引用本文： 陳政, 匡喬婷, 楊杰, 張強. 人臍帶間充質干細胞在活體內轉染方法的優化選擇. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(8): 922-925. doi: 10.7507/1007-9424.20160242 復制
間充質干細胞是一類具有多向分化潛能的細胞，由于其運用廣泛，越來越受到科學工作者們的關注。間充質干細胞來源廣泛，牙髓、骨髓、脂肪等都可以提取。然而，從人臍帶提取的間充質干細胞，具有同樣的分化潛能[1-4]且免疫原性更低、利用率更高等優點[5]，使得它更受科學工作者的歡迎[6-7]。確定一種更成熟、高效的活體內觀察示蹤細胞的方法，將為生物醫學工程的研究開辟一個更加廣闊的前景[8-9]，比如治療肝硬化，就可以觀察示蹤細胞在肝硬化患者體內的活動情況等[10-12]。目前，轉染細胞的方法較多，各有自己的優缺點，如存在同位素污染、操作復雜等問題，限制了各項技術的廣泛運用[13]。PKH26和慢病毒-GFP是兩種在科研上應用較為廣泛的細胞轉染方法，體外細胞轉染國內外報道較多，可用于細胞治療等方面[14-15]。本研究就兩種方法在活體內轉染的效果進行比較，找到更加有效、穩定的活體內轉染細胞的方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑和儀器
60只SD大鼠購于中山大學動物實驗中心；L-DMEM培養基，Hyclone公司；胎牛血清（FBS），Hyclone公司；胰蛋白酶，Sigma公司；PKH26染色液，Sigma公司；lipofectamine轉染試劑盒，Gibco公司；Polybrene，Sigma公司；Trizol試劑，Sigma公司；質粒試劑盒，Axygenl公司；FITC標記雙抗，北京中盟生物科技公司；多聚甲醛，北京中盟生物科技公司；Annexin V，上海美季生物科技公司；熒光顯微鏡，Olympus公司；流式細胞儀，Mill Creek公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 干細胞的分離、培養和細胞表型鑒定
經產婦同意，采集足月產胎兒臍帶。用PBS洗滌，用酶原梯度法分離、收集細胞，接種于培養瓶中，以L-DMEM培養液培養，每3 d換液1次。用胰酶消化貼壁細胞后，以1 : 2的比例傳代培養。待細胞穩定后，提取第3代穩定的干細胞，加入如下單克隆抗體：CD106-FITC，CD29-FITC，CD45-FITC，CD44-FITC，CD31-FITC，CD13-FITC，使用流式細胞儀檢測。
1.2.2 用PKH26轉染干細胞
用胰酶提取人臍帶間充質干細胞，離心10 min后加入0.5 mL稀釋劑C重懸細胞，制備細胞懸液。在離心管內配制PKH26染料應用液，將懸液與染料混合均勻。25 ℃孵化10 min后，加入1 mL FBS使染色停止。用10% FBS培養液稀釋，重懸細胞后接種于培養瓶中，用熒光顯微鏡觀察染色效果，繼續傳代培養，觀察干細胞轉染的穩定性。
1.2.3 用慢病毒-GFP轉染干細胞
同時用胰酶提取等量的人臍帶間充質干細胞懸液，離心10 min，棄去上清液。用含有10% FBS培養液鋪板293FT細胞，然后轉染293FT細胞。取培養基1 mL，加入1 mL含有脂質體和質粒的混合物。10 h后，去除復合物的培養基，加入正常培養液。48 h后，濾膜過濾即可獲得含有病毒的上清液，完成慢病毒的包裝；然后，用病毒液感染干細胞。熒光顯微鏡下觀察干細胞轉染的效果，繼續傳代培養。
