引用本文： 李建水, 李利發, 張井瀟, 陳小波, 吳斌, 羅霞, 楊松. 高表達MiR-92a對結直腸癌患者臨床病理特征及預后影響的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(7): 851-854. doi: 10.7507/1007-9424.20160220 復制
結直腸癌（CRC）是世界上最為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率僅次于胃癌和食管癌，并且由于吸煙、肥胖、過度飲酒以及過量進食肉類食品等危險因素的影響，其發病率仍在不斷增長[1-2]。盡管CRC的早期診斷和治療手段在不斷的改進，但是據世界衛生組織統計，其死亡率仍然占有全部惡性腫瘤死亡率的8% [3-4]。此外，大約90%的CRC死亡患者是由于腫瘤細胞的轉移所導致，但是這些潛在的發生機理仍然不清[5]。近年來，越來越多的研究[6-8]證明，多種miR不但在CRC的形成、發展和轉移、復發等過程中扮演了重要的角色，而且與CRC的分期診斷和預后評估也有著明顯的關系。因而，本研究旨在探討miR-92a能否作為一種高效的、敏感的生物學標志物，從而為CRC患者的預后評估提供更加可靠和便捷的理論依據。
1 資料和方法
1.1 標本來源
收集川北醫學院附屬醫院普外科2007年10月至2010年10月期間行手術治療的108例CRC患者的腫瘤標本，男57例，女51例；年齡（61.67±12.97）歲（27～86歲）。其中結腸癌43例，直腸癌65例；TNM分期Ⅰ期12例，Ⅱ期35例，Ⅲ期47例，Ⅳ期14例；分化程度為高分化22例，中分化51例，低分化35例。所有患者均經病理學檢查確診為結腸癌或直腸癌，且無其他腫瘤病史；此外所有患者術前均未接受放化療。
1.2 實驗方法
根據RNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）操作說明，應用Trizol（Invitrogen公司，美國）試劑從CRC組織中提取總RNA；然后根據逆轉錄試劑盒（System Bio-sciences公司，美國）操作說明，應用Quant Mir RT試劑盒（System Bio-sciences公司，美國）將RNA進行逆轉錄成為cDNA；隨后以cDNA為模板，應用Power SYBR Green PCR Master Mix熒光定量PCR試劑（Applied Biosystems公司，美國）進行SYBR實時熒光定量PCR檢測；加入miR-92a特定引物（Applied Biosystems公司，美國）后，化學反應全過程均在iCycler iQ熒光定量PCR儀（Bio Rad公司，美國）中進行。循環參數：95℃預變性5 min，隨后變性95℃、15 s，退火60℃、30 s，延長72℃、1 min，共40個循環。采用循環閾值法（cycle threshold，CT）定量分析miR-92a的表達水平，以小分子RNA U6為內參，每個標本miR-92a的相對表達量用2-ΔCT表示，ΔCT=CT miR-92a-CT U6RNA；以同樣的方法從CRC組織中提取和分析PTEN基因表達情況。
1.3 統計學方法
應用SPSS 19.0統計軟件對所有數據進行統計學分析。應用χ2檢驗比較miR-92a的表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系制作Kaplan-Meier生存曲線，比較miR-92a和PTEN基因的表達水平與CRC患者總體預后的關系。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MiR-92a的表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系
利用熒光定量PCR法對108例CRC病理標本中miR-92a的表達水平進行檢測，以中位表達水平為截斷值，將全部病例分為miR-92a高表達組和miR-92a低表達組，其結果見表 1。
表1
MiR-92a的表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系〔例（%）〕
由表 1可見，高表達的miR-92a與CRC患者的淋巴結轉移、遠處轉移和較高的TNM分期有關（P < 0.05）；但高表達的miR-92a與CRC患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置，浸潤深度和分化程度無關（P > 0.05）。
2.2 MiR-92a的表達水平與CRC組織中PTEN基因表達量的關系
同樣，對108例CRC病理標本中PTEN基因的表達水平進行定量分析，并以中位表達水平為截斷值，將全部病例分為PTEN基因高表達組和PTEN基因低表達組，其結果見表 2。由表 2可見，高表達的miR-92a能夠下調CRC組織中PTEN基因的表達水平。
表2
