3示各時點3組細胞的細胞增殖率。同時點與空白對照組和陰性對照組比較，*P < 0.050??圖 4示3組細胞的細胞克隆形成結果。4A：空白對照組；4B：陰性對照組；4C：MDM2-siRNA組??圖 5示3組細胞的細胞凋亡率。5A：空白對照組；5B：陰性對照組；5C：MDM2-siRNA組
Figure1.
?
2.2 ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2表達與其臨床病理特征的關系
ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2表達與患者的TNM分期和淋巴結轉移數量均有關（P < 0.050），腫瘤分期越晚、淋巴結轉移數量越多，Mdm2的表達陽性率越高；而Mdm2表達與患者的年齡、腫瘤直徑、病理類型、組織學分級及HER-2表達均無關（P > 0.050），見表 1。
表1
ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2表達與患者臨床病理特征的關系〔例（%）〕
2.3 MDM2-siRNA對MCF-7細胞中Mdm2表達的影響
Western blot電泳結果表明，空白對照組、陰性對照組及MDM2-siRNA組中Mdm2的表達水平均值分別為0.687、0.675及0.156，其中MDM2-siRNA組的表達水平低于空白對照組和陰性對照組（P < 0.050），而空白對照組和陰性對照組比較差異無統計學意義（P > 0.050），見圖 2。
2.4 MDM2-siRNA對MCF-7細胞增殖的影響
空白對照組和陰性對照組的MCF-7細胞轉染1 d后開始穩步生長，2組的生長曲線未見明顯差異，而MDM2-siRNA組細胞的生長曲線低平，從2 d開始始終低于空白對照組和陰性對照組（圖 3）。轉染后1 d時3組細胞的細胞增殖率比較差異無統計學意義（P > 0.050）；在轉染后2、3及4 d時，MDM2-siRNA組的細胞增殖率均低于空白對照組和陰性對照組（P < 0.050），而各時點空白對照組和陰性對照組的細胞增殖率比較差異均無統計學意義（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明顯抑制MCF-7細胞的增殖。
2.5 MDM2-siRNA對MCF-7細胞克隆的影響
空白對照組、陰性對照組組和MDM2-siRNA組的克隆形成均數分別為237、255及58個（圖 4）。MDM2-siRNA組的細胞克隆形成數低于空白對照組和陰性對照組（P < 0.050），但空白對照組和陰性對照組的細胞克隆形成數比較差異無統計學意義（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明顯抑制MCF-7細胞的克隆形成。
2.6 MDM2-siRNA對MCF-7細胞凋亡的影響
空白對照組、陰性對照組和MDM2-siRNA組的凋亡率均值分別為6.68%、6.73%及29.85%。MDM2-siRNA組的細胞凋亡率高于空白對照組和陰性對照組（P < 0.050），但空白對照組和陰性對照組的細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明顯誘導MCF-7細胞的凋亡（圖 5）。
3 討論
MDM2基因是1987年Cahilly-Snyder等[10]首次從一個含有雙微體（double minutes，DM）的自發轉化的BALB/3T3細胞中克隆出來的一個高度擴增的基因。MDM2基因轉錄產物mRNA的長度為5.5 kb，廣泛存在于人體正常的組織器官中，以骨骼肌最多，其次為肝、肺等，與細胞的基本生理活動有關。最近研究[11]表明，在人類許多腫瘤組織中，如肺癌和結腸癌，都有MDM2基因的擴增表達。Mdm2可與p53組成自動調節反饋環[12]，一方面Mdm2能與p53酸性活化域直接結合形成p53-Mdm2復合物，抑制野生型（wild type，wt）p53介導的反式激活功能及其誘導的凋亡功能，導致腫瘤發生，但Mdm2并不能與p53緊密結合；另一方面p53能誘導Mdm2表達，此為快速動力學變化，不需要從頭合成[13]。除抑制p53功能外，Mdm2還抑制另一抑癌基因——視網膜神經膠質瘤基因（Rb），Mdm2與其C端結合，阻止其誘導細胞進入G1期阻滯的能力[14]。本研究結果表明，ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2的表達陽性率較高，而乳腺纖維腺瘤組織中未檢測到Mdm2的表達，提示Mdm2在乳腺癌的進展中扮演重要角色。