1.2.4 部分肝切除模型的制備以及干細胞的移植
采用隨機分組法，把60只SD大鼠隨機分成PKH26轉染組和慢病毒-GFP組。各組SD大鼠術前均禁食12 h。把已麻醉的大鼠于劍突下縱行切開進腹，在大鼠肝臟右葉的肝蒂處結扎，切除右側肝葉。仔細分離出大鼠的門靜脈，用注射器將PKH26以及慢病毒-GFP標記的干細胞懸液（約0.5 mL）經大鼠門靜脈注入，止血徹底后，逐層縫合切口，繼續常規飼養。
1.2.5 用流式細胞儀檢測細胞轉染率和死亡率
分別于轉染后第3、8、13 d時各處死10只大鼠，取出肝臟，做成冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察。切片搗碎、離心成懸液，用20 g/L多聚甲醛固定10 min，流式細胞儀檢測標記細胞百分比；再加入AnnexinⅤ凋亡試劑檢測壞死細胞百分比，比較兩種方法在活體內轉染效率和凋亡率。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（
2 結果
2.1 干細胞的檢測
本研究經過無菌原則，采取人臍帶來源細胞，經流式細胞儀表型鑒定，此類細胞高表達CD44和CD29，不表達CD45和CD31，符合間充質干細胞的表型特征，屬于人臍帶間充質干細胞，符合下一步實驗要求。
2.2 兩種轉染方法的干細胞轉染效果
PKH26和慢病毒-GFP兩種方法標記的第3代人臍帶間充質干細胞的形態見圖 1、2。第3代干細胞呈梭形，PKH26這種紅色染料可以均勻分布在干細胞的細胞膜內，標記清晰；慢病毒-GFP標記的干細胞在熒光顯微鏡下發出綠色熒光，清晰、穩定。
圖1
示經PKH26標記的干細胞（熒光顯微鏡?×100）????圖 2?示經慢病毒-GFP標記的干細胞（熒光顯微鏡?×100）????圖 3??示用PKH26標記的干細胞在第3、8、13 d時肝臟切片中的顯示結果（熒光顯微鏡?×40）。3A：第3 d；3B：第8 d；3C：第13 d????圖 4??示用慢病毒-GFP標記的干細胞在第3、8、13 d時肝臟切片中的顯示結果（熒光顯微鏡?×40）。4A：第3 d；4B：第8 d；4C：第13 d
2.3 轉染后的干細胞在活體內3個時間點的鏡下觀察結果
細胞移植后第3 d時，兩種方法轉染的干細胞鏡下顏色清晰、明顯，區分度大，轉染效率高。隨著時間的推移，PKH26轉染的紅色逐漸變淡，顏色模糊，到第13 d時，干細胞的紅色逐漸消退；而慢病毒-GFP轉染的干細胞，3個時間點顏色都較清晰，在第8 d時達到高峰。見圖 3、4。
2.4 兩種方法轉染干細胞的效率及細胞凋亡率比較結果
通過流式細胞儀檢測兩種方法的細胞轉染效率，在第8 d和第13 d時慢病毒-GFP轉染的效率明顯高于PKH26轉染，差異有統計學意義（P < 0.05）。兩種轉染方法的細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
兩種方法轉染干細胞的效率和轉染干細胞后細胞凋亡率的比較（%，3 討論
人臍帶間充質干細胞取材方便，分化潛能好，免疫原性低，被認為是骨髓來源等干細胞的一種很好的替代品[16]。本研究采取人臍帶來源細胞，經流式細胞儀表型鑒定，此類細胞高表達CD44和CD29，不表達CD45和CD31，符合間充質干細胞的表型特性[17-19]。
研究一種細胞的特性，并在移植后如何有效地標記這種細胞，進一步觀察移植后的細胞形態、微環境下的轉歸等，一直以來是生物醫學和組織工程所面臨的問題[20]。研究者們探索了很多細胞標記的方法，如Brdu技術、Y染色體技術、DAPI技術、磁性標記[21]等，但各自都有優缺點。為了更深入研究細胞特性，需要找到一種更高效、穩定的轉染細胞的方法。
