引用本文： 陳潔, 呂青, 王竹, 杜正貴, 譚秋文, 王強, 曾荷淋. 乳腺癌分子病理學指標分布的異質性. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(6): 761-765. doi: 10.7507/1007-9424.20160200 復制
乳腺癌是歐美國家女性最常見的惡性腫瘤，近20年在我國其發病率也呈持續上升態勢，目前已躍居部分城市女性惡性腫瘤的第一位[1]。30年來，隨著乳腺癌研究的深入，手術、放療、細胞毒藥物治療、內分泌治療、分子靶向治療、免疫治療等綜合治療手段的廣泛使用，乳腺癌患者的生存率已得到了明顯的提高[2]。特別是隨著內分泌治療和基因靶向治療被成功應用于乳腺癌的治療之后，乳腺癌的療效得到了非常顯著的提高，患者的生活質量也得到較大改善[3]。然而不是每一種乳腺癌都適合上述所有的治療方法，需要根據腫瘤不同的分子類型，選擇不同的、有針對性的治療方法。Perou等[4]在2000年首 先提出了乳腺癌的分子分型并在2011年的St.Gallen會議上得到公認，該方法根據患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor， PR）、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）及增殖細胞核抗原Ki-67的表達情況，將乳腺癌分成四種類型，以指導乳腺癌的個體化治療及預后判斷。因此，2007年美國病理學會的指南明確要求以上四個指標是乳腺癌病理報告中必不可少的內容[5]。由于這四個指標的準確檢測具有舉足輕重的作用，若有偏差可能會導致治療方案發生顛覆性的變化，嚴重影響患者的治療結局，所以對其準確檢測是非常重要的。然而，Moeder等[6]將669例乳腺癌病理標本重新切片后進行ER及PR檢測，發現同以前的病理報告相比，ER的一致性只有0.75，而PR的一致性也只有0.86。在不少臨床試驗中，雖然對ER的檢測進行了嚴格地規定和監測，但研究者[7]仍然發現，對于ER （-） 的患者，仍然有5%～8%的患者對內分泌治療有效。因此推測在日常的診治中，有一部分本來是ER （+）的患者，被誤診為ER （-），而且這個誤診的比例還并不完全清楚。其原因一方面可以歸咎為腫瘤取材、固定、染色試劑等多方面因素的影響，但是隨著免疫組織化學（immunohistochemical，IHC）全封閉自動化檢測系統越來越廣泛的應用和取材固定操作越來越規范，其影響檢測結果的可能性也就越來越小。另一方面，常規病理切片要想精確、全面地判斷不一定均勻性分布的腫瘤分子指標/標志物是非常困難的，因而，腫瘤的異質性（heterogeneity）成為了人們關注的、影響常規腫瘤病理切片檢測結果的最重要的因素。現就乳腺癌分子病理學指標分布的異質性做一綜述。
1 人體實性腫瘤的異質性
腫瘤的異質性系指在同一腫瘤內，由于腫瘤細胞系不同而造成腫瘤細胞特質的差異[8]。腫瘤最初是在組織學方面被發現存在異質性，后來又發現在抗原性、免疫性、激素受體、代謝性、生長速度、對化學藥物的敏感性等方面均存在異質性[9]。且有研 究[10]表明，腫瘤內部構造非常復雜，在不同區域其血管構成、間質成分也不盡相同，也存在異質性。據此Yarbro [11]甚至認為，所有的腫瘤均可被視為“混合”瘤。
幾乎所有的上皮性腫瘤都存在異質性。有研究者[12]估計，在肺癌組織中有高達66%的腫瘤會表現出異質性。李巖磊等[13]檢測了肺癌細胞中CD44的分布，結果提示肺癌細胞存在異質性。胃癌存在異質性的比例也較高，劉麗江等[14]的研究表明，在胃癌組織的同一張切片里出現兩種及以上類型的癌細胞的比例高達58.7%。Gerlinger等[15]的研究也顯示，在腎癌患者中，“預后良好”的基因譜與“預后不良”的基因譜可以出現在同一患者腫瘤的不同位點。于丹等[16]原代培養了人喉癌細胞，將單細胞進行體外克隆，分離喉癌細胞亞群，并進行了形態學、功能狀態、分化增殖能力、裸鼠異體移植成瘤能力等指標的檢測，也證實了喉癌細胞存在異質性。Arnerl?v等[17]對處于乳腺癌瘤體內不同部位的DNA倍體狀態進行了研究，發現轉移潛能較大的亞群較轉移潛能較小的亞群更具有異質性。田海梅等[18]將乳腺癌細胞系MCF-27亞群培養后，也發現乳腺癌細胞在DNA含量和細胞周期時相分布方面存在異質性。許健等[19]更是利用Percoll不連續密度梯度技術，將MCF-7細胞分離成了5個具有異質性的亞群，因此進一步證實了乳腺癌也存在異質性。
