引用本文： 陳永生, 吳碩東, 孔靜. NHE3在膽固醇結石膽囊組織中的表達. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(7): 861-863. doi: 10.7507/1007-9424.20160223 復制
膽囊膽固醇結石是膽管系統最常見疾病之一，遺傳和環境因素是其發病的重要誘因。長期以來，肝臟脂質代謝異常導致膽汁中膽固醇過飽和被認為是其發病的主要因素，而膽固醇飽和指數（cholesterol saturation index，CSI)也一直被當做膽固醇結晶成核的可靠依據。然而有研究[1]發現，盡管膽固醇結石患者肝膽汁的CSI較高，其膽固醇結晶析出速率卻明顯慢于對應的膽囊膽汁（更加濃縮的膽汁）。同時，隨著膽汁的稀釋，膽固醇析出時間逐漸延長。這些現象提示：膽汁濃度是膽固醇結晶形成的另一個重要因素。
膽囊具有很強的吸收功能，可以將肝膽汁濃縮4～5倍，使其脂質濃度升高。研究[2-3]表明，膽固醇結石形成前期，膽囊濃縮功能異常增強并增加膽汁的致石性。膽汁濃縮即膽汁中水和離子的去除需要眾多離子轉運系統的參與，其最終結果是Na+和Cl-的凈吸收[4]。上述過程主要由表達于膽囊黏膜上皮細胞（gallbladder epithelial cells，GBECs)頂質膜的Na+/H+交換蛋白（Na+/H+ exchanger，NHE）和Cl-/HCO3-交換蛋白（Cl-/HCO3-anion exchanger，AE）的介導。然而，膽固醇結石形成過程中上述蛋白的表達及功能是否出現異常進而導致膽囊濃縮功能改變一直沒能被重視和研究。Narins等[5]證明，膽囊上皮細胞存在NHE3的表達，這一發現提示該蛋白的功能異常可能參與膽固醇結石的形成過程。因此，本研究主要觀察了NHE3在正常和膽固醇結石患者膽囊黏膜上皮細胞中的表達情況，并探討NHE3表達異常與膽囊濃縮功能改變及結石形成的關系。
1 材料和方法
1.1 標本來源
膽囊標本來自中國醫科大學附屬盛京醫院膽道外科2014年1月至2014年6月期間行膽囊切除且臨床資料完整的26例患者，其中因膽囊結石而行膽囊切除者16例（結石組），平均年齡54.2歲；因其他原因（肝血管瘤切除合并膽囊切除，膽囊腺瘤性息肉或膽囊腺肌癥）切除膽囊者10例（對照組），平均年齡52.6歲。所有結石均為膽固醇結石；對照組的膽囊黏膜組織均經術后病理學檢查證實為正常膽囊黏膜組織。所有操作均取得患者及家屬知情同意。本研究通過了中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會的批準。
1.2 方法
1.2.1 主要材料和試劑
NHE3兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自北京碧云天生物技術有限公司；ECL發光液購自上海七海生物科技有限公司；免疫組織化學SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2.2 Western blot法檢測膽囊組織中NHE3蛋白含量
分別提取各膽囊組織總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，按每孔40μg總蛋白量上樣，SDS-PAGE電泳（濃縮膠濃度5%，分離膠濃度8%，80 V，3 h）分離蛋白后，濕法轉印至PVDF膜上（300 mA，1.5 h）。5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1.5 h，分別在封閉液稀釋的一抗溶液NHE3（sc-16103-R，Santa Cruz，1:200）、GAPDH（sc-365062，Santa Cruz，1:10 000）中4℃孵育過夜。洗膜后與辣根過氧化物酶標記的相應二抗（1:1 000）室溫下孵育2 h，ECL化學發光系統檢測反應產物信號。每個樣本重復3次、取平均值，目標蛋白的相對表達量以其與內參GAPDH相對比值表示。
1.2.3 免疫組織化學法檢測NHE3蛋白在膽囊黏膜上皮細胞的表達及定位