MiR-92a的表達水平與CRC組織中PTEN基因表達量的關系〔例（%）〕
2.3 MiR-92a和PTEN基因的表達水平與CRC患者臨床預后的關系
根據miR-92a和PTEN基因的表達水平，分別繪制了關于miR-92a表達情況的Kaplan-Meier總體生存曲線和關于PTEN基因表達水平的Kaplan-Meier總體生存曲線，結果分別見圖 1和圖 2。由圖 1可見，高表達的miR-92a與CRC患者較差的總體生存率有關（P < 0.001）；由圖 2可見，低表達PTEN基因與CRC患者較差的總體生存率有關（P=0.002）。
圖1
示miR-92a高表達的CRC患者有較差的總體生存率=（P < 0.001）
圖2
示PTEN基因低表達的CRC患者有較差的總體生存率（P=0.002）
3 討論
MiR-92a家族是miR-17-92基因簇的成員之一，它位于染色體13q13上，主要包括miR-25、miR-92a-1、miR-92a-2和miR-363 4個子序列[9]。大量研究發現，異常表達的miR-92a在非小細胞肺癌[10]、肝癌[11]、食管鱗癌[12]、乳腺癌[13]等多種腫瘤中扮演著重要的角色。并且，近年來關于miR-92a在CRC中作用的研究也逐漸增多。研究[14-15]表明，miR-92a在CRC組織中出現異常表達，并且能夠促進癌細胞增殖，抑制癌細胞的凋亡，從而在CRC的形成、發展、轉移、復發以及早期診斷等過程中起到至關重要的作用。Nishida等[14]研究表明，miR-17-92基因簇的所有成員在CRC組織中均呈現高表達，并且上調的miR-17-92基因簇可能促進CRC的進展。Yamada等[15]對94例結直腸腫瘤的研究發現，細胞內或細胞外的miR-92a均可通過下調目標基因Dickkopf相關蛋白-3（Dkk-3），促進腫瘤細胞的增殖，從而在結直腸腫瘤的生長中扮演著關鍵的角色。此外，miR-92a對CRC患者的早期診斷也具有重要意義。Huang等[16]通過對157例結直腸腫瘤研究表明，血漿miR-92a在CRC早期診斷中的敏感性和特異性分別可達84.0%和71.2%。隨后，相似的發現在Liu [17]等的研究中也有報道。
目前，有關miR-92a對CRC患者預后影響的研究相對較少，并且存在爭議。Ke等[18]對158例CRC患者的研究發現，高表達的miR-92a與淋巴結轉移和較高的TNM分期有著顯著的關系，并且從Kaplan-Meier總體生存曲線還能潛在地預測CRC患者較差的總體生存率（P=0.029）。此外，Zhou等[19]的研究也表明，過度表達的miR-92a與CRC患者糟糕的臨床病理特征和較差的總體生存率有明顯的關系（HR=2.342；95% CI：1.072，5.115；P=0.033）；相似的發現在Liu [17]等的研究中也有報道，其合并HR和相應的95%CI分別為4.36和1.64，11.57。然而，近年來一些不同的研究結果也逐漸地被發現。Schee等[20]研究表明，miR-92a的表達水平與CRC患者的TNM分期、淋巴結、遠處轉移等臨床病理特征沒有明顯的關系，并且隨著腫瘤分化程度的降低，miR-92a表現出明顯下調的現象（P=0.003）；此外，從Kaplan-Meier總體生存曲線中沒有發現不同水平的miR-92a對CRC患者總體生存率影響的差異（P=0.64）。
本研究結果表明，高表達的miR-92a與CRC患者的不好的臨床病理特征有關，如淋巴結轉移（P=0.007）、遠處轉移（P=0.03）以及較高的TNM分期（P=0.019）；繪制的關于miR-92a表達的Kaplan-Meier總體生存曲線還發現，過度表達的miR-92a能夠潛在地預測CRC患者較差的總體生存率（P < 0.001）。此外，本研究通過對抑癌基因PTEN表達情況的研究發現，高表達的miR-92a能夠下調CRC組織中PTEN基因的表達水平（P < 0.001）；同樣繪制關于PTEN基因的Kaplan-Meier總體生存曲線，結果表明，CRC患者較差的總體生存率與PTEN基因的表達下調有關（P=0.001）。本研究結果提示，在CRC中抑癌基因PTEN可能是miR-92a的下游目標基因，上調的miR-92a通過抑制PTEN基因的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移，抑制腫瘤細胞的凋亡，最終導致較差的臨床預后。Ke等[18]先前的研究也報道了相似的發現，高表達的miR-92a通過下調PTEN基因的表達，激活PI3K/AKT信號通路，從而促進CRC細胞的侵襲轉移，導致較差的臨床預后。此外，Zhang等[21]研究也表明，miR-92a可通過抑制抑癌基因PTEN的表達，從而誘導CRC細胞的上皮-間質細胞轉換（epithelialmesenchymal transitions, EMT）過程，并促進細胞的增殖、侵襲和轉移。
