引用本文： 靳艷文, 葉輝, 熊先澤, 李富宇, 周榮幸, 程南生. PPARγ激動劑拮抗TGF-β1介導的膽管纖維化的初步研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(7): 790-793. doi: 10.7507/1007-9424.20160208 復制
膽管狹窄是肝膽外科較常見的疾病之一，有惡性及良性兩種致病因素。惡性膽管狹窄見于膽管癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌及轉移癌導致的膽管受侵犯或壓迫所致的狹窄；良性膽管狹窄是由非腫瘤性因素導致的慢性增生性膽管炎，繼而出現膽管纖維組織增生、瘢痕形成、膽管壁纖維化，并最終導致的膽管狹窄，可發生于膽石癥繼發的膽管炎癥、手術創傷或缺血性損傷后[1-2]，國內學者[3]報道中良性膽管狹窄占臨床膽道疾病的10%～20%。膽管狹窄治療非常棘手，再狹窄和再次手術的比例非常高，給患者造成了極大的身心痛苦，并帶來了高昂的治療費用。因此，膽管纖維化及膽管狹窄是肝膽外科面臨的常見又急需我們攻克的難題。
組織纖維化的基本病理變化包括細胞外基質如膠原、纖連蛋白等成分的異常沉積，發生機理則是促纖維化細胞因子的過度激活及表達[4]。其中，轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）超家族是體內廣泛存在且影響最大的介質之一，作用包括介導細胞生長、分化、細胞外基質沉積等[4-5]。
而過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）是由配體激活的核內轉錄因子，為核激素受體超家族的成員[6]，是組織代謝途徑調控的重要細胞因子[7-8]。有研究[9-10]表明，PPARγ激動劑在肝、肺、腎臟、心臟、皮膚等器官的抗纖維化方面發揮了重要作用，這種抗纖維化的作用可能是通過阻斷TGF-β1信號通路來實現的。
本實驗擬以人正常肝內膽管成纖維細胞為主要研究對象，通過PPARγ激動劑比格列酮（pioglitazon，PGZ）和15-脫氧前列腺素J2（15-deoxy-Δ12, 14-prostaglandin J2，15d-PGJ2）進行干預，旨在了解其能否抑制由TGF-β1介導的人膽管成纖維細胞的增殖以及纖維化效應，并探討其可能存在的機理，為治療膽管系統纖維化及狹窄探索新的治療方案及理論基礎。
1 材料與方法
1.1 標本來源
選取因肝血管瘤在四川大學華西醫院行血管瘤切除的肝臟組織中經病理學檢查證實無明顯炎癥及腫瘤的正常肝內膽管組織進行肝內膽管成纖維細胞原代培養及鑒定，均經患者知情同意。
1.2 主要試劑、材料、儀器
DMEM培養基、胎牛血清及胰蛋白酶（美國Gbi-col公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，美國Sigma公司），Trizol（美國Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒〔日本寶生物（大連）有限公司〕，細胞培養箱（美國Thermo公司），生物安全柜（美國Nuaire公司），熒光相差倒置顯微鏡（日本OLYMPUSTOKYO公司），恒溫箱（日本SANYO公司），普通PCR儀、電泳儀及凝膠成像分析儀（美國BIORAD公司）。
1.3 細胞培養及鑒定
原代培養參照文獻[11]的用胰酶消化法和組織塊貼壁法進行。修剪剔除標本周圍肝組織，無菌生理鹽水及PBS液反復沖洗后置于DMEM培養基（含100 u/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素）中備用。利用熒光相差倒置顯微鏡觀察不同階段的細胞生長情況及形態變化。通過RT-PCR檢測波形蛋白（Vimentin）及角蛋白（cytokeratin）mRNA表達以行成纖維細胞的鑒定。
1.4 檢測指標及方法