取膽囊組織經4%中性甲醛液固定，石蠟包埋，4μm厚組織切片，常規脫蠟水化。3% H2O2去離子水室溫下孵育20 min，抗原修復液37℃孵育25 min，山羊血清封閉，37℃下孵育30 min，4℃孵育一抗NHE3（sc-16103-R，Santa Cruz，1:200）過夜。第2天依次室溫孵育生物素化通用二抗工作液、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復染，最后組織經脫水透明后烘干封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 2組膽囊黏膜上皮細胞中NHE3蛋白表達檢測結果
結石組膽囊黏膜上皮細胞中NHE3蛋白相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），提示NHE3表達增強可能與膽囊膽固醇結石發病相關（圖 1）。
圖1
示Western blot法檢測膽囊黏膜上皮細胞中NHE3蛋白的表達。1A：電泳圖；1B：NHE3蛋白相對表達量，與對照組比較：*P=0.012 圖 2示膽囊組織中NHE3蛋白的表達，見NHE3蛋白僅表達于膽囊黏膜上皮細胞中，而在黏膜下層及肌層無表達，且NHE3蛋白表達于柱狀上皮細胞的頂質膜和胞漿內（免疫組化SP染色×400）。2A：正常膽囊；2B：膽固醇結石膽囊
2.2 NHE3蛋白在膽囊黏膜上皮細胞的定位
免疫組織化學檢測結果顯示：NHE3蛋白在結石組和對照組膽囊黏膜上皮細胞的定位基本相似。NHE3蛋白表達于柱狀上皮細胞的頂質膜和胞漿內，其中在細胞頂質膜上的表達略高。提示在膽囊黏膜上皮細胞內NHE3蛋白可以往返于細胞頂質膜和胞漿內并借此改變其轉運功能。黏膜下的固有層及肌層缺乏NHE3蛋白表達（圖 2）。當采用PBS代替一抗時無免疫染色顯示。
3 討論
NHE3在膽囊黏膜的離子轉運及膽囊膽汁濃縮過程中起重要作用，但是至今還沒有研究采用人膽囊標本檢測NHE3的表達并分析其與膽固醇結石形成的關系。并且，NHE3在膽囊黏膜上皮的亞細胞定位情況更無報道。本研究證明了NHE3廣泛地表達于人膽囊黏膜上皮細胞內，且在細胞頂質膜面存在局部高表達。此外，本研究還發現，結石組膽囊黏膜上皮細胞中NHE3蛋白表達明顯高于對照組（P < 0.05）。該發現支持NHE3表達增高導致膽囊濃縮功能增強，進而促進膽固醇結晶和結石形成的假說。
膽囊濃縮功能增強是許多膽囊疾病特別是膽固醇結石的一個重要致病因素，但其發生機理不清。生理狀態下，蛋白激酶C、鈣調蛋白和蛋白激酶A通過抑制Na+和Cl-的吸收速率來降低膽囊的濃縮功能。在致石飲食的影響下，以上抑制作用減弱，膽囊吸收增強[6]。Giurgiu等[7]研究表明，膽囊結石形成前期Na+吸收增強，這一現象是NHE活性增強的結果[8]。這也與本研究中結石組膽囊NHE3蛋白表達增高的現象相符合。NHE3可以往返于細胞頂質膜和胞漿內，這是調節其離子轉運速率的機理之一[9-11]。本研究免疫組化結果發現，人膽囊黏膜上皮細胞頂質膜和胞漿內均表達NHE3。提示如同許多其他組織一樣，人膽囊黏膜上皮細胞中NHE3可能通過改變其表達于細胞頂質膜的蛋白含量這一機理而改變其離子轉運活性。
膽囊吸收功能異常僅發生在膽囊膽汁過飽和之后，所以膽囊黏膜與致石膽汁的直接接觸很可能是這一事件的始動因素[12]。當膽囊黏膜暴露于過飽和膽汁時，膽囊上皮細胞中膽固醇含量增高，同時細胞膜的流動性改變。細胞膜膽固醇含量與NHE3活性的關系已被許多實驗證實。采用甲基-β-環糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）降低膜膽固醇含量可以降低NHE3的功能，進而降低細胞Na+/H+交換活性[13-14]，恢復膽固醇含量可以逆轉這一作用。所以，不難推測，當細胞膜膽固醇含量增高時，NHE3活性增高，膽囊濃縮功能增強。盡管如此，這些現象背后的分子機理還需要進一步研究。
當然，NHE3僅僅在蛋白水平表達的增高并不一定導致轉運功能增強，因為NHE3功能調節還包括其他機理。遺憾的是，本研究沒能對膽囊黏膜上皮細胞NHE3離子轉運功能進行檢測，這是本研究的不足之處。膽囊黏膜上皮細胞的離子轉運速率受諸如神經、體液、膽汁脂質濃度等多種因素調節。在人體的所有組織之中，膽囊黏膜上皮細胞最長時間地暴露于最高脂質濃度的膽汁里，這一情形使其離子轉運的影響因素更加復雜化。所以，目前還沒有可靠的技術手段來模擬上皮細胞所處的特殊環境并對離子轉運活性進行體外實驗檢測。此外，與狗和小鼠不同，人膽囊黏膜上皮細胞的培養本身就更具技術挑戰。未來，針對NHE3轉運功能的方法學研究將為揭示膽囊黏膜離子轉運與膽固醇結石形成的關系提供有效的技術支持。
