引用本文： 廖傳軍, 張望德. 大鼠骨髓內皮祖細胞SPIO體外標記的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(7): 794-797. doi: 10.7507/1007-9424.20160209 復制
血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管內皮細胞的前體細胞，亦稱為成血管細胞（angioblast），在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復，它們在成體血管新生和受損內膜的再內皮化中發揮重要作用[1-3]。近年來有關EPCs?移植治療慢性肢體缺血性疾病的基礎研究進展迅速，同時也顯示出良好的臨床應用前景。但EPCs移植治療研究所面臨的瓶頸是缺乏有效的活體示蹤手段。由于傳統標記細胞的方法都需要在離體情況下進行分析和鑒定，無法動態觀察細胞移植后在活體內的生長分化及活力、增殖力等情況，從而難以對其血管生成能力作出準確而客觀的評價，并且這種取材方式也不適合臨床研究。為了更好地開展細胞治療和監測細胞在活體內遷移的軌跡，非侵入性評估細胞的分布以及歸宿就顯得尤為重要。隨著科技的發展，特別是高分辨率磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）的出現，使成像水平向分子水平發展已成為可能。采用MRI示蹤磁性標記的細胞，可作為體外示蹤移植細胞的有效方法[4-8]。本實驗探索了大鼠骨髓EPCs的體外超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）標記以及檢測，旨在為下一步的EPCs活體示蹤實驗奠定理論基礎。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、試劑及儀器
清潔級SD大鼠，體質量120～150 g，由首都醫科大學動物實驗中心提供。超順磁性氧化鐵納米顆粒（SPIO，Schering公司，德國），內皮細胞培養基礎（EGM-2MV）培養液（Cambrex公司，美國），纖維連接蛋白（Fn，Sigma公司，美國），淋巴細胞分離液（Histopaque-1077；Sigma公司，美國），別藻藍蛋白（APC）標記CD34單抗（BD公司，美國），異硫氰酸熒光素（FITC）標記CD133單抗（R & D公司，美國），PE標記血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR-2）單抗（R & D公司，美國），四氮噻唑藍（MTT，Fluka公司，美國），二甲基亞砜（DMSO，上海生工生物工程有限公司，中國），酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad公司，美國），紫外分光光度計（Beckman公司，美國），熒光倒置相差顯微鏡（Zeiss公司，德國），激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本），CO2培養箱（Sim公司，美國）。
1.2 大鼠骨髓EPCs的分離培養
大鼠斷頸處死后，置于75%乙醇中浸泡5 min，分離肱骨、股骨和脛骨，徹底去除附著于骨頭上的肌肉組織，然后用PBS緩沖液反復沖洗，將沖出的骨髓組織收集至離心管中。在離心管上層加入同等量的PBS液，2 000 r/min離心30 min（離心半徑3 cm），將上層的細胞層小心吸出，根據文獻[9]的方法培養EPCs。
1.3 大鼠骨髓EPCs的鑒定
對EPCs的鑒定采取了免疫細胞化學、Dil-ac-LDL攝取實驗和流式細胞儀檢測的方法。原代細胞培養第7天時將細胞接種于24孔板中，密度為1×106/孔。培養第3天分別行CD133、VEGFR-2和Ⅷ因子的免疫細胞化學染色；再將細胞用含10 mg/L Dil-ac-LDL的培養液進行培養，PBS沖洗后置于熒光顯微鏡觀察并攝像；最后用流式細胞儀檢測細胞表面CD133和VEGFR-2抗原的表達。
1.4 SPIO標記EPCs