綜上所述，過度表達的miR-92a可能導致CRC患者不好的臨床病理特征和不良的臨床預后，并且抑癌基因PTEN可能作為miR-92a的靶基因，在這些過程中發揮著至關重要的作用。但是，目前對于miR-92a如何引起上述結果的具體機理仍然不清楚，因此進一步的大樣本、多中心的基礎研究還有待實施。
結直腸癌（CRC）是世界上最為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率僅次于胃癌和食管癌，并且由于吸煙、肥胖、過度飲酒以及過量進食肉類食品等危險因素的影響，其發病率仍在不斷增長[1-2]。盡管CRC的早期診斷和治療手段在不斷的改進，但是據世界衛生組織統計，其死亡率仍然占有全部惡性腫瘤死亡率的8% [3-4]。此外，大約90%的CRC死亡患者是由于腫瘤細胞的轉移所導致，但是這些潛在的發生機理仍然不清[5]。近年來，越來越多的研究[6-8]證明，多種miR不但在CRC的形成、發展和轉移、復發等過程中扮演了重要的角色，而且與CRC的分期診斷和預后評估也有著明顯的關系。因而，本研究旨在探討miR-92a能否作為一種高效的、敏感的生物學標志物，從而為CRC患者的預后評估提供更加可靠和便捷的理論依據。
1 資料和方法
1.1 標本來源
收集川北醫學院附屬醫院普外科2007年10月至2010年10月期間行手術治療的108例CRC患者的腫瘤標本，男57例，女51例；年齡（61.67±12.97）歲（27～86歲）。其中結腸癌43例，直腸癌65例；TNM分期Ⅰ期12例，Ⅱ期35例，Ⅲ期47例，Ⅳ期14例；分化程度為高分化22例，中分化51例，低分化35例。所有患者均經病理學檢查確診為結腸癌或直腸癌，且無其他腫瘤病史；此外所有患者術前均未接受放化療。
1.2 實驗方法
根據RNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）操作說明，應用Trizol（Invitrogen公司，美國）試劑從CRC組織中提取總RNA；然后根據逆轉錄試劑盒（System Bio-sciences公司，美國）操作說明，應用Quant Mir RT試劑盒（System Bio-sciences公司，美國）將RNA進行逆轉錄成為cDNA；隨后以cDNA為模板，應用Power SYBR Green PCR Master Mix熒光定量PCR試劑（Applied Biosystems公司，美國）進行SYBR實時熒光定量PCR檢測；加入miR-92a特定引物（Applied Biosystems公司，美國）后，化學反應全過程均在iCycler iQ熒光定量PCR儀（Bio Rad公司，美國）中進行。循環參數：95℃預變性5 min，隨后變性95℃、15 s，退火60℃、30 s，延長72℃、1 min，共40個循環。采用循環閾值法（cycle threshold，CT）定量分析miR-92a的表達水平，以小分子RNA U6為內參，每個標本miR-92a的相對表達量用2-ΔCT表示，ΔCT=CT miR-92a-CT U6RNA；以同樣的方法從CRC組織中提取和分析PTEN基因表達情況。
1.3 統計學方法
應用SPSS 19.0統計軟件對所有數據進行統計學分析。應用χ2檢驗比較miR-92a的表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系制作Kaplan-Meier生存曲線，比較miR-92a和PTEN基因的表達水平與CRC患者總體預后的關系。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MiR-92a的表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系
利用熒光定量PCR法對108例CRC病理標本中miR-92a的表達水平進行檢測，以中位表達水平為截斷值，將全部病例分為miR-92a高表達組和miR-92a低表達組，其結果見表 1。
表1
MiR-92a的表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系〔例（%）〕
由表 1可見，高表達的miR-92a與CRC患者的淋巴結轉移、遠處轉移和較高的TNM分期有關（P < 0.05）；但高表達的miR-92a與CRC患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置，浸潤深度和分化程度無關（P > 0.05）。
2.2 MiR-92a的表達水平與CRC組織中PTEN基因表達量的關系
同樣，對108例CRC病理標本中PTEN基因的表達水平進行定量分析，并以中位表達水平為截斷值，將全部病例分為PTEN基因高表達組和PTEN基因低表達組，其結果見表 2。由表 2可見，高表達的miR-92a能夠下調CRC組織中PTEN基因的表達水平。
表2
MiR-92a的表達水平與CRC組織中PTEN基因表達量的關系〔例（%）〕
2.3 MiR-92a和PTEN基因的表達水平與CRC患者臨床預后的關系