2 乳腺癌分子病理學指標的異質性
癌細胞的分子病理學指標是腫瘤診斷、治療和預后判斷中非常重要的指標。這些指標的異質性可以導致在同一個患者的同一個腫瘤中，不同位置的腫瘤細胞有著陰性或陽性兩種截然不同的表達；甚至在同一張病理切片中也存在顯色的差異、腫瘤細胞染色強弱不等及陽性范圍的不同，從而在顯微鏡下形成斑點狀著色（patchy staining） [20]。龔西騟等[21]在1992年開展了乳腺癌腫瘤標本連續切片研究，發現多種抗乳腺癌單克隆抗體在腫瘤組織中的分布呈現明顯的異質性，其主要表現為：①在陽性染色的癌巢內或鄰近區域，可見染色陰性的癌細胞，二者分布互相連續或交叉，構成斑塊狀染色圖案；②強陽性和弱陽性的癌細胞也呈交叉分布。
早在1978年，Tilley等[22]就發現ER在乳腺癌組織中的分布存在著異質性。Taylor等[23]也通過實驗發現，ER在分布、染色強度以及定位諸方面均存在著異質性，因此認為大多數乳腺癌是由各種不同比例的ER陽性和ER陰性細胞群體所構成。Chung等[24]的研究也證實：由于ER的分布存在異質性，導致空芯針穿刺活檢（the core needle biopsy，CNB）結果同術后標本結果的符合率只有75%；通過計算顯示，對于1個體積為1 cm3的乳腺癌組織，1張標準的一般病理切片（一般為10 mm×10 mm×5 μm大）只能代表整個腫瘤組織的0.05%區域的情況，因此，1張或幾張任選的切片并不能完全代表整個腫瘤的ER狀況；同時，該研究者還發現，在同一個標本中，不同部位的ER的一致性很差，能夠達到一致的比例最高才只有22%；而且在腫瘤組織中，還存在ER （+） 細胞聚集的情況。其他的研究者[25-27]也發現，在乳腺癌組織中，約有17%～40%組織的ER分布具有不均勻性。Douglas-Jones等[28]的研究更是表明，乳腺癌從外周向中心，其ER的陽性率逐漸降低，下降的比例是2%/mm。也就是說，如果是1個直徑為 20mm的腫瘤，從邊緣到中心其ER陽性率的下降比率為20%。因此取材部位的不同，會嚴重影響對腫瘤ER結果的真實判斷，甚至導致結果從ER （+）變為ER （-）。
Chen等[29]的研究也提示，HER-2在乳腺癌組織中的分布也具有異質性。而Lehmann等[30]更是使用激光顯微鏡切割技術，精確地分割出了每個乳腺癌腫瘤細胞，并進行實時定量（real-time）的多聚酶鏈聚合反應（polymerase chain reaction）檢測，其結果顯示HER-2基因在腫瘤組織中的分布存在異質性。Ohlschlegel等[31]的研究表明，HER-2的異質率約為14.7%，且在HER-2 （2+） 的標本中最明顯。Seol等[32]的研究更是將HER-2的異質性分為了瘤內分布的異質性和基因擴增的異質性，其中瘤內分布的異質性約占18%，且在激素受體陽性的患者中更明顯。此外，PR及Ki-67在乳腺癌組織中的分布中也被證實存在異質性[6, 33-34]。
由此可見，現有的乳腺癌最基本的分子分型指標ER、PR、HER-2及Ki-67，在腫瘤組織中的分布都存在異質性。
3 乳腺癌分子病理學指標異質性的成因