根據文獻[10-11]的方法制備SPIO復合物，細胞培養第7天，在無菌條件下將不同濃度的SPIO（6種濃度分別是0、12.5、25、50、75及100μg/mL）加入新鮮培養基中，置入37℃、5% CO2培養箱內孵育24 h，然后使用PBS液清洗以除去過剩的未標記的SPIO顆粒。
1.5 普魯士藍染色測定細胞標記率
根據文獻[12]的方法使用普魯士藍染色測定細胞標記率，光鏡下觀察Fe3+呈藍色，表明標記成功并計算胞漿內存在藍色顆粒的細胞比例。
1.6 臺盼藍染色檢測細胞活力
根據文獻[13]的方法使用臺盼藍染色檢測細胞活力，細胞活力（%）=（細胞總數-著色細胞數）/細胞總數×100%。
1.7 MTT法檢測細胞增殖能力
將不同濃度的SPIO與EPCs孵育24 h后分別接種至96板中，共6組，每孔分別加入培養基20μLMTT（5 mg/mL），培養4 h后，向每孔加入200μL DMSO，震蕩10 min，每天在全自動酶標儀490?nm處測量各孔的吸光度值（A值）。
1.8 統計學方法
采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用均數±標準差（
2 結果
2.1 大鼠骨髓EPCs的分離培養結果
新分離的骨髓EPCs呈圓形或橢圓形，培養48～72 h，可見貼壁細胞呈集落樣生長，細胞呈長梭形、三角形、紡錘形或不規則形[9]
2.2 大鼠骨髓EPCs的鑒定結果
CD133、VEGFR-2和Ⅷ因子的免疫細胞化學染色均有陽性表現，Dil-ac-LDL攝取實驗在細胞胞質中可觀察到紅色熒光聚集，流式細胞儀檢測示細胞表面CD133和VEGFR-2抗原兩者均為陽性者約占20%。
2.3 SPIO標記EPCs及細胞標記率測定結果
SPIO標記后的EPCs其胞漿內可見棕色鐵顆粒濃聚（圖 1）。普魯士藍染色后胞漿內可見散在的細小藍色鐵顆粒，且隨著SPIO濃度的增加，胞漿內藍色鐵顆粒逐漸增多，當SPIO濃度為50μg/mL時，大部分細胞胞漿內均可見藍染顆粒，標記率超過90%（圖 2）；當SPIO濃度> 75μg/mL時，標記后的細胞雖能正常貼壁，但細胞周圍出現較多細胞碎片和褐色顆粒聚集物；當SPIO濃度為100μg/mL時，大部分細胞皺縮、漂浮于培養基中，細胞胞漿內充滿高濃度深染顆粒，表明細胞逐漸死亡。
圖1
示50μg/mL SPIO標記后的EPCs（×200）圖 2示50μg/mL SPIO標記后的EPCs（普魯士藍染色×100）
2.4 臺盼藍染色檢測細胞活力結果
6種不同濃度SPIO標記EPCs后，隨著其標記濃度的升高，EPCs的活力逐漸升高，當SPIO濃度超過50μg/mL時，EPCs的活力則逐漸降低；其中0、12.5、25及50μg/mL SPIO濃度組間的細胞活力差異均無統計學意義（P > 0.05），而75及100μg/mL SPIO濃度組與上述4種標記濃度組相比，其細胞活力明顯降低（P < 0.05）。見表 1。
表1
不同濃度SPIO標記EPCs后臺盼藍染色檢測細胞活力結果（n=48，2.5 MTT法檢測細胞增殖能力結果
6種不同濃度SPIO標記EPCs后，隨著其標記濃度的升高，EPCs的增殖能力逐漸降低，但在SPIO濃度≤50μg/mL（0、12.5、25及50μg/mL）時，各濃度組間EPCs增殖能力的差異均無統計學意義（P > 0.05），鏡下見細胞貼壁良好，折光性好，增殖旺盛；在SPIO濃度高于50μg/mL（75及100μg/mL）時，EPCs德增殖能力明顯降低，與前4個濃度組比較差異有統計學意義（P < 0.05），顯微鏡下見細胞折光性差，部分細胞懸浮于培養基中，貼壁細胞數目較少（表 2）。
表2
不同濃度SPIO標記EPCs后MTT法檢測細胞增殖能力結果（n=48，3 討論
從Asahara等[1]1997年首次從外周血中分離出EPCs后，對EPCs的研究日益廣泛，目前認為成人外周血、臍血和骨髓中均存在EPCs。一般認為，早期EPCs的3個表面標志性抗原是CD133，VEGFR-2和CD34。目前，獲取EPCs的方法主要有以下2種[14-17]：①利用EPCs特有的表面抗原分離EPCs，一般采用免疫磁珠法獲得。②離體擴增培養法，即使用添加有特殊生長因子的培養基使骨髓單個核細胞（MNCs）向EPCs分化擴增。本研究選擇了離體擴增培養方法，使用Dil-ac-LDL攝取實驗和流式細胞儀來鑒定EPCs，結果證實在培養的細胞中有相當數量的EPCs存在[9, 18]。
