引用本文： 龔帥, 任澤強, 張蓬波, 姚丹, 劉利, 王吉科, 孫婷. 胃轉流術對非肥胖型2型糖尿病大鼠骨骼肌胰島素受體底物-1及泛素化蛋白表達的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(8): 915-921. doi: 10.7507/1007-9424.20160241 復制
1995年，Pories等[1]報道，在胃轉流術治療病態肥胖癥時，偶然發現合并有2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的患者術后血糖快速恢復了正常，糖尿病獲得了永久治愈。胃轉流術對伴病理性肥胖的T2DM患者的療效是肯定的，并得到了臨床病例回顧性研究[2-6]的肯定。那么，胃轉流術是否對非肥胖癥或輕度肥胖的T2DM也有確切控制血糖的作用呢?我們的前期研究[7-8]是以SD大鼠為造模模型，成功構建T2DM大鼠模型后，然后實行胃轉流術，研究結果已顯示其具有較好的降糖效果，并且改善了肝臟和脂肪組織的胰島素抵抗。本研究以GK大鼠為模型，GK大鼠為自發性非肥胖型糖尿病大鼠模型，主要特征有胰島β細胞分泌功能受損，胰島素分泌減少，肝糖原生成過多，肌肉和脂肪組織有中度的胰島素抵抗，與人類T2DM的進展極為相似[9-10]。本研究旨在觀察胃轉流術對GK大鼠骨骼肌組織中胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）的蛋白表達以及骨骼肌組織泛素化蛋白水平的影響，以探討胃轉流術改善非肥胖型T2DM的可能機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料和試劑
雄性GK大鼠30只，清潔級，8～12周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；健康雄性Wistar大鼠8只，清潔級，8～12周齡，購自徐州醫學院動物實驗中心。穩步血糖儀，美國強生公司；大鼠胰島素試劑盒，上海嵐派公司；IRS-1抗體，Bioworld公司；泛素（Ubiquitin，Ub）抗體，Proteintech公司；GAPDH抗體，Abcam公司；山羊抗兔抗體以及山羊抗小鼠抗體由徐州醫學院腫瘤生物研究所提供。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組
30只GK大鼠，按隨機數字表法隨機分為糖尿病手術組、糖尿病假手術組、糖尿病對照組，每組8只，其余備用。8只Wistar大鼠作為正常對照組。
1.2.2 手術方式
為了避免胃部分切除造成的攝食減少，我們在手術中保留了胃的原始容積。大鼠術前禁食12～14 h，不限飲水，3%戊巴比妥麻醉后上腹部正中切口進腹，切斷幽門，閉合十二指腸殘端，距Treitz韌帶約8～10 cm切斷空腸，遠端空腸與幽門行端端吻合，近端空腸與距此吻合口遠端12 cm行空腸端側吻合。假手術組在與手術組相同部位分別切斷十二指腸和空腸，再原位端端吻合，不改變胃腸道正常解剖結構，保持與手術組相似的手術時間。術后均用美洛西林（80×104 U/L）2～4 mL沖洗腹腔后關腹。糖尿病對照組和正常對照組無特殊處理，每日給予同手術組同等量的食物，自由飲水，以排除進食量等因素的影響。
1.3 測定指標及方法
1.3.1 空腹體重
分別于術前（手術當天）及術后第1、2、4、8周時在大鼠空腹過夜狀態下用電子稱測量其體重。
1.3.2 空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）
采用血糖儀檢測術前及術后第1、2、4、8周時各組大鼠FPG水平。
1.3.3 空腹胰島素（fasting insulin，FINS）
及穩態模式胰島素抵抗（homeostasis model-insulin resistant，HOMA-IR）指數采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測術前及術后第1、2、4、8周時各組大鼠FINS，根據“HOMA-IR=FPG×FINS/22.5”計算各組術前及術后第8周時的HOMA-IR指數。
1.3.4 IRS-1和泛素化蛋白的表達水平
應用Wes-tern blot技術檢測術后第8周時各組大鼠骨骼肌組織中IRS-1蛋白表達水平以及骨骼肌組織泛素化蛋白的水平。術后第8周時處死實驗動物取雙側腓腸肌組織于-80 ℃冰箱凍存。采用RIPA組織裂解液裂解骨骼肌組織得到組織總蛋白，應用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。從肌肉組織所獲蛋白樣品，經10% SDS-PAGE分離后，恒流200 mA轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，之后加入1 : 500的一抗稀釋液：IRS-1一抗、泛素（Ub）抗體、內參GAPDH抗體孵育過夜，再加入1 : 5 000的二抗稀釋液進行孵育并洗膜，ECL試劑發光檢測目標蛋白的表達情況，采用Image J分析軟件測定IRS-1蛋白、GAPDH以及泛素化蛋白條帶的灰度值，結果以IRS-1、泛素化蛋白與GAPDH條帶灰度值比值進行統計比較。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0軟件對數據進行分析。定量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組大鼠術前、術后空腹體重的變化
