引用本文： 徐進, 梁杰佳, 張偉明, 王海南. Na-K-ATP酶在重癥急性胰腺炎大鼠雙側肺組織中的表達及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(9): 1050-1055. doi: 10.7507/1007-9424.20160272 復制
重癥急性胰腺炎相關性肺損傷（severe acute pan-creatitis-acute lung injury，SAP-ALI）一直是治療重癥急性胰腺炎（SAP）的難點之一。肺損傷導致的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是SAP早期最為主要的死亡原因，也是常見的并發癥。相關研究[1-4]表明：成功地救治ARDS可以降低SAP的死亡率。因此，如何早期發現并診斷SAP-ALI的發生、如何預防和治療SAP-ALI就成為了SAP診治的重要環節，深入研究其機理對實現SAP-ALI的預防和早期診治均有重要的醫學意義。SAP-ALI的發生機理目前仍不清楚。急性肺損傷的臨床表現主要為雙側彌漫性肺水腫（濕肺），推測其肺水腫發生應與血管通透性改變、局部的靜水壓增加、肺泡細胞的水重吸收能力降低、肺泡細胞的調節因素變化等相關。其中肺泡細胞的水重吸收能力的變化是研究的一個熱點。在水重吸收過程中肺泡細胞膜上的Na-K-ATP酶起到了重要的主動轉運作用，是局部水調節的主要環節。因此筆者假設SAP時，雙側肺組織中的Na-K-ATP酶發生了變化，導致了肺水腫的發生。現筆者通過建立SD大鼠SAP模型，探討研究Na-K-ATP酶mRNA在SAP雙側肺組織中的變化規律。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料及設備
SPF級SD大鼠72只，雌雄不限，周齡6～8周，體質量250～300 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2003-0009。RNA探針和抗體購自Applied Biosystems公司，一步法熒光定量PCR試劑盒購自TAKARA公司，牛磺膽酸、苯巴比妥鈉、小牛血清蛋白粉等均購自Sigma-Aldrich公司。主要設備包括ABI PRISM 7000型熒光定量PCR儀（Applied Biosysterms公司，USA）、Harvard 683型小動物呼吸機（Harvard Apparatus公司，USA）以及UV 752分光光度計（佑科公司，上海）。
1.2 方法
1.2.1 SAP模型的制備
因肺組織肺干濕比測定、肺泡水清除率（AFC）的測量及雙側肺組織中Na-K-ATP酶mRNA表達水平檢測系獨立實驗，均需建模，因此SAP模型制備了3次（實驗期間無大鼠死亡），每次制備條件相同，每次實驗大鼠為24只。將24只SD大鼠隨機（隨機數字表法）分為空白對照組6只和SAP組18只。SAP組大鼠造模成功后，再隨機（隨機數字表法）分為SAP-4 h組、SAP-24 h組和SAP-48 h組，每組6只。SAP組大鼠給予2%苯巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術臺上。于上腹取一橫切口約2 cm長，拉出十二指腸，輕彈后，腸壁痙攣、膽總管顯現，用眼科剪刀將膽總管剪開一小口（1 mm長），將PE10管逆行插管入膽總管內，以肝門部膽管血管夾暫時阻斷后，15 s內緩慢推入5%牛磺膽酸0.2 mL，實驗造模成功的表現為胰腺全程出血水腫。空白對照組大鼠給予2%苯巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，于上腹取一橫切口約2 cm長，僅翻動上腹部腸管后關腹。
1.2.2 肺干濕比的測定
空白對照組大鼠于腹腔翻動處理4 h時，SAP-4 h組大鼠于建模4 h時，SAP-24 h組大鼠于建模24 h時，SAP-48 h組大鼠于建模48 h時，均給予2%苯巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）再次麻醉后開腹，再采用腹腔放血法處死。快速剖開胸腔，切斷氣管，放入氣管插管，然后連同雙肺一并取出。雙肺肺組織稱取濕重后，置于干燥箱（56 ℃、96 h）中干燥，取出稱干重，計算干濕比。
1.2.3 大鼠肺組織AFC值的測量