綜上，本研究證明了NHE3同時表達于人膽囊黏膜上皮細胞頂質膜和胞漿內。膽固醇結石患者膽囊NHE3在蛋白水平表達增高。這些發現提示NHE3功能異常可能與膽囊膽固醇結石發病相關，但其機理仍有待進一步研究證實。
膽囊膽固醇結石是膽管系統最常見疾病之一，遺傳和環境因素是其發病的重要誘因。長期以來，肝臟脂質代謝異常導致膽汁中膽固醇過飽和被認為是其發病的主要因素，而膽固醇飽和指數（cholesterol saturation index，CSI)也一直被當做膽固醇結晶成核的可靠依據。然而有研究[1]發現，盡管膽固醇結石患者肝膽汁的CSI較高，其膽固醇結晶析出速率卻明顯慢于對應的膽囊膽汁（更加濃縮的膽汁）。同時，隨著膽汁的稀釋，膽固醇析出時間逐漸延長。這些現象提示：膽汁濃度是膽固醇結晶形成的另一個重要因素。
膽囊具有很強的吸收功能，可以將肝膽汁濃縮4～5倍，使其脂質濃度升高。研究[2-3]表明，膽固醇結石形成前期，膽囊濃縮功能異常增強并增加膽汁的致石性。膽汁濃縮即膽汁中水和離子的去除需要眾多離子轉運系統的參與，其最終結果是Na+和Cl-的凈吸收[4]。上述過程主要由表達于膽囊黏膜上皮細胞（gallbladder epithelial cells，GBECs)頂質膜的Na+/H+交換蛋白（Na+/H+ exchanger，NHE）和Cl-/HCO3-交換蛋白（Cl-/HCO3-anion exchanger，AE）的介導。然而，膽固醇結石形成過程中上述蛋白的表達及功能是否出現異常進而導致膽囊濃縮功能改變一直沒能被重視和研究。Narins等[5]證明，膽囊上皮細胞存在NHE3的表達，這一發現提示該蛋白的功能異常可能參與膽固醇結石的形成過程。因此，本研究主要觀察了NHE3在正常和膽固醇結石患者膽囊黏膜上皮細胞中的表達情況，并探討NHE3表達異常與膽囊濃縮功能改變及結石形成的關系。
1 材料和方法
1.1 標本來源
膽囊標本來自中國醫科大學附屬盛京醫院膽道外科2014年1月至2014年6月期間行膽囊切除且臨床資料完整的26例患者，其中因膽囊結石而行膽囊切除者16例（結石組），平均年齡54.2歲；因其他原因（肝血管瘤切除合并膽囊切除，膽囊腺瘤性息肉或膽囊腺肌癥）切除膽囊者10例（對照組），平均年齡52.6歲。所有結石均為膽固醇結石；對照組的膽囊黏膜組織均經術后病理學檢查證實為正常膽囊黏膜組織。所有操作均取得患者及家屬知情同意。本研究通過了中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會的批準。
1.2 方法
1.2.1 主要材料和試劑
NHE3兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自北京碧云天生物技術有限公司；ECL發光液購自上海七海生物科技有限公司；免疫組織化學SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2.2 Western blot法檢測膽囊組織中NHE3蛋白含量
分別提取各膽囊組織總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，按每孔40μg總蛋白量上樣，SDS-PAGE電泳（濃縮膠濃度5%，分離膠濃度8%，80 V，3 h）分離蛋白后，濕法轉印至PVDF膜上（300 mA，1.5 h）。5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1.5 h，分別在封閉液稀釋的一抗溶液NHE3（sc-16103-R，Santa Cruz，1:200）、GAPDH（sc-365062，Santa Cruz，1:10 000）中4℃孵育過夜。洗膜后與辣根過氧化物酶標記的相應二抗（1:1 000）室溫下孵育2 h，ECL化學發光系統檢測反應產物信號。每個樣本重復3次、取平均值，目標蛋白的相對表達量以其與內參GAPDH相對比值表示。
1.2.3 免疫組織化學法檢測NHE3蛋白在膽囊黏膜上皮細胞的表達及定位
取膽囊組織經4%中性甲醛液固定，石蠟包埋，4μm厚組織切片，常規脫蠟水化。3% H2O2去離子水室溫下孵育20 min，抗原修復液37℃孵育25 min，山羊血清封閉，37℃下孵育30 min，4℃孵育一抗NHE3（sc-16103-R，Santa Cruz，1:200）過夜。第2天依次室溫孵育生物素化通用二抗工作液、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復染，最后組織經脫水透明后烘干封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 2組膽囊黏膜上皮細胞中NHE3蛋白表達檢測結果