①組間比較：術前，4組間大鼠空腹體重比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后第1、2、4、8周時，糖尿病手術組大鼠空腹體重均明顯低于糖尿病假手術組、糖尿病對照組以及正常對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；術后第1、2、4周時，糖尿病假手術組大鼠體重明顯低于糖尿病對照組（P < 0.05），而在術后第8周時兩者體重比較差異無統計學意義（P > 0.05），并且與相應時相正常對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；糖尿病對照組在術后第1、2、4周時，大鼠空腹體重均明顯高于相同時相的正常對照組（P < 0.05），而在術后第8周時2組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②同一組內不同時相間比較：糖尿病手術組術后第1、2、4周時大鼠體重呈下降趨勢，與術前比較差異均有統計學意義（P < 0.05），而術后第8周時大鼠體重又呈上升趨勢，與術前比較差異無統計學意義（P > 0.05）；糖尿病假手術組術后第1周時體重與術前相比下降明顯（P < 0.05），第2周時上升，但與術前相比，差異無統計學意義（P < 0.05），而到第4周和第8周時繼續上升，與術前相比體重明顯增加（P < 0.05）；糖尿病對照組和正常對照組術后大鼠體重均呈穩步上升趨勢，至術后第8周時，2組體重均明顯高于術前，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠術前、術后體重變化（g，2.2 各組大鼠術前、術后FPG的變化
①組間比較：術前，糖尿病手術組、糖尿病假手術組、糖尿病對照組FPG均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；術后第1、2、4、8周時，糖尿病假手術組、糖尿病對照組FPG均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），但這2組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；術后第2、4、8周時，糖尿病手術組明顯低于相應時相糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），但與相應時相正常對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），術后第1周時，糖尿病手術組與其他3組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②同一組內不同時相間比較：糖尿病手術組術后第1周時FPG已開始下降，但與術前相比差異無統計學意義（P > 0.05），術后第2、4、8周時FPG繼續下降，均明顯低于術前，差異均有統計學意義（P < 0.05）；糖尿病假手術組、糖尿病對照組及正常對照組內手術前后比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠手術前、后FPG變化（mmol/L，2.3 各組大鼠術前、術后FINS變化
①組間比較：術前，4組間FINS水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后第1周和第4周時，4組之間相應時相間點FINS水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后第2周時，除糖尿病手術組明顯高于正常對照組（P < 0.05）外，其他3組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后第8周時，糖尿病手術組FINS水平明顯低于糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），與正常對照組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異亦無統計學意義（P > 0.05），但二者均明顯高于正常對照組（P < 0.05）。②同一組內不同時相間比較：糖尿病手術組FINS經歷了先上升后下降的過程，即術后第1周時呈上升趨勢，但與術前比較差異無統計學意義，到術后第2周時繼續上升，明顯高于術前水平（P < 0.05），然后開始呈下降趨勢，至術后第8周時已明顯低于術前（P < 0.05）；糖尿病假手術組、糖尿病對照組及正常對照組內手術前后比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 3。