根據miR-92a和PTEN基因的表達水平，分別繪制了關于miR-92a表達情況的Kaplan-Meier總體生存曲線和關于PTEN基因表達水平的Kaplan-Meier總體生存曲線，結果分別見圖 1和圖 2。由圖 1可見，高表達的miR-92a與CRC患者較差的總體生存率有關（P < 0.001）；由圖 2可見，低表達PTEN基因與CRC患者較差的總體生存率有關（P=0.002）。
圖1
示miR-92a高表達的CRC患者有較差的總體生存率=（P < 0.001）
圖2
示PTEN基因低表達的CRC患者有較差的總體生存率（P=0.002）
3 討論
MiR-92a家族是miR-17-92基因簇的成員之一，它位于染色體13q13上，主要包括miR-25、miR-92a-1、miR-92a-2和miR-363 4個子序列[9]。大量研究發現，異常表達的miR-92a在非小細胞肺癌[10]、肝癌[11]、食管鱗癌[12]、乳腺癌[13]等多種腫瘤中扮演著重要的角色。并且，近年來關于miR-92a在CRC中作用的研究也逐漸增多。研究[14-15]表明，miR-92a在CRC組織中出現異常表達，并且能夠促進癌細胞增殖，抑制癌細胞的凋亡，從而在CRC的形成、發展、轉移、復發以及早期診斷等過程中起到至關重要的作用。Nishida等[14]研究表明，miR-17-92基因簇的所有成員在CRC組織中均呈現高表達，并且上調的miR-17-92基因簇可能促進CRC的進展。Yamada等[15]對94例結直腸腫瘤的研究發現，細胞內或細胞外的miR-92a均可通過下調目標基因Dickkopf相關蛋白-3（Dkk-3），促進腫瘤細胞的增殖，從而在結直腸腫瘤的生長中扮演著關鍵的角色。此外，miR-92a對CRC患者的早期診斷也具有重要意義。Huang等[16]通過對157例結直腸腫瘤研究表明，血漿miR-92a在CRC早期診斷中的敏感性和特異性分別可達84.0%和71.2%。隨后，相似的發現在Liu [17]等的研究中也有報道。
目前，有關miR-92a對CRC患者預后影響的研究相對較少，并且存在爭議。Ke等[18]對158例CRC患者的研究發現，高表達的miR-92a與淋巴結轉移和較高的TNM分期有著顯著的關系，并且從Kaplan-Meier總體生存曲線還能潛在地預測CRC患者較差的總體生存率（P=0.029）。此外，Zhou等[19]的研究也表明，過度表達的miR-92a與CRC患者糟糕的臨床病理特征和較差的總體生存率有明顯的關系（HR=2.342；95% CI：1.072，5.115；P=0.033）；相似的發現在Liu [17]等的研究中也有報道，其合并HR和相應的95%CI分別為4.36和1.64，11.57。然而，近年來一些不同的研究結果也逐漸地被發現。Schee等[20]研究表明，miR-92a的表達水平與CRC患者的TNM分期、淋巴結、遠處轉移等臨床病理特征沒有明顯的關系，并且隨著腫瘤分化程度的降低，miR-92a表現出明顯下調的現象（P=0.003）；此外，從Kaplan-Meier總體生存曲線中沒有發現不同水平的miR-92a對CRC患者總體生存率影響的差異（P=0.64）。
本研究結果表明，高表達的miR-92a與CRC患者的不好的臨床病理特征有關，如淋巴結轉移（P=0.007）、遠處轉移（P=0.03）以及較高的TNM分期（P=0.019）；繪制的關于miR-92a表達的Kaplan-Meier總體生存曲線還發現，過度表達的miR-92a能夠潛在地預測CRC患者較差的總體生存率（P < 0.001）。此外，本研究通過對抑癌基因PTEN表達情況的研究發現，高表達的miR-92a能夠下調CRC組織中PTEN基因的表達水平（P < 0.001）；同樣繪制關于PTEN基因的Kaplan-Meier總體生存曲線，結果表明，CRC患者較差的總體生存率與PTEN基因的表達下調有關（P=0.001）。本研究結果提示，在CRC中抑癌基因PTEN可能是miR-92a的下游目標基因，上調的miR-92a通過抑制PTEN基因的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移，抑制腫瘤細胞的凋亡，最終導致較差的臨床預后。Ke等[18]先前的研究也報道了相似的發現，高表達的miR-92a通過下調PTEN基因的表達，激活PI3K/AKT信號通路，從而促進CRC細胞的侵襲轉移，導致較差的臨床預后。此外，Zhang等[21]研究也表明，miR-92a可通過抑制抑癌基因PTEN的表達，從而誘導CRC細胞的上皮-間質細胞轉換（epithelialmesenchymal transitions, EMT）過程，并促進細胞的增殖、侵襲和轉移。
綜上所述，過度表達的miR-92a可能導致CRC患者不好的臨床病理特征和不良的臨床預后，并且抑癌基因PTEN可能作為miR-92a的靶基因，在這些過程中發揮著至關重要的作用。但是，目前對于miR-92a如何引起上述結果的具體機理仍然不清楚，因此進一步的大樣本、多中心的基礎研究還有待實施。