首先制備5%小牛血清蛋白溶液，37 ℃恒溫水浴箱內預熱后加入0.15 mg/mL伊文藍以制備氣管內的注射溶液。4組大鼠處理及處死時間同上。快速剖開胸腔，切斷氣管，放入氣管插管，然后連同雙肺一并取出。外面包被塑料膜，放入恒溫水浴箱內。向肺臟內注入5 mL預置的37 ℃蛋白-伊文藍溶液，注入后再注入0.2 mL空氣以確保所有的溶液進入肺泡腔。持續通氧〔100%，呼氣末的壓力為7 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）〕。60 min后將肺內的溶液吸出作為最后溶液。初始（i）和吸出（f）后的伊文藍標記的蛋白濃度通過分光光度計（波長為621 nm）測量。AFC值通過下列公式計算得出：AFC=〔1-（Ci/Cf）〕×100%。其中Ci代表注入前的蛋白濃度，Cf代表60 min通氣后的蛋白濃度。
1.2.4 采用實時定量PCR法測定雙側肺組織中Na-K-ATP酶mRNA的表達水平
4組大鼠處理及處死時間同上。將遠端肺組織樣本放入液氮中冷凍。目的基因引物參照文獻[5]，由上海捷瑞公司合成，此外內參照物（GAPDH基因）也由上海捷瑞公司設計并合成。α1亞基基因（α1 Na-K-ATP酶mRNA，產物長度為185 bp）：上游引物5′-CTTTGCTAGGACCT-CTCCTCAA-3′，下游引物5′-GAAGAATCATGTCA-GGAGCTTG-3′；β1亞基基因（β1 Na-K-ATP酶mRNA，產物長度為234 bp）：上游引物5′-TGGAGACTTACCCTCTGACGA-3′，下游引物5′-GGATTTCAGTGT-CCAAGGTGA-3′；GAPDH基因（產物長度為603 bp）：上游引物5′-GCTGGTGCTGAGTATGTCGT-3′，下游引物5′-TGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′。以RNA提取劑從肺組織中提取總RNA后，再以3.5 μL總RNA合成cDNA。PCR反應體系：3.5 μL cDNA，1.0 μL TaqMan探針，5.5 μL DEPC水，10.0 μL TaqMan PCR MIXTURE，共20.0 μL。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環；72 ℃終延伸10 min。選最低Ct值為標準樣本。Na-K-ATP酶mRNA的表達水平以Na-K-ATP酶mRNA與GAPDH mRNA的比值來表示。分別檢測4組大鼠左、右側肺組織中α1、β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，統計方法采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 4組大鼠的肺干濕比結果
與空白對照組比較，SAP-4 h組、SAP-24 h組及SAP-48 h組的肺干濕比均較低（P < 0.01）；與SAP-4 h組比較，SAP-24 h組的肺干濕比較低（P < 0.01），而SAP-48 h組的肺干濕比較高（P < 0.01）；與SAP-24 h組比較，SAP-48 h組的肺干濕比較高（P < 0.01）。見表 1。
表1
4組大鼠的肺干濕比、AFC值及Na-K-ATP酶mRNA的表達水平（x±s，n=6）
2.2 4組大鼠的AFC值結果
與空白對照組比較，SAP-4 h組及SAP-24 h組的AFC值均較高（P < 0.01），但SAP-48 h組的差異無統計學意義（P > 0.05）；與SAP-4 h組比較，SAP-24 h組和SAP-48 h組的AFC值均較低（P < 0.01）；與SAP-24 h組比較，SAP-48 h組的AFC值較低（P < 0.01）。見表 1。
2.3 4組大鼠雙側肺組織中的α1、β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達結果
α1 Na-K-ATP酶mRNA：與空白對照組對應側肺組織比較，SAP-4 h組、SAP-24 h組及SAP-48 h組左、右肺組織中，α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較高（P < 0.01）；與SAP-4 h組對應側肺組織比較，SAP-24 h組的左肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平較低（P < 0.05），而右肺組織較高（P < 0.01），而SAP-48 h組左、右肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較低（P < 0.01）；與SAP-24 h組對應側肺組織比較，SAP-48 h組左、右肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較低（P < 0.01）。空白對照組、SAP-4 h組及SAP-48 h組左、右肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），而SAP-24 h組右肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平高于左肺組織（P < 0.01）。見表 1。