采用EPCs移植治療慢性肢體缺血所面臨的瓶頸是缺乏有效的活體示蹤手段，隨著科技的發展，特別是MRI的出現，使成像水平向分子水平發展已成為可能。采用MRI示蹤磁性標記的細胞，可作為體外示蹤移植細胞有效的方法[19-21]，伴隨發展的是細胞內對比劑的研究與應用，這些對比劑使少量的細胞能夠在MRI上得以顯示[22]。
在細胞影像學中，外源性移植細胞必須標記磁共振對比劑，這樣才能將細胞從其周圍的組織中分辨出來。目前，用作磁共振對比劑主要有兩大類：一類是釓類對比劑，主要產生T1正性對比效應，其應用報道不多，主要是因為釓的弛豫率低，且它被細胞攝取的能力不高，對它轉入細胞后的毒性也了解甚少，目前只有少數成功的報道[23-24]；另一類是以氧化鐵顆粒為基礎的對比劑，主要產生較強的T2負性對比效應，其特點是能提供較強的信號改變，尤其是在T2圖像上；粒徑小，穿透力強，且弛豫率約為同樣條件下釓的7～10倍，很低濃度即可在MRI上形成對比；由可生物降解的鐵組成，可以通過細胞鐵代謝的途徑被身體重新吸收與利用；能夠簡單而方便地在光鏡和電鏡下觀察檢測[6]。以上特點使氧化鐵類對比劑更受關注，被認為是分子影像學中較好的材料，并且被廣泛使用于細胞的標記。以SPIO納米鐵顆粒作為顯影劑的MRI示蹤技術近年來飛速發展，不但可以提供小至25～50μm的分辨率，接近單個細胞的水平，而且具有標記效率高、敏感性高以及對細胞安全無毒性的特點[25]，已廣泛應用于肝臟細胞、神經細胞和腫瘤血管生成的MRI研究中。
在本實驗中，當SPIO與細胞共培養24 h后，標記效率高達90%。實驗[26]證實，細胞對鐵顆粒的吸收與氧化鐵和細胞濃度呈正比，SPIO標記濃度越高，細胞的標記率越高，但標記濃度過高會降低細胞的活力。所以必須采用適當的標記濃度，同時兼顧標記效率和成像效果。本研究發現，當SPIO濃度為50μg/mL時, 標記后的EPCs生長狀態良好，能正常貼壁生長并傳代，具有較高的活力及增殖能力；而當SPIO濃度為100μg/mL時，活細胞比率小于20%，說明當SPIO濃度過高時會對細胞活力產生影響，明顯抑制細胞的增殖。因此，SPIO濃度在50μg/mL左右時是較為安全、可靠的。本實驗自大鼠骨髓中分離培養出EPCs，并探索出SPIO標記EPCs的最佳條件，為下一步EPCs的活體MRI示蹤試驗奠定了一定的基礎。
血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管內皮細胞的前體細胞，亦稱為成血管細胞（angioblast），在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復，它們在成體血管新生和受損內膜的再內皮化中發揮重要作用[1-3]。近年來有關EPCs?移植治療慢性肢體缺血性疾病的基礎研究進展迅速，同時也顯示出良好的臨床應用前景。但EPCs移植治療研究所面臨的瓶頸是缺乏有效的活體示蹤手段。由于傳統標記細胞的方法都需要在離體情況下進行分析和鑒定，無法動態觀察細胞移植后在活體內的生長分化及活力、增殖力等情況，從而難以對其血管生成能力作出準確而客觀的評價，并且這種取材方式也不適合臨床研究。為了更好地開展細胞治療和監測細胞在活體內遷移的軌跡，非侵入性評估細胞的分布以及歸宿就顯得尤為重要。隨著科技的發展，特別是高分辨率磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）的出現，使成像水平向分子水平發展已成為可能。采用MRI示蹤磁性標記的細胞，可作為體外示蹤移植細胞的有效方法[4-8]。本實驗探索了大鼠骨髓EPCs的體外超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）標記以及檢測，旨在為下一步的EPCs活體示蹤實驗奠定理論基礎。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、試劑及儀器