造成腫瘤異質性的原因有很多。現在有學者[35]認為是腫瘤發生之后，自原發的區域開始，隨著不斷向四周特別是深層的擴展，腫瘤亦不斷演變，導致異質性。在腫瘤發生的不同階段，宿主對腫瘤發生不同的反應，同時又有新的基因參與細胞的活動，從而可能使腫瘤細胞表現出不同的生物學特征。Bryne [10]報道，口腔鱗狀細胞癌（OSCC）浸潤區的細胞同中心區的細胞相比，其分化程度更低。Riviére等[36]也發現，在口腔頜面部和外陰部的鱗狀細胞癌中，深層浸潤區C-myc mRNA的表達水平高于腫瘤表面區。有學者[37-38]認為，大多數腫瘤是單克隆起源，但是其生長過程中的亞組分化導致了異質性的發生。亞群細胞在形態、增殖能力、成瘤性、DNA相對含量及克隆能力方面均存在異質性[39]。
如今，有兩種關于腫瘤異質性成因的假說得到多數學者的認可[39-44]。一種是干細胞學說，該假說認為腫瘤實際上是由一小群具有無限自我更新能力的干細胞樣細胞，及其產生的分化程度不同的細胞團組成。腫瘤干細胞的不對稱分裂，產生細胞質和細胞器的不均勻分布，從而導致腫瘤存在異質性。另一種克隆進化論假說則認為，腫瘤的異質性是由于由單個細胞形成的腫瘤細胞群，在發展的過程中發生突變，引起腫瘤細胞遺傳水平和表型上的多樣性和異質性。腫瘤新發生時所攜帶的突變較少，但在腫瘤發展過程中突變會逐步積累，進而導致異質性逐漸變得更加明顯。如今這兩種假說孰是孰非還沒有定論，有待進一步的研究加以證實。
4 乳腺癌分子病理學指標異質性的影響
ER、PR、Ki-67及HER-2這四種指標在乳腺癌的診斷、治療及預后判斷方面都具有非常重要的作用，但是這些指標的異質性，會給其檢測結果帶來較大的影響。
4.1 對彩超引導下的乳腺腫瘤CNB的影響
由于CNB能提供足夠的組織學標本并進行IHC檢測，具有診斷準確、創傷小、價格便宜等優點[45]， 被公認為是乳腺癌診斷治療的標準流程之一，廣泛應用于臨床。同時隨著乳腺癌術前新輔助治療的廣泛應用，CNB穿刺的標本不光能提供IHC的結果，指導術前新輔助治療方案的選擇，而且對于新輔助治療后達病理完全緩解（pathologic complete response，PCR）的患者來說，新輔助治療前的CNB標本是其乳腺癌的唯一病理學證據，因此CNB更對這類患者的整個治療方案起著決定性作用。如今在歐美國家及我國的大多數乳腺中心，CNB是術前必備的一種檢查方法。現已有很多研究[46-50]證實了CNB對乳腺癌病理類型診斷的準確性，其結果和手術完整切除標本（surgical specimens，SS）的結果具有很高的一致性，達80%～96%。雖然有的回顧性研究[51] 顯示CNB和SS在ER檢測上的一致性高達90%左右，但Sutela等[52]的研究卻顯示，ER在CNB和SS標本的一致性只有83%，一致性檢驗的κ=0.39，一致性較差；但PR的一致性為88%，κ=0.69，反而一致性較好。Chen等[53]的Meta分析納入了27個相關研究，提示ER的一致性只有77.7%～80%，PR的一致性為66.2%～69.5%。Seferina等[54]回顧性分析了526例患者的IHC結果，表明ER在CNB和SS之間的一致率為89.5%，PR為82.5%。但筆者認為這樣的一致性仍然較低，會導致不少患者內分泌治療的錯誤使用或漏用，故還是建議對未行新輔助化療的患者使用SS標本進行ER、PR等檢測。
關于Ki-67及HER-2的檢測準確性，Ricci等[55]也回顧性分析了69例患者的資料，結果顯示Ki-67的CNB與SS檢測的一致率為83%，κ=0.71；HER-2的一致率為78%，κ=0.61，故認為CNB雖然可以用于Ki-67的診斷，但是不建議用于HER-2的判斷。但Greer等[56]的對165例患者的研究結果顯示，CNB和SS中Ki-67的一致率只有73%，κ=0.48；HER-2的一致率雖然為93%，但κ=0.63，故認為二者的一致性仍然較差，所以建議單獨的CNB的IHC結果不能用于患者治療方案的制定。Ough等[57]對209例患者的研究結果更是顯示HER-2的一致率僅56%，κ=0.392 0；Ki-67的一致率僅為59%，κ=0.360 2。 雖然導致CNB和SS在IHC檢測結果上不一致的原因有很多，但是腫瘤的異質性會導致不同特質的腫瘤細胞在瘤體內不均勻分布，而CNB時只切取了腫瘤中的幾條組織，顯然無法代表整個腫瘤的情況，所以腫瘤的異質性可能是導致這種差異的主要原因[58]。