表3
各組大鼠手術前、后FINS變化（mU/L，2.4 各組大鼠術前、術后HOMA-IR指數變化
①組間比較：術前，糖尿病手術組、糖尿病假手術組、糖尿病對照組HOMA-IR指數均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；術后第8周時，糖尿病手術組明顯低于糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），與正常對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；糖尿病假手術組、糖尿病對照組HOMA-IR指數均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），但該2組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②同一組內不同時相間比較：糖尿病手術組術后第8周時HOMA-IR指數明顯低于術前（P < 0.05），而糖尿病假手術組、糖尿病對照組及正常對照組內手術前后比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 4。
表4
各組大鼠手術前、后HOMA-IR指數變化（2.5 各組大鼠術后第8周時IRS-1蛋白表達結果
Western blot技術檢測各組大鼠術后第8周時IRS-1蛋白表達結果見圖 1。定性結果見圖 1A；半定量結果見圖 1B，IRS-1蛋白表達水平在糖尿病假手術組及糖尿病對照組均明顯低于正常對照組（P < 0.05），糖尿病手術組和正常對照組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），而糖尿病手術組明顯高于糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
各組術后第8周時IRS-1蛋白表達水平。1A：定性結果。1B：半定量結果。1：正常對照組；2：糖尿病對照組；3：糖尿病假手術組；4：糖尿病手術組。與正常對照組比較，*P < 0.05；與糖尿病假手術組比較，△P < 0.05；與糖尿病對照組比較，☆P < 0.05
2.6 各組大鼠術后第8周時泛素化蛋白的表達結果
Western blot技術檢測各組大鼠術后第8周時泛素化蛋白表達結果見圖 2。定性結果見圖 2A，結果提示，各組泛素化蛋白多以大分子蛋白為主。半定量結果見圖 2B，泛素化蛋白表達水平在糖尿病手術組、糖尿病假手術組及糖尿病對照組均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而糖尿病手術組明顯低于糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖2
各組術后第8周時泛素化蛋白表達水平。2A：定性結果。2B：半定量結果。M：Marker；1：正常對照組；2：糖尿病對照組；3：糖尿病假手術組；4：糖尿病手術組。與正常對照組比較，*P < 0.05；與糖尿病假手術組比較，△P < 0.05；與糖尿病對照組比較，☆P < 0.05
3 討論
目前胃轉流術治療肥胖癥合并T2DM已得到了全球代謝專家學者的認可[11-12]。然而，在我國T2DM患者中肥胖率僅為37.95%，大多數患者不伴有肥胖或僅有輕度肥胖，那么胃轉流術是否對非肥胖T2DM也有明顯降糖效果?本研究結果發現，糖尿病手術組的FPG從術后第1周時已開始下降，至術后第8周時，已由術前的（9.10±0.98）mmol/L降至（5.70±0.91）mmol/L，差異有統計學意義（P < 0.05），而糖尿病假手術組及糖尿病對照組手術前后FPG水平比較差異無統計學意義（P > 0.05），表明胃轉流術對非肥胖型T2DM也是有確切的降糖效果。
胰島素抵抗是T2DM的主要特征和中心環節，主要表現為肝臟、骨骼肌以及脂肪組織對胰島素敏感性及反應性降低。其中骨骼肌是人體內最大的代謝器官，在體內胰島素介導的葡萄糖攝取中大約有70%～90%是由骨骼肌完成的[13]。在胰島素抵抗的發生、發展過程中，骨骼肌是最先發生病理生理改變的組織器官之一。目前人們已基本認清胰島素信號通路的大致骨架結構，即胰島素受體/胰島素受體底物-磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸激酶通路[14-15]；然而，對于影響此信號途徑的具體分子機制的研究仍不明確[16]。