于6孔板中接種成纖維細胞4×105個/孔，每組3個復孔，細胞貼壁后，空白對照組和對照組分別加入無血清培養基2 mL，實驗組則加入2 mL無血清DMEM培養基、然后分別加入濃度為1、5、10及15μmol/L的PGZ或15-d-PGJ2后預處理3 h，同時，對照組和實驗組均加入濃度為3 ng/mL的TGF-β1（預實驗證明作用最強的濃度）；于37℃、5%CO2及95%濕度培養箱中培養72 h，然后采用RT-PCR法檢測空白對照組、對照組及實驗組的Ⅰ型膠原（collagenⅠ，COLⅠ）、纖連蛋白（fibronectin，FN）、α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA的表達水平，分別比較對照組與空白對照及實驗組的mRNA水平。
1.5 統計學方法
用SPSS 17.0軟件進行統計分析。實驗數據計量資料用均數±標準差（
2 結果
對照組與空白對照組相比，成纖維細胞中COLⅠ、FN、α-SMA及CTGF的mRNA表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05），提示3 ng/mL TGF-β1作用成纖維細胞后上述4項指標的mRNA表達均有上調。不同濃度的PGZ或15-d-PGJ2預處理后對3 ng/mL TGF-β1作用的成纖維細胞的COLⅠ、FN、α-SMA及CTGF的mRNA的表達均有下調作用，其中PGZ對COLⅠ、α-SMA和CTGF影響最大的濃度為10μmol/L，對FN影響最大的濃度為15μmol/L；15-d-PGJ2作用最強的濃度均為10μmol/L，詳見表 1和表 2。
表1
不同濃度PGZ預處理后對各觀察指標基因表達水平的影響效應（n=3，
表2
不同濃度15-d-PGJ2預處理后對各觀察指標基因表達水平的影響效應（n=3，PGZ和15-d-PGJ2對COLⅠ、α-SMA及CTGF的mRNA表達影響最大的濃度都是10μmol/L，且兩者的空白對照組和對照組的COLⅠ、α-SMA及CTGF的mRNA表達差異無統計學意義（P > 0.05）。本研究對在10μmol/L濃度下PGZ與15-d-PGJ2的作用進行了比較，結果發現，PGZ與15-d-PGJ2相比，其對COLⅠmRNA表達的抑制作用較強（圖 1），對α-SMA mRNA表達的抑制作用則較弱（圖 2），差異均有統計學意義（P < 0.05），而對CTGF mRNA表達的抑制作用相當（圖 3）。
圖1
示PGZ及15-d-PGJ2對COLⅠmRNA表達的影響圖 2示PGZ及15-d-PGJ2對α-SMA mRNA表達的影響圖 3示PGZ及15-d-PGJ2對CTGF mRNA表達的影響
3 討論
PPAR是一類配體激活的核轉錄因子超家族成員。有研究[9-10]表明，PPARγ除了調節脂類代謝、細胞增殖、分化和凋亡[12]外，在器官抗纖維化方面也有重要作用，而這種抗纖維化的作用是通過阻斷TGF-β1信號通路來實現的。先后有學者[9-10, 13-14]經過體外及體內試驗證實在肝臟、肺、皮膚、胰腺、腹膜、心臟、血管平滑肌等組織器官中PPARγ激動劑具有拮抗損傷或炎癥導致的纖維化過程，但拮抗機理目前尚不清楚。
本實驗通過RT-PCR法測定由PGZ和15-d-PGJ2預處理后的膽管成纖維細胞在外源性TGF-β1作用下可能出現的變化。其結果顯示，兩種PPARγ激動劑都可以有效降低外源性TGF-β1介導的膽管成纖維細胞COLⅠ和FN的mRNA表達。正常情況下，膽管成纖維細胞表達少量的COLⅠ和FN，在TGF-β1作用下，其COLⅠ和FN的mRNA表達量明顯升高，而經PPARγ激動劑預處理后其表達水平顯著降低，且PGZ的作用更強。兩種PPARγ激動劑對于TGF-β1介導的COLⅠ和FN的mRNA表達的抑制效應有所不同，PPARγ合成配體PGZ與天然配體15-d-PGJ2相比其抑制纖維化作用更強。由于PGZ是PPARγ的特異性配體，對PPARγ的特異性較15-d-PGJ2強，其生物學作用的發揮主要通過依賴PPARγ的信號系統[15]，而15-d-PGJ2則具有不依賴PPARγ的其他作用[16-17]。該實驗結果提示，PPARγ激動劑抑制TGF-β1介導的膽管系統纖維化作用可能是通過依賴PPARγ的信號傳導系統完成的。