β1 Na-K-ATP酶mRNA：與空白對照組對應側肺組織比較，SAP-4 h組、SAP-24 h組及SAP-48 h組左、右肺組織中，β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較高（P < 0.01）；與SAP-4 h組對應側肺組織比較，SAP-24 h組左、右肺組織中β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較高（P < 0.01），但SAP-48 h組的左肺組織與SAP-4 h組比較差異無統計學意義（P > 0.05），而右肺組織比較差異有統計學意義（P < 0.01），SAP-48 h組較低；與SAP-24 h組對應側肺組織比較，SAP-48 h組左、右肺組織中β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較低（P < 0.01）。空白對照組及SAP-48 h組左、右肺組織中β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），而SAP-4 h組和SAP-24 h組右肺組織中β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平高于左肺組織（P < 0.05）。見表 1。
3 討論
急性胰腺炎（AP）是普通外科較為常見卻難以處理的疾病，既給患者帶來了巨大的創傷，又給臨床工作者帶來了巨大的挑戰。根據國際急性胰腺炎專題研討會最新修訂的《亞特蘭大急性胰腺炎分級和分類系統（2012）》 [6]和《中國急性胰腺炎診治指南（2013）》 [7]，AP分為輕度、中度和重度。其中SAP的病死率較高，為36%～50%，如若后期合并感染則病死率極高[8]。目前對中度AP及SAP的發病機理和發生發展的認識不足，導致還不能完全預防和控制其發生和發展，這可能是中度AP和SAP的并發癥發生率和死亡率居高不下的重要原因之一。ARDS是SAP中發生最早、也是死亡率最高的并發癥，在SAP患者中其發生率高達50%以上，占SAP全部死因的60% [9]。成功地治療SAP伴發的ARDS可以直接降低SAP的死亡率，這一觀點已經被人們所認識。
SAP導致肺損傷的機理目前仍然不完全清楚。Matthay等[10]的“肺水平衡理論”認為，調節肺泡水轉運的機制主要分為兩個方面：轉運機制和調節機制。在轉運機制中，分布在肺泡細胞表面基底膜的Na-K-ATP酶的主動轉運過程被認為是最重要的[11-15]。Na-K-ATP酶是一種膜轉運蛋白，在肺組織中主要分布在Ⅱ型肺泡上皮細胞的基底膜上，它可水解ATP釋放能量，逆化學梯度轉運Na+。該酶是Na+主動轉運和肺泡腔過多液體清除的主要因素。在缺氧、麻醉等因素下Na-K-ATP酶的活性受到損害，而多巴胺、β2受體激動劑、腎上腺皮質激素、胰島素等能增強Na-K-ATP酶的基因表達和活性。
Na-K-ATP酶由兩種亞基組成，即α1亞基和β1亞基，它們以異二聚體的形式存在。在大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞和肺組織中，β1亞基的數量決定著α1亞基的活性[16]。迄今為止（至2016年），β1亞基能夠水解ATP產生能量，以3 : 2的比例，在將Na+泵出的同時將K+轉運入細胞內，并且β1亞基上還含有喹巴因結合點和磷酸化位點。但β1亞基的確切功能目前仍有爭議，其可能在Na-K-ATP酶異聚體的組裝和轉運到細胞膜指定位置上起一定作用[17]。最近有證據[18-19]表明，Na-K-ATP酶的β1亞基與細胞極化如緊密連接、橋粒形成、細胞運動及上皮細胞向間質細胞的轉化均有關。越來越多的研究[20-21]表明，肺泡上皮細胞中Na-K-ATP酶表達水平的下調與肺損傷實驗模型中肺損傷的發生有關。肺泡上皮細胞中Na-Ka-ATP酶的功能受到兩種機制的調節：①短期調節，包括增加細胞上的Na-K-ATP酶的表達數目，增強已表達的Na-K-ATP酶的活性，增強Na-K-ATP酶的親Na+活性；②通過Na-K-ATP酶基因的轉錄和轉錄后機制實現長期調節[22]。