清潔級SD大鼠，體質量120～150 g，由首都醫科大學動物實驗中心提供。超順磁性氧化鐵納米顆粒（SPIO，Schering公司，德國），內皮細胞培養基礎（EGM-2MV）培養液（Cambrex公司，美國），纖維連接蛋白（Fn，Sigma公司，美國），淋巴細胞分離液（Histopaque-1077；Sigma公司，美國），別藻藍蛋白（APC）標記CD34單抗（BD公司，美國），異硫氰酸熒光素（FITC）標記CD133單抗（R & D公司，美國），PE標記血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR-2）單抗（R & D公司，美國），四氮噻唑藍（MTT，Fluka公司，美國），二甲基亞砜（DMSO，上海生工生物工程有限公司，中國），酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad公司，美國），紫外分光光度計（Beckman公司，美國），熒光倒置相差顯微鏡（Zeiss公司，德國），激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本），CO2培養箱（Sim公司，美國）。
1.2 大鼠骨髓EPCs的分離培養
大鼠斷頸處死后，置于75%乙醇中浸泡5 min，分離肱骨、股骨和脛骨，徹底去除附著于骨頭上的肌肉組織，然后用PBS緩沖液反復沖洗，將沖出的骨髓組織收集至離心管中。在離心管上層加入同等量的PBS液，2 000 r/min離心30 min（離心半徑3 cm），將上層的細胞層小心吸出，根據文獻[9]的方法培養EPCs。
1.3 大鼠骨髓EPCs的鑒定
對EPCs的鑒定采取了免疫細胞化學、Dil-ac-LDL攝取實驗和流式細胞儀檢測的方法。原代細胞培養第7天時將細胞接種于24孔板中，密度為1×106/孔。培養第3天分別行CD133、VEGFR-2和Ⅷ因子的免疫細胞化學染色；再將細胞用含10 mg/L Dil-ac-LDL的培養液進行培養，PBS沖洗后置于熒光顯微鏡觀察并攝像；最后用流式細胞儀檢測細胞表面CD133和VEGFR-2抗原的表達。
1.4 SPIO標記EPCs
根據文獻[10-11]的方法制備SPIO復合物，細胞培養第7天，在無菌條件下將不同濃度的SPIO（6種濃度分別是0、12.5、25、50、75及100μg/mL）加入新鮮培養基中，置入37℃、5% CO2培養箱內孵育24 h，然后使用PBS液清洗以除去過剩的未標記的SPIO顆粒。
1.5 普魯士藍染色測定細胞標記率
根據文獻[12]的方法使用普魯士藍染色測定細胞標記率，光鏡下觀察Fe3+呈藍色，表明標記成功并計算胞漿內存在藍色顆粒的細胞比例。
1.6 臺盼藍染色檢測細胞活力
根據文獻[13]的方法使用臺盼藍染色檢測細胞活力，細胞活力（%）=（細胞總數-著色細胞數）/細胞總數×100%。
1.7 MTT法檢測細胞增殖能力
將不同濃度的SPIO與EPCs孵育24 h后分別接種至96板中，共6組，每孔分別加入培養基20μLMTT（5 mg/mL），培養4 h后，向每孔加入200μL DMSO，震蕩10 min，每天在全自動酶標儀490?nm處測量各孔的吸光度值（A值）。
1.8 統計學方法
采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用均數±標準差（
2 結果
2.1 大鼠骨髓EPCs的分離培養結果
新分離的骨髓EPCs呈圓形或橢圓形，培養48～72 h，可見貼壁細胞呈集落樣生長，細胞呈長梭形、三角形、紡錘形或不規則形[9]
2.2 大鼠骨髓EPCs的鑒定結果
CD133、VEGFR-2和Ⅷ因子的免疫細胞化學染色均有陽性表現，Dil-ac-LDL攝取實驗在細胞胞質中可觀察到紅色熒光聚集，流式細胞儀檢測示細胞表面CD133和VEGFR-2抗原兩者均為陽性者約占20%。
2.3 SPIO標記EPCs及細胞標記率測定結果
SPIO標記后的EPCs其胞漿內可見棕色鐵顆粒濃聚（圖 1）。普魯士藍染色后胞漿內可見散在的細小藍色鐵顆粒，且隨著SPIO濃度的增加，胞漿內藍色鐵顆粒逐漸增多，當SPIO濃度為50μg/mL時，大部分細胞胞漿內均可見藍染顆粒，標記率超過90%（圖 2）；當SPIO濃度> 75μg/mL時，標記后的細胞雖能正常貼壁，但細胞周圍出現較多細胞碎片和褐色顆粒聚集物；當SPIO濃度為100μg/mL時，大部分細胞皺縮、漂浮于培養基中，細胞胞漿內充滿高濃度深染顆粒，表明細胞逐漸死亡。
圖1
示50μg/mL SPIO標記后的EPCs（×200）圖 2示50μg/mL SPIO標記后的EPCs（普魯士藍染色×100）