組織纖維化中的肌成纖維細胞轉分化則是通過其特異性標志物α-SMA來反映的。本實驗中，兩種PPARγ激動劑對于TGF-β1介導的α-SMA的mRNA表達具有抑制作用，但其天然配體15-d-PGJ2的抑制作用更明顯。Burgess等[18]用含有PPARγ抑制基因的腺病毒感染體外培養的肺間質成纖維細胞，導致其停止表達PPARγ后，15-d-PGJ2對TGF-β1介導的α-SMA表達的抑制效應被逆轉約30%，對羅格列酮的抑制效應逆轉約75%。由于噻唑烷酮類藥物對PPARγ的特異性較強，其作用主要通過依賴PPARγ的信號傳導系統完成，因此抑制PPARγ基因表達時其作用逆轉明顯；而15-d-PGJ2則不同，它具有不依賴PPARγ的其他作用。結合本實驗結果，提示PPARγ激動劑在TGF-β1介導的膽管系統肌成纖維細胞轉分化過程中的抑制作用可能是通過不依賴PPARγ的其他傳導系統完成。
組織纖維化中另外一個重要的細胞因子CTGF，屬于CCN家族的成員，作用包括促進成纖維細胞的增生、促進膠原分泌及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積、促進血管生成等[19-20]。CTGF也被認為是TGF-β1信號通路的下游作用介質[21]，而體外及體內試驗均證實CTGF為TGF-β1介導的纖維化過程中重要的輔因子[22-23]。同時，CTGF也是介導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉分化的重要細胞因子之一[24-25]。本實驗中，兩種PPARγ激動劑都能有效抑制CTGF mRNA表達，且兩種抑制作用強度相當。該結果提示，PPARγ激動劑用于體外培養的膽管成纖維細胞，可有效抑制由TGF-β1誘導的CTGF高表達的效應，進而抑制纖維化增生。
綜上，本實驗證明了PPARγ激動劑有拮抗外源性TGF-β1介導的膽管系統纖維化的作用，為治療膽管系統狹窄提供了新的理論基礎。
膽管狹窄是肝膽外科較常見的疾病之一，有惡性及良性兩種致病因素。惡性膽管狹窄見于膽管癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌及轉移癌導致的膽管受侵犯或壓迫所致的狹窄；良性膽管狹窄是由非腫瘤性因素導致的慢性增生性膽管炎，繼而出現膽管纖維組織增生、瘢痕形成、膽管壁纖維化，并最終導致的膽管狹窄，可發生于膽石癥繼發的膽管炎癥、手術創傷或缺血性損傷后[1-2]，國內學者[3]報道中良性膽管狹窄占臨床膽道疾病的10%～20%。膽管狹窄治療非常棘手，再狹窄和再次手術的比例非常高，給患者造成了極大的身心痛苦，并帶來了高昂的治療費用。因此，膽管纖維化及膽管狹窄是肝膽外科面臨的常見又急需我們攻克的難題。
組織纖維化的基本病理變化包括細胞外基質如膠原、纖連蛋白等成分的異常沉積，發生機理則是促纖維化細胞因子的過度激活及表達[4]。其中，轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）超家族是體內廣泛存在且影響最大的介質之一，作用包括介導細胞生長、分化、細胞外基質沉積等[4-5]。
而過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）是由配體激活的核內轉錄因子，為核激素受體超家族的成員[6]，是組織代謝途徑調控的重要細胞因子[7-8]。有研究[9-10]表明，PPARγ激動劑在肝、肺、腎臟、心臟、皮膚等器官的抗纖維化方面發揮了重要作用，這種抗纖維化的作用可能是通過阻斷TGF-β1信號通路來實現的。