結石組膽囊黏膜上皮細胞中NHE3蛋白相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），提示NHE3表達增強可能與膽囊膽固醇結石發病相關（圖 1）。
圖1
示Western blot法檢測膽囊黏膜上皮細胞中NHE3蛋白的表達。1A：電泳圖；1B：NHE3蛋白相對表達量，與對照組比較：*P=0.012 圖 2示膽囊組織中NHE3蛋白的表達，見NHE3蛋白僅表達于膽囊黏膜上皮細胞中，而在黏膜下層及肌層無表達，且NHE3蛋白表達于柱狀上皮細胞的頂質膜和胞漿內（免疫組化SP染色×400）。2A：正常膽囊；2B：膽固醇結石膽囊
2.2 NHE3蛋白在膽囊黏膜上皮細胞的定位
免疫組織化學檢測結果顯示：NHE3蛋白在結石組和對照組膽囊黏膜上皮細胞的定位基本相似。NHE3蛋白表達于柱狀上皮細胞的頂質膜和胞漿內，其中在細胞頂質膜上的表達略高。提示在膽囊黏膜上皮細胞內NHE3蛋白可以往返于細胞頂質膜和胞漿內并借此改變其轉運功能。黏膜下的固有層及肌層缺乏NHE3蛋白表達（圖 2）。當采用PBS代替一抗時無免疫染色顯示。
3 討論
NHE3在膽囊黏膜的離子轉運及膽囊膽汁濃縮過程中起重要作用，但是至今還沒有研究采用人膽囊標本檢測NHE3的表達并分析其與膽固醇結石形成的關系。并且，NHE3在膽囊黏膜上皮的亞細胞定位情況更無報道。本研究證明了NHE3廣泛地表達于人膽囊黏膜上皮細胞內，且在細胞頂質膜面存在局部高表達。此外，本研究還發現，結石組膽囊黏膜上皮細胞中NHE3蛋白表達明顯高于對照組（P < 0.05）。該發現支持NHE3表達增高導致膽囊濃縮功能增強，進而促進膽固醇結晶和結石形成的假說。
膽囊濃縮功能增強是許多膽囊疾病特別是膽固醇結石的一個重要致病因素，但其發生機理不清。生理狀態下，蛋白激酶C、鈣調蛋白和蛋白激酶A通過抑制Na+和Cl-的吸收速率來降低膽囊的濃縮功能。在致石飲食的影響下，以上抑制作用減弱，膽囊吸收增強[6]。Giurgiu等[7]研究表明，膽囊結石形成前期Na+吸收增強，這一現象是NHE活性增強的結果[8]。這也與本研究中結石組膽囊NHE3蛋白表達增高的現象相符合。NHE3可以往返于細胞頂質膜和胞漿內，這是調節其離子轉運速率的機理之一[9-11]。本研究免疫組化結果發現，人膽囊黏膜上皮細胞頂質膜和胞漿內均表達NHE3。提示如同許多其他組織一樣，人膽囊黏膜上皮細胞中NHE3可能通過改變其表達于細胞頂質膜的蛋白含量這一機理而改變其離子轉運活性。
膽囊吸收功能異常僅發生在膽囊膽汁過飽和之后，所以膽囊黏膜與致石膽汁的直接接觸很可能是這一事件的始動因素[12]。當膽囊黏膜暴露于過飽和膽汁時，膽囊上皮細胞中膽固醇含量增高，同時細胞膜的流動性改變。細胞膜膽固醇含量與NHE3活性的關系已被許多實驗證實。采用甲基-β-環糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）降低膜膽固醇含量可以降低NHE3的功能，進而降低細胞Na+/H+交換活性[13-14]，恢復膽固醇含量可以逆轉這一作用。所以，不難推測，當細胞膜膽固醇含量增高時，NHE3活性增高，膽囊濃縮功能增強。盡管如此，這些現象背后的分子機理還需要進一步研究。
當然，NHE3僅僅在蛋白水平表達的增高并不一定導致轉運功能增強，因為NHE3功能調節還包括其他機理。遺憾的是，本研究沒能對膽囊黏膜上皮細胞NHE3離子轉運功能進行檢測，這是本研究的不足之處。膽囊黏膜上皮細胞的離子轉運速率受諸如神經、體液、膽汁脂質濃度等多種因素調節。在人體的所有組織之中，膽囊黏膜上皮細胞最長時間地暴露于最高脂質濃度的膽汁里，這一情形使其離子轉運的影響因素更加復雜化。所以，目前還沒有可靠的技術手段來模擬上皮細胞所處的特殊環境并對離子轉運活性進行體外實驗檢測。此外，與狗和小鼠不同，人膽囊黏膜上皮細胞的培養本身就更具技術挑戰。未來，針對NHE3轉運功能的方法學研究將為揭示膽囊黏膜離子轉運與膽固醇結石形成的關系提供有效的技術支持。
綜上，本研究證明了NHE3同時表達于人膽囊黏膜上皮細胞頂質膜和胞漿內。膽固醇結石患者膽囊NHE3在蛋白水平表達增高。這些發現提示NHE3功能異常可能與膽囊膽固醇結石發病相關，但其機理仍有待進一步研究證實。