2.4 臺盼藍染色檢測細胞活力結果
6種不同濃度SPIO標記EPCs后，隨著其標記濃度的升高，EPCs的活力逐漸升高，當SPIO濃度超過50μg/mL時，EPCs的活力則逐漸降低；其中0、12.5、25及50μg/mL SPIO濃度組間的細胞活力差異均無統計學意義（P > 0.05），而75及100μg/mL SPIO濃度組與上述4種標記濃度組相比，其細胞活力明顯降低（P < 0.05）。見表 1。
表1
不同濃度SPIO標記EPCs后臺盼藍染色檢測細胞活力結果（n=48，2.5 MTT法檢測細胞增殖能力結果
6種不同濃度SPIO標記EPCs后，隨著其標記濃度的升高，EPCs的增殖能力逐漸降低，但在SPIO濃度≤50μg/mL（0、12.5、25及50μg/mL）時，各濃度組間EPCs增殖能力的差異均無統計學意義（P > 0.05），鏡下見細胞貼壁良好，折光性好，增殖旺盛；在SPIO濃度高于50μg/mL（75及100μg/mL）時，EPCs德增殖能力明顯降低，與前4個濃度組比較差異有統計學意義（P < 0.05），顯微鏡下見細胞折光性差，部分細胞懸浮于培養基中，貼壁細胞數目較少（表 2）。
表2
不同濃度SPIO標記EPCs后MTT法檢測細胞增殖能力結果（n=48，3 討論
從Asahara等[1]1997年首次從外周血中分離出EPCs后，對EPCs的研究日益廣泛，目前認為成人外周血、臍血和骨髓中均存在EPCs。一般認為，早期EPCs的3個表面標志性抗原是CD133，VEGFR-2和CD34。目前，獲取EPCs的方法主要有以下2種[14-17]：①利用EPCs特有的表面抗原分離EPCs，一般采用免疫磁珠法獲得。②離體擴增培養法，即使用添加有特殊生長因子的培養基使骨髓單個核細胞（MNCs）向EPCs分化擴增。本研究選擇了離體擴增培養方法，使用Dil-ac-LDL攝取實驗和流式細胞儀來鑒定EPCs，結果證實在培養的細胞中有相當數量的EPCs存在[9, 18]。
采用EPCs移植治療慢性肢體缺血所面臨的瓶頸是缺乏有效的活體示蹤手段，隨著科技的發展，特別是MRI的出現，使成像水平向分子水平發展已成為可能。采用MRI示蹤磁性標記的細胞，可作為體外示蹤移植細胞有效的方法[19-21]，伴隨發展的是細胞內對比劑的研究與應用，這些對比劑使少量的細胞能夠在MRI上得以顯示[22]。
在細胞影像學中，外源性移植細胞必須標記磁共振對比劑，這樣才能將細胞從其周圍的組織中分辨出來。目前，用作磁共振對比劑主要有兩大類：一類是釓類對比劑，主要產生T1正性對比效應，其應用報道不多，主要是因為釓的弛豫率低，且它被細胞攝取的能力不高，對它轉入細胞后的毒性也了解甚少，目前只有少數成功的報道[23-24]；另一類是以氧化鐵顆粒為基礎的對比劑，主要產生較強的T2負性對比效應，其特點是能提供較強的信號改變，尤其是在T2圖像上；粒徑小，穿透力強，且弛豫率約為同樣條件下釓的7～10倍，很低濃度即可在MRI上形成對比；由可生物降解的鐵組成，可以通過細胞鐵代謝的途徑被身體重新吸收與利用；能夠簡單而方便地在光鏡和電鏡下觀察檢測[6]。以上特點使氧化鐵類對比劑更受關注，被認為是分子影像學中較好的材料，并且被廣泛使用于細胞的標記。以SPIO納米鐵顆粒作為顯影劑的MRI示蹤技術近年來飛速發展，不但可以提供小至25～50μm的分辨率，接近單個細胞的水平，而且具有標記效率高、敏感性高以及對細胞安全無毒性的特點[25]，已廣泛應用于肝臟細胞、神經細胞和腫瘤血管生成的MRI研究中。
在本實驗中，當SPIO與細胞共培養24 h后，標記效率高達90%。實驗[26]證實，細胞對鐵顆粒的吸收與氧化鐵和細胞濃度呈正比，SPIO標記濃度越高，細胞的標記率越高，但標記濃度過高會降低細胞的活力。所以必須采用適當的標記濃度，同時兼顧標記效率和成像效果。本研究發現，當SPIO濃度為50μg/mL時, 標記后的EPCs生長狀態良好，能正常貼壁生長并傳代，具有較高的活力及增殖能力；而當SPIO濃度為100μg/mL時，活細胞比率小于20%，說明當SPIO濃度過高時會對細胞活力產生影響，明顯抑制細胞的增殖。因此，SPIO濃度在50μg/mL左右時是較為安全、可靠的。本實驗自大鼠骨髓中分離培養出EPCs，并探索出SPIO標記EPCs的最佳條件，為下一步EPCs的活體MRI示蹤試驗奠定了一定的基礎。