關于SAP-ALI肺組織中Na-K-ATP酶的變化規律的報道并不多，筆者根據既往的實驗結果和文獻[23-25]推測，Na-K-ATP酶可能在SAP的肺組織中存在異常表達；同時筆者假設雙側肺組織中Na-K-ATP酶的表達也可能不同。因此，筆者首先測定了48 h內的肺干濕比，結果發現，在SAP發生24 h內，干濕比呈下降趨勢，但SAP-48 h組的干濕比有所升高。該結果提示，可能在SAP發生早期，肺泡局部存在液體重吸收能力的提高，肺泡主動吸收能力增強，這種能力可以保持24 h，因此可導致吸收 > 分泌，從而使肺干濕比下降；而隨著疾病進展，48 h時可能由于吸收能力的下降，分泌增加，從而使干濕比又有所上升。因此推測SAP早期肺臟的吸收能力是有一定的變化的，呈現先升高后下降的變化規律。
本研究通過AFC值的測定，觀察48 h時肺臟組織水重吸收能力的變化。結果表明，發生SAP后，4 h時大鼠雙肺組織的AFC值明顯升高，24 h時有所下降，到48 h時幾乎降到了正常水平。該結果提示，SAP早期肺臟水重吸收能力呈現先升高后降低的趨勢，表示肺臟水重吸收有先調節后失調的規律，與干濕比的規律相似。
進一步深入分析PCR檢測結果揭示：①α1 Na-K-ATP酶mRNA在左肺組織中于SAP 4 h時升高，24 h和48 h呈現遞減式的下降趨勢；在右肺組織中于SAP 4 h時升高，24 h時升高達到頂峰，48 h時下降；②β1 Na-K-ATP酶mRNA在左、右肺組織中均于4 h時升高，24 h時到達頂峰，48 h時下降。α1 Na-K-ATP酶mRNA在左肺于4 h時達到頂峰，這與AFC到達頂峰的時間一致，而其余指標都在24 h時到達頂峰。這也提示α1 Na-K-ATP酶mRNA可能是肺臟水重吸收的一個重要影響因素。
綜上所述，本實驗結果表明：大鼠SAP發生48 h內AFC值先升高后降低；左肺組織中α1、β1 Na-K-ATP酶mRNA表達水平的高峰時間不相同（前者為4 h，后者為24 h），右肺組織中α1、β1 Na-K-ATP酶mRNA表達水平的高峰時間均為24 h；AFC值的變化與左肺組織中α1 Na-K-AT酶mRNA的表達規律相似，提示α1 Na-K-ATP酶可能是決定SAP大鼠AFC值變化的一個重要原因，但這現象還需要更深入的研究去發現和解釋。
重癥急性胰腺炎相關性肺損傷（severe acute pan-creatitis-acute lung injury，SAP-ALI）一直是治療重癥急性胰腺炎（SAP）的難點之一。肺損傷導致的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是SAP早期最為主要的死亡原因，也是常見的并發癥。相關研究[1-4]表明：成功地救治ARDS可以降低SAP的死亡率。因此，如何早期發現并診斷SAP-ALI的發生、如何預防和治療SAP-ALI就成為了SAP診治的重要環節，深入研究其機理對實現SAP-ALI的預防和早期診治均有重要的醫學意義。SAP-ALI的發生機理目前仍不清楚。急性肺損傷的臨床表現主要為雙側彌漫性肺水腫（濕肺），推測其肺水腫發生應與血管通透性改變、局部的靜水壓增加、肺泡細胞的水重吸收能力降低、肺泡細胞的調節因素變化等相關。其中肺泡細胞的水重吸收能力的變化是研究的一個熱點。在水重吸收過程中肺泡細胞膜上的Na-K-ATP酶起到了重要的主動轉運作用，是局部水調節的主要環節。因此筆者假設SAP時，雙側肺組織中的Na-K-ATP酶發生了變化，導致了肺水腫的發生。現筆者通過建立SD大鼠SAP模型，探討研究Na-K-ATP酶mRNA在SAP雙側肺組織中的變化規律。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料及設備
SPF級SD大鼠72只，雌雄不限，周齡6～8周，體質量250～300 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2003-0009。RNA探針和抗體購自Applied Biosystems公司，一步法熒光定量PCR試劑盒購自TAKARA公司，牛磺膽酸、苯巴比妥鈉、小牛血清蛋白粉等均購自Sigma-Aldrich公司。主要設備包括ABI PRISM 7000型熒光定量PCR儀（Applied Biosysterms公司，USA）、Harvard 683型小動物呼吸機（Harvard Apparatus公司，USA）以及UV 752分光光度計（佑科公司，上海）。