其中胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）是此信號通路中重要信號傳導蛋白，其在胞內保持正常水平與活性是胰島素發揮正常生理的重要因素，IRS任何異常，如含量下降或者活性降低均可影響胞內胰島素信號轉導傳遞，從而減弱靶細胞對胰島素的敏感性，產生胰島素抵抗，其中骨骼肌中重要的傳導蛋白是IRS-1 [17]。本研究結果顯示，術后第8周時糖尿病手術組的HOMA-IR指數由術前的3.18±0.50降至1.96±0.63，差異有統計學意義（P < 0.05），明顯改善了GK大鼠胰島素抵抗。那么是如何改善胰島素抵抗呢？本研究結果發現，糖尿病手術組與糖尿病對照組和糖尿病假手術組比較，術后第8周時骨骼肌中IRS-1蛋白表達明顯增加（P < 0.05），可見胃轉流術可以上調骨骼肌胰島素信號通路中的IRS-1蛋白表達水平，改善了骨骼肌胰島素抵抗，這可能是胃轉流術降糖效果的重要機制之一。
那么胃轉流術后GK大鼠骨骼肌中IRS-1蛋白表達明顯增加的原因是什么呢？近年來研究[18]發現，在肥胖、糖尿病等眾多機體代謝紊亂的情況下，胰島素靶器官中泛素-蛋白酶體系統活性明顯上調，其在T2DM及其并發癥的發生、發展過程中起了重要作用。通過泛素-蛋白酶體系統，細胞幾乎可以對其內在的任何一種蛋白質進行高度特異性地降解，整個過程由底物蛋白的泛素化和蛋白酶體降解兩個部分組成[19]。早在胰島素抵抗研究的初期，已經發現胰島素受體和IRS-1在其酪氨酸磷酸化普遍受抑制的同時，存在大量的“分子數目缺失”[20-21]。越來越多的研究[22-25]表明，IRS的泛素化可能導致胰島素信號通路障礙，是導致T2DM發生的分子機制。本研究結果發現，術后第8周時，糖尿病模型組泛素化蛋白表達明顯高于正常對照組（P < 0.05），可見泛素-蛋白酶體系統活性上調在T2DM的發生中可能扮演了重要作用；而胃轉流術后第8周時，糖尿病手術組血糖已明顯降低的情況下，其泛素化蛋白水平卻明顯低于糖尿病對照組（P < 0.05）和糖尿病假手術組（P < 0.05），尤其是是相對分子質量180×103附近最為明顯，而IRS-1蛋白分子量恰好在這一區域，由此可以推測胃轉流術可能通過降低骨骼肌組織泛素化蛋白水平，降低了IRS-1蛋白泛素化，減少了其降解，從而上調了骨骼肌胰島素受體/胰島素受體底物-磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸激酶胰島素信號通路中的IRS-1蛋白表達，提高了骨骼肌組織的胰島素敏感性，以達到降糖效果。
本實驗僅研究了骨骼肌組織中泛素化蛋白水平的總體變化，但是并沒有進一步深層次研究能特異性識別IRS-1的E3泛素連接酶的蛋白表達情況，這將是我們后續研究的重點，從而更進一步闡明胃轉流術改善骨骼肌胰島素抵抗的具體機制。
1995年，Pories等[1]報道，在胃轉流術治療病態肥胖癥時，偶然發現合并有2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的患者術后血糖快速恢復了正常，糖尿病獲得了永久治愈。胃轉流術對伴病理性肥胖的T2DM患者的療效是肯定的，并得到了臨床病例回顧性研究[2-6]的肯定。那么，胃轉流術是否對非肥胖癥或輕度肥胖的T2DM也有確切控制血糖的作用呢?我們的前期研究[7-8]是以SD大鼠為造模模型，成功構建T2DM大鼠模型后，然后實行胃轉流術，研究結果已顯示其具有較好的降糖效果，并且改善了肝臟和脂肪組織的胰島素抵抗。本研究以GK大鼠為模型，GK大鼠為自發性非肥胖型糖尿病大鼠模型，主要特征有胰島β細胞分泌功能受損，胰島素分泌減少，肝糖原生成過多，肌肉和脂肪組織有中度的胰島素抵抗，與人類T2DM的進展極為相似[9-10]。本研究旨在觀察胃轉流術對GK大鼠骨骼肌組織中胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）的蛋白表達以及骨骼肌組織泛素化蛋白水平的影響，以探討胃轉流術改善非肥胖型T2DM的可能機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料和試劑
雄性GK大鼠30只，清潔級，8～12周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；健康雄性Wistar大鼠8只，清潔級，8～12周齡，購自徐州醫學院動物實驗中心。穩步血糖儀，美國強生公司；大鼠胰島素試劑盒，上海嵐派公司；IRS-1抗體，Bioworld公司；泛素（Ubiquitin，Ub）抗體，Proteintech公司；GAPDH抗體，Abcam公司；山羊抗兔抗體以及山羊抗小鼠抗體由徐州醫學院腫瘤生物研究所提供。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組
30只GK大鼠，按隨機數字表法隨機分為糖尿病手術組、糖尿病假手術組、糖尿病對照組，每組8只，其余備用。8只Wistar大鼠作為正常對照組。
1.2.2 手術方式