PKH26是一種可靠的示蹤劑[22-23]，也是一種帶有顏色的染料，在熒光顯微鏡下可以發散出紅光[24]。用PKH26方法轉染效率高，它可以與細胞膜穩定地結合，而轉染細胞的活性并不受影響[25]。慢病毒-GFP轉染，它可以結合轉染細胞的DNA，顯微鏡下觀察轉染細胞呈現出綠色熒光，不影響轉染細胞的原始活性和增殖力[26]。
基于以上特點，本研究采用PKH26和慢病毒-GFP兩種方法轉染人臍帶干細胞，結果發現，兩種方法轉染后，干細胞的形態均未改變，兩種轉染的顏色均穩定、清晰；干細胞膜內清晰可見PKH26的紅色染料，慢病毒-GFP的綠色熒光也清晰可見；轉染效率都很高；第3 d時，PKH26的轉染率甚至高達94.7%，略高于慢病毒-GFP的轉染效率，但隨著時間的推移，在第8 d和第13 d時，PKH26的轉染率明顯下降，且速度較快，而慢病毒-GFP轉染效率大體趨于穩定，到第8 d和第13 d時，慢病毒-GFP的轉染效率明顯高于PKH26，差異有統計學意義（P < 0.05）；而轉染后2組不同時相的細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。結果提示，兩種方法轉染后均對細胞本身的影響很小，不破壞細胞活性。有研究[27-28]證實，人臍帶間充質干細胞具有較低的免疫原性，移植后并不會引起宿主的免疫防御。但本研究是在活體大鼠體內進行，并且是異種異體移植，干細胞所處的環境差異大，區別于一般條件下的體外實驗，但仍不引起大鼠明顯異常，無撕咬，飲食及生活習性正常。
本研究提供了兩種活體內細胞標記的方法，PKH26是一種高效的、清晰的轉染方法，但更大的優勢應該用于短期的細胞觀察；而慢病毒-GFP是一種更加高效、穩定的，可用于長期細胞示蹤的方法。本研究也為干細胞在以后大量的不同活體內研究提供一定的理論基礎。
間充質干細胞是一類具有多向分化潛能的細胞，由于其運用廣泛，越來越受到科學工作者們的關注。間充質干細胞來源廣泛，牙髓、骨髓、脂肪等都可以提取。然而，從人臍帶提取的間充質干細胞，具有同樣的分化潛能[1-4]且免疫原性更低、利用率更高等優點[5]，使得它更受科學工作者的歡迎[6-7]。確定一種更成熟、高效的活體內觀察示蹤細胞的方法，將為生物醫學工程的研究開辟一個更加廣闊的前景[8-9]，比如治療肝硬化，就可以觀察示蹤細胞在肝硬化患者體內的活動情況等[10-12]。目前，轉染細胞的方法較多，各有自己的優缺點，如存在同位素污染、操作復雜等問題，限制了各項技術的廣泛運用[13]。PKH26和慢病毒-GFP是兩種在科研上應用較為廣泛的細胞轉染方法，體外細胞轉染國內外報道較多，可用于細胞治療等方面[14-15]。本研究就兩種方法在活體內轉染的效果進行比較，找到更加有效、穩定的活體內轉染細胞的方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑和儀器
60只SD大鼠購于中山大學動物實驗中心；L-DMEM培養基，Hyclone公司；胎牛血清（FBS），Hyclone公司；胰蛋白酶，Sigma公司；PKH26染色液，Sigma公司；lipofectamine轉染試劑盒，Gibco公司；Polybrene，Sigma公司；Trizol試劑，Sigma公司；質粒試劑盒，Axygenl公司；FITC標記雙抗，北京中盟生物科技公司；多聚甲醛，北京中盟生物科技公司；Annexin V，上海美季生物科技公司；熒光顯微鏡，Olympus公司；流式細胞儀，Mill Creek公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 干細胞的分離、培養和細胞表型鑒定