本實驗擬以人正常肝內膽管成纖維細胞為主要研究對象，通過PPARγ激動劑比格列酮（pioglitazon，PGZ）和15-脫氧前列腺素J2（15-deoxy-Δ12, 14-prostaglandin J2，15d-PGJ2）進行干預，旨在了解其能否抑制由TGF-β1介導的人膽管成纖維細胞的增殖以及纖維化效應，并探討其可能存在的機理，為治療膽管系統纖維化及狹窄探索新的治療方案及理論基礎。
1 材料與方法
1.1 標本來源
選取因肝血管瘤在四川大學華西醫院行血管瘤切除的肝臟組織中經病理學檢查證實無明顯炎癥及腫瘤的正常肝內膽管組織進行肝內膽管成纖維細胞原代培養及鑒定，均經患者知情同意。
1.2 主要試劑、材料、儀器
DMEM培養基、胎牛血清及胰蛋白酶（美國Gbi-col公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，美國Sigma公司），Trizol（美國Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒〔日本寶生物（大連）有限公司〕，細胞培養箱（美國Thermo公司），生物安全柜（美國Nuaire公司），熒光相差倒置顯微鏡（日本OLYMPUSTOKYO公司），恒溫箱（日本SANYO公司），普通PCR儀、電泳儀及凝膠成像分析儀（美國BIORAD公司）。
1.3 細胞培養及鑒定
原代培養參照文獻[11]的用胰酶消化法和組織塊貼壁法進行。修剪剔除標本周圍肝組織，無菌生理鹽水及PBS液反復沖洗后置于DMEM培養基（含100 u/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素）中備用。利用熒光相差倒置顯微鏡觀察不同階段的細胞生長情況及形態變化。通過RT-PCR檢測波形蛋白（Vimentin）及角蛋白（cytokeratin）mRNA表達以行成纖維細胞的鑒定。
1.4 檢測指標及方法
于6孔板中接種成纖維細胞4×105個/孔，每組3個復孔，細胞貼壁后，空白對照組和對照組分別加入無血清培養基2 mL，實驗組則加入2 mL無血清DMEM培養基、然后分別加入濃度為1、5、10及15μmol/L的PGZ或15-d-PGJ2后預處理3 h，同時，對照組和實驗組均加入濃度為3 ng/mL的TGF-β1（預實驗證明作用最強的濃度）；于37℃、5%CO2及95%濕度培養箱中培養72 h，然后采用RT-PCR法檢測空白對照組、對照組及實驗組的Ⅰ型膠原（collagenⅠ，COLⅠ）、纖連蛋白（fibronectin，FN）、α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA的表達水平，分別比較對照組與空白對照及實驗組的mRNA水平。
1.5 統計學方法
用SPSS 17.0軟件進行統計分析。實驗數據計量資料用均數±標準差（
2 結果
對照組與空白對照組相比，成纖維細胞中COLⅠ、FN、α-SMA及CTGF的mRNA表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05），提示3 ng/mL TGF-β1作用成纖維細胞后上述4項指標的mRNA表達均有上調。不同濃度的PGZ或15-d-PGJ2預處理后對3 ng/mL TGF-β1作用的成纖維細胞的COLⅠ、FN、α-SMA及CTGF的mRNA的表達均有下調作用，其中PGZ對COLⅠ、α-SMA和CTGF影響最大的濃度為10μmol/L，對FN影響最大的濃度為15μmol/L；15-d-PGJ2作用最強的濃度均為10μmol/L，詳見表 1和表 2。
表1
不同濃度PGZ預處理后對各觀察指標基因表達水平的影響效應（n=3，
表2
不同濃度15-d-PGJ2預處理后對各觀察指標基因表達水平的影響效應（n=3，PGZ和15-d-PGJ2對COLⅠ、α-SMA及CTGF的mRNA表達影響最大的濃度都是10μmol/L，且兩者的空白對照組和對照組的COLⅠ、α-SMA及CTGF的mRNA表達差異無統計學意義（P > 0.05）。本研究對在10μmol/L濃度下PGZ與15-d-PGJ2的作用進行了比較，結果發現，PGZ與15-d-PGJ2相比，其對COLⅠmRNA表達的抑制作用較強（圖 1），對α-SMA mRNA表達的抑制作用則較弱（圖 2），差異均有統計學意義（P < 0.05），而對CTGF mRNA表達的抑制作用相當（圖 3）。