Mdm2直接干擾真核細胞分裂增殖中兩個關鍵的細胞周期調控點，即G1/S和G2/M。G1 /S調控點已證實有多條調節途徑，是細胞周期的關鍵性調控點，參與構成以磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）為中心的調節網絡。Mdm2可影響pRb功能，pRb能被Mdm2有效泛素化，導致功能喪失[13]。G2 /M期DNA損傷檢驗點是細胞進入有絲分裂前修復DNA損傷的最后時機，p53通路是最重要的DNA損傷檢驗修復分子通路之一[14]。正常情況下MDM2基因處于受抑制狀態，細胞無增殖能力，但當有致癌因素時，P53基因發生突變，失去抑癌功能，原癌基因MDM2被激活，表達相應的Mdm2與p53結合，使p53功能喪失，使腫瘤細胞異常增殖，從而促進腫瘤的發生和發展[15]。另外，研究[16]表明，Mdm2還可與多種生物因子相互作用，在乳腺癌的發展中發揮重要作用。Mdm2靶向促進多種蛋白降解，從而促進腫瘤細胞的生物學進展，包括促進P21蛋白酶體降解[17]，此外Mdm2還可與HIF-1α形成復合物誘導VEGF生成[18]。
ER是乳腺癌最常見的預后分子指標之一，2/3的乳腺癌細胞呈雌激素依賴性生長。ERα信號通路調節多種組織生長及發展活性，能促進乳腺癌細胞生長[19]。乳腺癌細胞中雌激素作用于ER，誘導靶基因轉錄而激活細胞生長，同時刺激Myc基因表達導致細胞存活，且與HER-2有交互作用[20]。通過清除雌激素抑制ERα信號通路，從而導致乳腺癌細胞生長抑制，這是他莫西芬治療乳腺癌的基礎。內分泌治療對激素依賴性乳腺癌具有一定的治療效果，但仍有50%的ERα陽性乳腺癌細胞對激素治療耐藥[2]。部分患者從起初對內分泌治療有效逐步過渡到拮抗內分泌治療，呈現不依賴激素生長的生物學改變[21]。乳腺癌患者內分泌治療逐步發展到內分泌治療抵抗，提示乳腺癌細胞通過改變細胞信號通路而繼續生長[22]。本研究結果表明，ERα陽性乳腺癌組織中Mdm2的表達與年齡、腫瘤直徑、病理類型、組織學分級及HER-2表達均無關，但與患者的TNM分期及淋巴結轉移數量均有關，提示Mdm2參與ERα陽性乳腺癌的生物學進展。然而，本研究并未發現Mdm2表達與ERα陽性乳腺癌的腫瘤直徑有關，這可能與病例選擇及研究樣本量較小有關。
ERα陽性乳腺癌中伴有高的Mdm2表達，且在雌激素作用下Mdm2表達增強[23]。MDM2基因能增強ERα的功能，但機理仍不清楚[24]。在MCF-7細胞中，能通過基因敲除MDM2基因來抑制雌激素誘導的乳腺癌細胞增殖，但同時基因敲除P53并不影響MCF-7細胞的增殖，提示Mdm2并不是通過拮抗p53來促進MCF-7細胞增殖的[25]。T-47D是一種含突變P53的乳腺癌細胞，抑制該細胞中MDM2基因的表達能減弱雌激素促進T-47D細胞的生長作用，證實Mdm2不依賴于p53，還存在其他促進乳腺癌細胞生長的機理[26]。因此，ERα與MDM2基因之間是否存在相互作用、其具體作用機理等并未完全闡明。本研究結果顯示，通過沉默MDM2基因，可明顯抑制MCF-7細胞的增殖和克隆形成，并誘導MCF-7細胞凋亡，提示Mdm2是參與ERα陽性乳腺癌進展的重要生物分子。
總之，本研究結果表明，ERα陽性乳腺癌組織中存在Mdm2高表達，ERα陽性乳腺癌患者的Mdm2表達與TNM分期及淋巴結轉移數量均有關；siRNA沉默MDM2基因能抑制MCF-7細胞的增殖和克隆形成，并誘導細胞凋亡。該結果提示，Mdm2是ERα陽性乳腺癌的相對特異性的標志物，靶向Mdm2可能在ERα陽性乳腺癌患者的治療中具有一定價值。