經產婦同意，采集足月產胎兒臍帶。用PBS洗滌，用酶原梯度法分離、收集細胞，接種于培養瓶中，以L-DMEM培養液培養，每3 d換液1次。用胰酶消化貼壁細胞后，以1 : 2的比例傳代培養。待細胞穩定后，提取第3代穩定的干細胞，加入如下單克隆抗體：CD106-FITC，CD29-FITC，CD45-FITC，CD44-FITC，CD31-FITC，CD13-FITC，使用流式細胞儀檢測。
1.2.2 用PKH26轉染干細胞
用胰酶提取人臍帶間充質干細胞，離心10 min后加入0.5 mL稀釋劑C重懸細胞，制備細胞懸液。在離心管內配制PKH26染料應用液，將懸液與染料混合均勻。25 ℃孵化10 min后，加入1 mL FBS使染色停止。用10% FBS培養液稀釋，重懸細胞后接種于培養瓶中，用熒光顯微鏡觀察染色效果，繼續傳代培養，觀察干細胞轉染的穩定性。
1.2.3 用慢病毒-GFP轉染干細胞
同時用胰酶提取等量的人臍帶間充質干細胞懸液，離心10 min，棄去上清液。用含有10% FBS培養液鋪板293FT細胞，然后轉染293FT細胞。取培養基1 mL，加入1 mL含有脂質體和質粒的混合物。10 h后，去除復合物的培養基，加入正常培養液。48 h后，濾膜過濾即可獲得含有病毒的上清液，完成慢病毒的包裝；然后，用病毒液感染干細胞。熒光顯微鏡下觀察干細胞轉染的效果，繼續傳代培養。
1.2.4 部分肝切除模型的制備以及干細胞的移植
采用隨機分組法，把60只SD大鼠隨機分成PKH26轉染組和慢病毒-GFP組。各組SD大鼠術前均禁食12 h。把已麻醉的大鼠于劍突下縱行切開進腹，在大鼠肝臟右葉的肝蒂處結扎，切除右側肝葉。仔細分離出大鼠的門靜脈，用注射器將PKH26以及慢病毒-GFP標記的干細胞懸液（約0.5 mL）經大鼠門靜脈注入，止血徹底后，逐層縫合切口，繼續常規飼養。
1.2.5 用流式細胞儀檢測細胞轉染率和死亡率
分別于轉染后第3、8、13 d時各處死10只大鼠，取出肝臟，做成冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察。切片搗碎、離心成懸液，用20 g/L多聚甲醛固定10 min，流式細胞儀檢測標記細胞百分比；再加入AnnexinⅤ凋亡試劑檢測壞死細胞百分比，比較兩種方法在活體內轉染效率和凋亡率。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（
2 結果
2.1 干細胞的檢測
本研究經過無菌原則，采取人臍帶來源細胞，經流式細胞儀表型鑒定，此類細胞高表達CD44和CD29，不表達CD45和CD31，符合間充質干細胞的表型特征，屬于人臍帶間充質干細胞，符合下一步實驗要求。
2.2 兩種轉染方法的干細胞轉染效果
PKH26和慢病毒-GFP兩種方法標記的第3代人臍帶間充質干細胞的形態見圖 1、2。第3代干細胞呈梭形，PKH26這種紅色染料可以均勻分布在干細胞的細胞膜內，標記清晰；慢病毒-GFP標記的干細胞在熒光顯微鏡下發出綠色熒光，清晰、穩定。
圖1
示經PKH26標記的干細胞（熒光顯微鏡?×100）????圖 2?示經慢病毒-GFP標記的干細胞（熒光顯微鏡?×100）????圖 3??示用PKH26標記的干細胞在第3、8、13 d時肝臟切片中的顯示結果（熒光顯微鏡?×40）。3A：第3 d；3B：第8 d；3C：第13 d????圖 4??示用慢病毒-GFP標記的干細胞在第3、8、13 d時肝臟切片中的顯示結果（熒光顯微鏡?×40）。4A：第3 d；4B：第8 d；4C：第13 d