圖1
示PGZ及15-d-PGJ2對COLⅠmRNA表達的影響圖 2示PGZ及15-d-PGJ2對α-SMA mRNA表達的影響圖 3示PGZ及15-d-PGJ2對CTGF mRNA表達的影響
3 討論
PPAR是一類配體激活的核轉錄因子超家族成員。有研究[9-10]表明，PPARγ除了調節脂類代謝、細胞增殖、分化和凋亡[12]外，在器官抗纖維化方面也有重要作用，而這種抗纖維化的作用是通過阻斷TGF-β1信號通路來實現的。先后有學者[9-10, 13-14]經過體外及體內試驗證實在肝臟、肺、皮膚、胰腺、腹膜、心臟、血管平滑肌等組織器官中PPARγ激動劑具有拮抗損傷或炎癥導致的纖維化過程，但拮抗機理目前尚不清楚。
本實驗通過RT-PCR法測定由PGZ和15-d-PGJ2預處理后的膽管成纖維細胞在外源性TGF-β1作用下可能出現的變化。其結果顯示，兩種PPARγ激動劑都可以有效降低外源性TGF-β1介導的膽管成纖維細胞COLⅠ和FN的mRNA表達。正常情況下，膽管成纖維細胞表達少量的COLⅠ和FN，在TGF-β1作用下，其COLⅠ和FN的mRNA表達量明顯升高，而經PPARγ激動劑預處理后其表達水平顯著降低，且PGZ的作用更強。兩種PPARγ激動劑對于TGF-β1介導的COLⅠ和FN的mRNA表達的抑制效應有所不同，PPARγ合成配體PGZ與天然配體15-d-PGJ2相比其抑制纖維化作用更強。由于PGZ是PPARγ的特異性配體，對PPARγ的特異性較15-d-PGJ2強，其生物學作用的發揮主要通過依賴PPARγ的信號系統[15]，而15-d-PGJ2則具有不依賴PPARγ的其他作用[16-17]。該實驗結果提示，PPARγ激動劑抑制TGF-β1介導的膽管系統纖維化作用可能是通過依賴PPARγ的信號傳導系統完成的。
組織纖維化中的肌成纖維細胞轉分化則是通過其特異性標志物α-SMA來反映的。本實驗中，兩種PPARγ激動劑對于TGF-β1介導的α-SMA的mRNA表達具有抑制作用，但其天然配體15-d-PGJ2的抑制作用更明顯。Burgess等[18]用含有PPARγ抑制基因的腺病毒感染體外培養的肺間質成纖維細胞，導致其停止表達PPARγ后，15-d-PGJ2對TGF-β1介導的α-SMA表達的抑制效應被逆轉約30%，對羅格列酮的抑制效應逆轉約75%。由于噻唑烷酮類藥物對PPARγ的特異性較強，其作用主要通過依賴PPARγ的信號傳導系統完成，因此抑制PPARγ基因表達時其作用逆轉明顯；而15-d-PGJ2則不同，它具有不依賴PPARγ的其他作用。結合本實驗結果，提示PPARγ激動劑在TGF-β1介導的膽管系統肌成纖維細胞轉分化過程中的抑制作用可能是通過不依賴PPARγ的其他傳導系統完成。
組織纖維化中另外一個重要的細胞因子CTGF，屬于CCN家族的成員，作用包括促進成纖維細胞的增生、促進膠原分泌及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積、促進血管生成等[19-20]。CTGF也被認為是TGF-β1信號通路的下游作用介質[21]，而體外及體內試驗均證實CTGF為TGF-β1介導的纖維化過程中重要的輔因子[22-23]。同時，CTGF也是介導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉分化的重要細胞因子之一[24-25]。本實驗中，兩種PPARγ激動劑都能有效抑制CTGF mRNA表達，且兩種抑制作用強度相當。該結果提示，PPARγ激動劑用于體外培養的膽管成纖維細胞，可有效抑制由TGF-β1誘導的CTGF高表達的效應，進而抑制纖維化增生。
綜上，本實驗證明了PPARγ激動劑有拮抗外源性TGF-β1介導的膽管系統纖維化的作用，為治療膽管系統狹窄提供了新的理論基礎。