1.2 方法
1.2.1 SAP模型的制備
因肺組織肺干濕比測定、肺泡水清除率（AFC）的測量及雙側肺組織中Na-K-ATP酶mRNA表達水平檢測系獨立實驗，均需建模，因此SAP模型制備了3次（實驗期間無大鼠死亡），每次制備條件相同，每次實驗大鼠為24只。將24只SD大鼠隨機（隨機數字表法）分為空白對照組6只和SAP組18只。SAP組大鼠造模成功后，再隨機（隨機數字表法）分為SAP-4 h組、SAP-24 h組和SAP-48 h組，每組6只。SAP組大鼠給予2%苯巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術臺上。于上腹取一橫切口約2 cm長，拉出十二指腸，輕彈后，腸壁痙攣、膽總管顯現，用眼科剪刀將膽總管剪開一小口（1 mm長），將PE10管逆行插管入膽總管內，以肝門部膽管血管夾暫時阻斷后，15 s內緩慢推入5%牛磺膽酸0.2 mL，實驗造模成功的表現為胰腺全程出血水腫。空白對照組大鼠給予2%苯巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，于上腹取一橫切口約2 cm長，僅翻動上腹部腸管后關腹。
1.2.2 肺干濕比的測定
空白對照組大鼠于腹腔翻動處理4 h時，SAP-4 h組大鼠于建模4 h時，SAP-24 h組大鼠于建模24 h時，SAP-48 h組大鼠于建模48 h時，均給予2%苯巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）再次麻醉后開腹，再采用腹腔放血法處死。快速剖開胸腔，切斷氣管，放入氣管插管，然后連同雙肺一并取出。雙肺肺組織稱取濕重后，置于干燥箱（56 ℃、96 h）中干燥，取出稱干重，計算干濕比。
1.2.3 大鼠肺組織AFC值的測量
首先制備5%小牛血清蛋白溶液，37 ℃恒溫水浴箱內預熱后加入0.15 mg/mL伊文藍以制備氣管內的注射溶液。4組大鼠處理及處死時間同上。快速剖開胸腔，切斷氣管，放入氣管插管，然后連同雙肺一并取出。外面包被塑料膜，放入恒溫水浴箱內。向肺臟內注入5 mL預置的37 ℃蛋白-伊文藍溶液，注入后再注入0.2 mL空氣以確保所有的溶液進入肺泡腔。持續通氧〔100%，呼氣末的壓力為7 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）〕。60 min后將肺內的溶液吸出作為最后溶液。初始（i）和吸出（f）后的伊文藍標記的蛋白濃度通過分光光度計（波長為621 nm）測量。AFC值通過下列公式計算得出：AFC=〔1-（Ci/Cf）〕×100%。其中Ci代表注入前的蛋白濃度，Cf代表60 min通氣后的蛋白濃度。
1.2.4 采用實時定量PCR法測定雙側肺組織中Na-K-ATP酶mRNA的表達水平
4組大鼠處理及處死時間同上。將遠端肺組織樣本放入液氮中冷凍。目的基因引物參照文獻[5]，由上海捷瑞公司合成，此外內參照物（GAPDH基因）也由上海捷瑞公司設計并合成。α1亞基基因（α1 Na-K-ATP酶mRNA，產物長度為185 bp）：上游引物5′-CTTTGCTAGGACCT-CTCCTCAA-3′，下游引物5′-GAAGAATCATGTCA-GGAGCTTG-3′；β1亞基基因（β1 Na-K-ATP酶mRNA，產物長度為234 bp）：上游引物5′-TGGAGACTTACCCTCTGACGA-3′，下游引物5′-GGATTTCAGTGT-CCAAGGTGA-3′；GAPDH基因（產物長度為603 bp）：上游引物5′-GCTGGTGCTGAGTATGTCGT-3′，下游引物5′-TGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′。以RNA提取劑從肺組織中提取總RNA后，再以3.5 μL總RNA合成cDNA。PCR反應體系：3.5 μL cDNA，1.0 μL TaqMan探針，5.5 μL DEPC水，10.0 μL TaqMan PCR MIXTURE，共20.0 μL。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環；72 ℃終延伸10 min。選最低Ct值為標準樣本。Na-K-ATP酶mRNA的表達水平以Na-K-ATP酶mRNA與GAPDH mRNA的比值來表示。分別檢測4組大鼠左、右側肺組織中α1、β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，統計方法采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 4組大鼠的肺干濕比結果