為了避免胃部分切除造成的攝食減少，我們在手術中保留了胃的原始容積。大鼠術前禁食12～14 h，不限飲水，3%戊巴比妥麻醉后上腹部正中切口進腹，切斷幽門，閉合十二指腸殘端，距Treitz韌帶約8～10 cm切斷空腸，遠端空腸與幽門行端端吻合，近端空腸與距此吻合口遠端12 cm行空腸端側吻合。假手術組在與手術組相同部位分別切斷十二指腸和空腸，再原位端端吻合，不改變胃腸道正常解剖結構，保持與手術組相似的手術時間。術后均用美洛西林（80×104 U/L）2～4 mL沖洗腹腔后關腹。糖尿病對照組和正常對照組無特殊處理，每日給予同手術組同等量的食物，自由飲水，以排除進食量等因素的影響。
1.3 測定指標及方法
1.3.1 空腹體重
分別于術前（手術當天）及術后第1、2、4、8周時在大鼠空腹過夜狀態下用電子稱測量其體重。
1.3.2 空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）
采用血糖儀檢測術前及術后第1、2、4、8周時各組大鼠FPG水平。
1.3.3 空腹胰島素（fasting insulin，FINS）
及穩態模式胰島素抵抗（homeostasis model-insulin resistant，HOMA-IR）指數采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測術前及術后第1、2、4、8周時各組大鼠FINS，根據“HOMA-IR=FPG×FINS/22.5”計算各組術前及術后第8周時的HOMA-IR指數。
1.3.4 IRS-1和泛素化蛋白的表達水平
應用Wes-tern blot技術檢測術后第8周時各組大鼠骨骼肌組織中IRS-1蛋白表達水平以及骨骼肌組織泛素化蛋白的水平。術后第8周時處死實驗動物取雙側腓腸肌組織于-80 ℃冰箱凍存。采用RIPA組織裂解液裂解骨骼肌組織得到組織總蛋白，應用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。從肌肉組織所獲蛋白樣品，經10% SDS-PAGE分離后，恒流200 mA轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，之后加入1 : 500的一抗稀釋液：IRS-1一抗、泛素（Ub）抗體、內參GAPDH抗體孵育過夜，再加入1 : 5 000的二抗稀釋液進行孵育并洗膜，ECL試劑發光檢測目標蛋白的表達情況，采用Image J分析軟件測定IRS-1蛋白、GAPDH以及泛素化蛋白條帶的灰度值，結果以IRS-1、泛素化蛋白與GAPDH條帶灰度值比值進行統計比較。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0軟件對數據進行分析。定量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組大鼠術前、術后空腹體重的變化
①組間比較：術前，4組間大鼠空腹體重比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后第1、2、4、8周時，糖尿病手術組大鼠空腹體重均明顯低于糖尿病假手術組、糖尿病對照組以及正常對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；術后第1、2、4周時，糖尿病假手術組大鼠體重明顯低于糖尿病對照組（P < 0.05），而在術后第8周時兩者體重比較差異無統計學意義（P > 0.05），并且與相應時相正常對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；糖尿病對照組在術后第1、2、4周時，大鼠空腹體重均明顯高于相同時相的正常對照組（P < 0.05），而在術后第8周時2組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②同一組內不同時相間比較：糖尿病手術組術后第1、2、4周時大鼠體重呈下降趨勢，與術前比較差異均有統計學意義（P < 0.05），而術后第8周時大鼠體重又呈上升趨勢，與術前比較差異無統計學意義（P > 0.05）；糖尿病假手術組術后第1周時體重與術前相比下降明顯（P < 0.05），第2周時上升，但與術前相比，差異無統計學意義（P < 0.05），而到第4周和第8周時繼續上升，與術前相比體重明顯增加（P < 0.05）；糖尿病對照組和正常對照組術后大鼠體重均呈穩步上升趨勢，至術后第8周時，2組體重均明顯高于術前，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠術前、術后體重變化（g，2.2 各組大鼠術前、術后FPG的變化