2.3 轉染后的干細胞在活體內3個時間點的鏡下觀察結果
細胞移植后第3 d時，兩種方法轉染的干細胞鏡下顏色清晰、明顯，區分度大，轉染效率高。隨著時間的推移，PKH26轉染的紅色逐漸變淡，顏色模糊，到第13 d時，干細胞的紅色逐漸消退；而慢病毒-GFP轉染的干細胞，3個時間點顏色都較清晰，在第8 d時達到高峰。見圖 3、4。
2.4 兩種方法轉染干細胞的效率及細胞凋亡率比較結果
通過流式細胞儀檢測兩種方法的細胞轉染效率，在第8 d和第13 d時慢病毒-GFP轉染的效率明顯高于PKH26轉染，差異有統計學意義（P < 0.05）。兩種轉染方法的細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
兩種方法轉染干細胞的效率和轉染干細胞后細胞凋亡率的比較（%，3 討論
人臍帶間充質干細胞取材方便，分化潛能好，免疫原性低，被認為是骨髓來源等干細胞的一種很好的替代品[16]。本研究采取人臍帶來源細胞，經流式細胞儀表型鑒定，此類細胞高表達CD44和CD29，不表達CD45和CD31，符合間充質干細胞的表型特性[17-19]。
研究一種細胞的特性，并在移植后如何有效地標記這種細胞，進一步觀察移植后的細胞形態、微環境下的轉歸等，一直以來是生物醫學和組織工程所面臨的問題[20]。研究者們探索了很多細胞標記的方法，如Brdu技術、Y染色體技術、DAPI技術、磁性標記[21]等，但各自都有優缺點。為了更深入研究細胞特性，需要找到一種更高效、穩定的轉染細胞的方法。
PKH26是一種可靠的示蹤劑[22-23]，也是一種帶有顏色的染料，在熒光顯微鏡下可以發散出紅光[24]。用PKH26方法轉染效率高，它可以與細胞膜穩定地結合，而轉染細胞的活性并不受影響[25]。慢病毒-GFP轉染，它可以結合轉染細胞的DNA，顯微鏡下觀察轉染細胞呈現出綠色熒光，不影響轉染細胞的原始活性和增殖力[26]。
基于以上特點，本研究采用PKH26和慢病毒-GFP兩種方法轉染人臍帶干細胞，結果發現，兩種方法轉染后，干細胞的形態均未改變，兩種轉染的顏色均穩定、清晰；干細胞膜內清晰可見PKH26的紅色染料，慢病毒-GFP的綠色熒光也清晰可見；轉染效率都很高；第3 d時，PKH26的轉染率甚至高達94.7%，略高于慢病毒-GFP的轉染效率，但隨著時間的推移，在第8 d和第13 d時，PKH26的轉染率明顯下降，且速度較快，而慢病毒-GFP轉染效率大體趨于穩定，到第8 d和第13 d時，慢病毒-GFP的轉染效率明顯高于PKH26，差異有統計學意義（P < 0.05）；而轉染后2組不同時相的細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。結果提示，兩種方法轉染后均對細胞本身的影響很小，不破壞細胞活性。有研究[27-28]證實，人臍帶間充質干細胞具有較低的免疫原性，移植后并不會引起宿主的免疫防御。但本研究是在活體大鼠體內進行，并且是異種異體移植，干細胞所處的環境差異大，區別于一般條件下的體外實驗，但仍不引起大鼠明顯異常，無撕咬，飲食及生活習性正常。
本研究提供了兩種活體內細胞標記的方法，PKH26是一種高效的、清晰的轉染方法，但更大的優勢應該用于短期的細胞觀察；而慢病毒-GFP是一種更加高效、穩定的，可用于長期細胞示蹤的方法。本研究也為干細胞在以后大量的不同活體內研究提供一定的理論基礎。