與空白對照組比較，SAP-4 h組、SAP-24 h組及SAP-48 h組的肺干濕比均較低（P < 0.01）；與SAP-4 h組比較，SAP-24 h組的肺干濕比較低（P < 0.01），而SAP-48 h組的肺干濕比較高（P < 0.01）；與SAP-24 h組比較，SAP-48 h組的肺干濕比較高（P < 0.01）。見表 1。
表1
4組大鼠的肺干濕比、AFC值及Na-K-ATP酶mRNA的表達水平（x±s，n=6）
2.2 4組大鼠的AFC值結果
與空白對照組比較，SAP-4 h組及SAP-24 h組的AFC值均較高（P < 0.01），但SAP-48 h組的差異無統計學意義（P > 0.05）；與SAP-4 h組比較，SAP-24 h組和SAP-48 h組的AFC值均較低（P < 0.01）；與SAP-24 h組比較，SAP-48 h組的AFC值較低（P < 0.01）。見表 1。
2.3 4組大鼠雙側肺組織中的α1、β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達結果
α1 Na-K-ATP酶mRNA：與空白對照組對應側肺組織比較，SAP-4 h組、SAP-24 h組及SAP-48 h組左、右肺組織中，α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較高（P < 0.01）；與SAP-4 h組對應側肺組織比較，SAP-24 h組的左肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平較低（P < 0.05），而右肺組織較高（P < 0.01），而SAP-48 h組左、右肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較低（P < 0.01）；與SAP-24 h組對應側肺組織比較，SAP-48 h組左、右肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較低（P < 0.01）。空白對照組、SAP-4 h組及SAP-48 h組左、右肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），而SAP-24 h組右肺組織中α1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平高于左肺組織（P < 0.01）。見表 1。
β1 Na-K-ATP酶mRNA：與空白對照組對應側肺組織比較，SAP-4 h組、SAP-24 h組及SAP-48 h組左、右肺組織中，β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較高（P < 0.01）；與SAP-4 h組對應側肺組織比較，SAP-24 h組左、右肺組織中β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較高（P < 0.01），但SAP-48 h組的左肺組織與SAP-4 h組比較差異無統計學意義（P > 0.05），而右肺組織比較差異有統計學意義（P < 0.01），SAP-48 h組較低；與SAP-24 h組對應側肺組織比較，SAP-48 h組左、右肺組織中β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平均較低（P < 0.01）。空白對照組及SAP-48 h組左、右肺組織中β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），而SAP-4 h組和SAP-24 h組右肺組織中β1 Na-K-ATP酶mRNA的表達水平高于左肺組織（P < 0.05）。見表 1。
3 討論
急性胰腺炎（AP）是普通外科較為常見卻難以處理的疾病，既給患者帶來了巨大的創傷，又給臨床工作者帶來了巨大的挑戰。根據國際急性胰腺炎專題研討會最新修訂的《亞特蘭大急性胰腺炎分級和分類系統（2012）》 [6]和《中國急性胰腺炎診治指南（2013）》 [7]，AP分為輕度、中度和重度。其中SAP的病死率較高，為36%～50%，如若后期合并感染則病死率極高[8]。目前對中度AP及SAP的發病機理和發生發展的認識不足，導致還不能完全預防和控制其發生和發展，這可能是中度AP和SAP的并發癥發生率和死亡率居高不下的重要原因之一。ARDS是SAP中發生最早、也是死亡率最高的并發癥，在SAP患者中其發生率高達50%以上，占SAP全部死因的60% [9]。成功地治療SAP伴發的ARDS可以直接降低SAP的死亡率，這一觀點已經被人們所認識。