①組間比較：術前，糖尿病手術組、糖尿病假手術組、糖尿病對照組FPG均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；術后第1、2、4、8周時，糖尿病假手術組、糖尿病對照組FPG均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），但這2組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；術后第2、4、8周時，糖尿病手術組明顯低于相應時相糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），但與相應時相正常對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），術后第1周時，糖尿病手術組與其他3組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②同一組內不同時相間比較：糖尿病手術組術后第1周時FPG已開始下降，但與術前相比差異無統計學意義（P > 0.05），術后第2、4、8周時FPG繼續下降，均明顯低于術前，差異均有統計學意義（P < 0.05）；糖尿病假手術組、糖尿病對照組及正常對照組內手術前后比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠手術前、后FPG變化（mmol/L，2.3 各組大鼠術前、術后FINS變化
①組間比較：術前，4組間FINS水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后第1周和第4周時，4組之間相應時相間點FINS水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后第2周時，除糖尿病手術組明顯高于正常對照組（P < 0.05）外，其他3組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后第8周時，糖尿病手術組FINS水平明顯低于糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），與正常對照組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異亦無統計學意義（P > 0.05），但二者均明顯高于正常對照組（P < 0.05）。②同一組內不同時相間比較：糖尿病手術組FINS經歷了先上升后下降的過程，即術后第1周時呈上升趨勢，但與術前比較差異無統計學意義，到術后第2周時繼續上升，明顯高于術前水平（P < 0.05），然后開始呈下降趨勢，至術后第8周時已明顯低于術前（P < 0.05）；糖尿病假手術組、糖尿病對照組及正常對照組內手術前后比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 3。
表3
各組大鼠手術前、后FINS變化（mU/L，2.4 各組大鼠術前、術后HOMA-IR指數變化
①組間比較：術前，糖尿病手術組、糖尿病假手術組、糖尿病對照組HOMA-IR指數均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；術后第8周時，糖尿病手術組明顯低于糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），與正常對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；糖尿病假手術組、糖尿病對照組HOMA-IR指數均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），但該2組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②同一組內不同時相間比較：糖尿病手術組術后第8周時HOMA-IR指數明顯低于術前（P < 0.05），而糖尿病假手術組、糖尿病對照組及正常對照組內手術前后比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 4。
表4
各組大鼠手術前、后HOMA-IR指數變化（2.5 各組大鼠術后第8周時IRS-1蛋白表達結果
Western blot技術檢測各組大鼠術后第8周時IRS-1蛋白表達結果見圖 1。定性結果見圖 1A；半定量結果見圖 1B，IRS-1蛋白表達水平在糖尿病假手術組及糖尿病對照組均明顯低于正常對照組（P < 0.05），糖尿病手術組和正常對照組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），而糖尿病手術組明顯高于糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
各組術后第8周時IRS-1蛋白表達水平。1A：定性結果。1B：半定量結果。1：正常對照組；2：糖尿病對照組；3：糖尿病假手術組；4：糖尿病手術組。與正常對照組比較，*P < 0.05；與糖尿病假手術組比較，△P < 0.05；與糖尿病對照組比較，☆P < 0.05
2.6 各組大鼠術后第8周時泛素化蛋白的表達結果