SAP導致肺損傷的機理目前仍然不完全清楚。Matthay等[10]的“肺水平衡理論”認為，調節肺泡水轉運的機制主要分為兩個方面：轉運機制和調節機制。在轉運機制中，分布在肺泡細胞表面基底膜的Na-K-ATP酶的主動轉運過程被認為是最重要的[11-15]。Na-K-ATP酶是一種膜轉運蛋白，在肺組織中主要分布在Ⅱ型肺泡上皮細胞的基底膜上，它可水解ATP釋放能量，逆化學梯度轉運Na+。該酶是Na+主動轉運和肺泡腔過多液體清除的主要因素。在缺氧、麻醉等因素下Na-K-ATP酶的活性受到損害，而多巴胺、β2受體激動劑、腎上腺皮質激素、胰島素等能增強Na-K-ATP酶的基因表達和活性。
Na-K-ATP酶由兩種亞基組成，即α1亞基和β1亞基，它們以異二聚體的形式存在。在大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞和肺組織中，β1亞基的數量決定著α1亞基的活性[16]。迄今為止（至2016年），β1亞基能夠水解ATP產生能量，以3 : 2的比例，在將Na+泵出的同時將K+轉運入細胞內，并且β1亞基上還含有喹巴因結合點和磷酸化位點。但β1亞基的確切功能目前仍有爭議，其可能在Na-K-ATP酶異聚體的組裝和轉運到細胞膜指定位置上起一定作用[17]。最近有證據[18-19]表明，Na-K-ATP酶的β1亞基與細胞極化如緊密連接、橋粒形成、細胞運動及上皮細胞向間質細胞的轉化均有關。越來越多的研究[20-21]表明，肺泡上皮細胞中Na-K-ATP酶表達水平的下調與肺損傷實驗模型中肺損傷的發生有關。肺泡上皮細胞中Na-Ka-ATP酶的功能受到兩種機制的調節：①短期調節，包括增加細胞上的Na-K-ATP酶的表達數目，增強已表達的Na-K-ATP酶的活性，增強Na-K-ATP酶的親Na+活性；②通過Na-K-ATP酶基因的轉錄和轉錄后機制實現長期調節[22]。
關于SAP-ALI肺組織中Na-K-ATP酶的變化規律的報道并不多，筆者根據既往的實驗結果和文獻[23-25]推測，Na-K-ATP酶可能在SAP的肺組織中存在異常表達；同時筆者假設雙側肺組織中Na-K-ATP酶的表達也可能不同。因此，筆者首先測定了48 h內的肺干濕比，結果發現，在SAP發生24 h內，干濕比呈下降趨勢，但SAP-48 h組的干濕比有所升高。該結果提示，可能在SAP發生早期，肺泡局部存在液體重吸收能力的提高，肺泡主動吸收能力增強，這種能力可以保持24 h，因此可導致吸收 > 分泌，從而使肺干濕比下降；而隨著疾病進展，48 h時可能由于吸收能力的下降，分泌增加，從而使干濕比又有所上升。因此推測SAP早期肺臟的吸收能力是有一定的變化的，呈現先升高后下降的變化規律。
本研究通過AFC值的測定，觀察48 h時肺臟組織水重吸收能力的變化。結果表明，發生SAP后，4 h時大鼠雙肺組織的AFC值明顯升高，24 h時有所下降，到48 h時幾乎降到了正常水平。該結果提示，SAP早期肺臟水重吸收能力呈現先升高后降低的趨勢，表示肺臟水重吸收有先調節后失調的規律，與干濕比的規律相似。
進一步深入分析PCR檢測結果揭示：①α1 Na-K-ATP酶mRNA在左肺組織中于SAP 4 h時升高，24 h和48 h呈現遞減式的下降趨勢；在右肺組織中于SAP 4 h時升高，24 h時升高達到頂峰，48 h時下降；②β1 Na-K-ATP酶mRNA在左、右肺組織中均于4 h時升高，24 h時到達頂峰，48 h時下降。α1 Na-K-ATP酶mRNA在左肺于4 h時達到頂峰，這與AFC到達頂峰的時間一致，而其余指標都在24 h時到達頂峰。這也提示α1 Na-K-ATP酶mRNA可能是肺臟水重吸收的一個重要影響因素。
綜上所述，本實驗結果表明：大鼠SAP發生48 h內AFC值先升高后降低；左肺組織中α1、β1 Na-K-ATP酶mRNA表達水平的高峰時間不相同（前者為4 h，后者為24 h），右肺組織中α1、β1 Na-K-ATP酶mRNA表達水平的高峰時間均為24 h；AFC值的變化與左肺組織中α1 Na-K-AT酶mRNA的表達規律相似，提示α1 Na-K-ATP酶可能是決定SAP大鼠AFC值變化的一個重要原因，但這現象還需要更深入的研究去發現和解釋。