Western blot技術檢測各組大鼠術后第8周時泛素化蛋白表達結果見圖 2。定性結果見圖 2A，結果提示，各組泛素化蛋白多以大分子蛋白為主。半定量結果見圖 2B，泛素化蛋白表達水平在糖尿病手術組、糖尿病假手術組及糖尿病對照組均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而糖尿病手術組明顯低于糖尿病假手術組（P < 0.05）和糖尿病對照組（P < 0.05），糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖2
各組術后第8周時泛素化蛋白表達水平。2A：定性結果。2B：半定量結果。M：Marker；1：正常對照組；2：糖尿病對照組；3：糖尿病假手術組；4：糖尿病手術組。與正常對照組比較，*P < 0.05；與糖尿病假手術組比較，△P < 0.05；與糖尿病對照組比較，☆P < 0.05
3 討論
目前胃轉流術治療肥胖癥合并T2DM已得到了全球代謝專家學者的認可[11-12]。然而，在我國T2DM患者中肥胖率僅為37.95%，大多數患者不伴有肥胖或僅有輕度肥胖，那么胃轉流術是否對非肥胖T2DM也有明顯降糖效果?本研究結果發現，糖尿病手術組的FPG從術后第1周時已開始下降，至術后第8周時，已由術前的（9.10±0.98）mmol/L降至（5.70±0.91）mmol/L，差異有統計學意義（P < 0.05），而糖尿病假手術組及糖尿病對照組手術前后FPG水平比較差異無統計學意義（P > 0.05），表明胃轉流術對非肥胖型T2DM也是有確切的降糖效果。
胰島素抵抗是T2DM的主要特征和中心環節，主要表現為肝臟、骨骼肌以及脂肪組織對胰島素敏感性及反應性降低。其中骨骼肌是人體內最大的代謝器官，在體內胰島素介導的葡萄糖攝取中大約有70%～90%是由骨骼肌完成的[13]。在胰島素抵抗的發生、發展過程中，骨骼肌是最先發生病理生理改變的組織器官之一。目前人們已基本認清胰島素信號通路的大致骨架結構，即胰島素受體/胰島素受體底物-磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸激酶通路[14-15]；然而，對于影響此信號途徑的具體分子機制的研究仍不明確[16]。其中胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）是此信號通路中重要信號傳導蛋白，其在胞內保持正常水平與活性是胰島素發揮正常生理的重要因素，IRS任何異常，如含量下降或者活性降低均可影響胞內胰島素信號轉導傳遞，從而減弱靶細胞對胰島素的敏感性，產生胰島素抵抗，其中骨骼肌中重要的傳導蛋白是IRS-1 [17]。本研究結果顯示，術后第8周時糖尿病手術組的HOMA-IR指數由術前的3.18±0.50降至1.96±0.63，差異有統計學意義（P < 0.05），明顯改善了GK大鼠胰島素抵抗。那么是如何改善胰島素抵抗呢？本研究結果發現，糖尿病手術組與糖尿病對照組和糖尿病假手術組比較，術后第8周時骨骼肌中IRS-1蛋白表達明顯增加（P < 0.05），可見胃轉流術可以上調骨骼肌胰島素信號通路中的IRS-1蛋白表達水平，改善了骨骼肌胰島素抵抗，這可能是胃轉流術降糖效果的重要機制之一。
那么胃轉流術后GK大鼠骨骼肌中IRS-1蛋白表達明顯增加的原因是什么呢？近年來研究[18]發現，在肥胖、糖尿病等眾多機體代謝紊亂的情況下，胰島素靶器官中泛素-蛋白酶體系統活性明顯上調，其在T2DM及其并發癥的發生、發展過程中起了重要作用。通過泛素-蛋白酶體系統，細胞幾乎可以對其內在的任何一種蛋白質進行高度特異性地降解，整個過程由底物蛋白的泛素化和蛋白酶體降解兩個部分組成[19]。早在胰島素抵抗研究的初期，已經發現胰島素受體和IRS-1在其酪氨酸磷酸化普遍受抑制的同時，存在大量的“分子數目缺失”[20-21]。越來越多的研究[22-25]表明，IRS的泛素化可能導致胰島素信號通路障礙，是導致T2DM發生的分子機制。本研究結果發現，術后第8周時，糖尿病模型組泛素化蛋白表達明顯高于正常對照組（P < 0.05），可見泛素-蛋白酶體系統活性上調在T2DM的發生中可能扮演了重要作用；而胃轉流術后第8周時，糖尿病手術組血糖已明顯降低的情況下，其泛素化蛋白水平卻明顯低于糖尿病對照組（P < 0.05）和糖尿病假手術組（P < 0.05），尤其是是相對分子質量180×103附近最為明顯，而IRS-1蛋白分子量恰好在這一區域，由此可以推測胃轉流術可能通過降低骨骼肌組織泛素化蛋白水平，降低了IRS-1蛋白泛素化，減少了其降解，從而上調了骨骼肌胰島素受體/胰島素受體底物-磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸激酶胰島素信號通路中的IRS-1蛋白表達，提高了骨骼肌組織的胰島素敏感性，以達到降糖效果。
本實驗僅研究了骨骼肌組織中泛素化蛋白水平的總體變化，但是并沒有進一步深層次研究能特異性識別IRS-1的E3泛素連接酶的蛋白表達情況，這將是我們后續研究的重點，從而更進一步闡明胃轉流術改善骨骼肌胰島素抵抗的具體機制。