4.2 異質性同預后的關系
在胃癌的研究中，研究者[14]發現腫瘤的異質性越高，淋巴結轉移數目也越多。初步研究[58]也提示，ER及HER-2的異質性和乳腺癌患者的預后也有關。Yang等[59]前瞻性研究了32例復發或轉移的乳腺癌患者，發現乳腺癌組織中ER異質性越高，對內分泌治療的反應越差。同時，Seol等[32]的96例回顧性分析結果提示，HER-2分布的異質性在激素受體陽性的患者中更多見；而且異質性高的患者的無瘤生存率（disease free survival，DFS）更低（P=0.018）；進一步分析顯示，同年齡、T分期（腫瘤大小）、N分期（淋巴結轉移情況）等因素比較，HER-2分布的異質性是獨立的預后影響因素。對中國患者的研究[60]也顯示，原發包塊更大、分化更差、分期更晚（Ⅲ期），腋淋巴結（+）≥4枚及絕經前的患者，HER-2的異質性更高。
4.3 對內分泌治療的影響
研究者[61]發現，即使SS標本診斷為luminal A型的患者，其內分泌治療的有效率也不是100%，而只有60%～70%，而三陰型和HER-2 （+）型患者中卻有10%～20%的患者對內分泌治療有效，其原因即考慮同乳腺癌細胞的異質性有關。
4.4 導致原發灶同復發灶/轉移灶的表達不一致
乳腺癌分子病理學指標的異質性還表現在原發灶同轉移灶或復發灶指標的表達上存在差異[62-63]。
由于大多數轉移或復發灶很難取得病理學活檢標本，臨床中對于無法活檢的患者均按照原發灶的分子病理學指標情況進行治療，因此，這種異質性必將會導致一部分患者接受了錯誤的內分泌及分子靶向治療，或者誤失了內分泌及分子靶向治療的機會。有學者[64]對近年相關文獻進行了Meta分析，在總結的48篇文獻、近4 200例患者中，原發灶和復發病灶中ER和PR不一致的比例分別高達20%和33%。由此則更容易理解中國抗癌協會乳腺癌專業委員會制定的“中國晚期乳腺癌診治專家共識”中，對于進展緩慢、無復發生存時間較長的ER/PR （-）患者，建議仍然可以給予內分泌治療[65]。在陳志萍等[34]的研究中則有高達50%患者的ER、PR及HER-2在原發灶與復發灶間的表達存在差異，其中以激素受體由（+）轉為（-）多見，而HER-2由（-）轉為（+）多見，而且發生這種變化常常提示預后不佳。
5 乳腺癌分子病理學指標異質性的檢測
由于乳腺癌ER、PR、Ki-67及HER-2這四種指標在乳腺癌診斷、治療及預后判斷中均具有非常重要的作用，不少方法和檢測手段被使用以降低腫瘤的異質性對乳腺癌病理檢測結果的影響，提高檢測的準確性[33, 66]。
首先，在取材、固定、染色及結果判讀上，需要嚴格按照國際質量控制標準和規范進行操作，以減少實驗室的誤差。美國臨床腫瘤學會（ASCO）及美國病理醫師協會（CAP）分別在2007年及2010年聯合發布了《乳腺癌HER-2檢測指南》 和《乳腺癌患者雌激素受體及孕激素受體免疫組織化學檢測指南》，并于2013年進行了更新，我國也于2009年發布了國內的HER-2檢測指南[67-69]。隨著這些指南的制定及全自動IHC染色機的廣泛使用，減少了由于病理切片制作中的誤差導致的技術性異質性。
其次，如今探索各種新型檢測技術手段以降低腫瘤異質性對檢測結果準確性的影響的研究也越來越深入。①組織微陣列技術（tissue microaray）即組織芯片技術（tissue chip），是將幾十甚至上百個微組織放在1個載體上（比如1張載玻片）進行組織學研究的技術。該方法可以保證所取的所有樣本在相同的試驗條件下進行處理，減少了實驗誤差，同時具有所需組織量小、能批量處理等優點，是一種高通量、多樣本的分析工具。Moeder等[6]利用該技術將乳腺癌組織石蠟標本的每個切面重新進行多點取樣，以提高ER和PR診斷的一致性。但是該技術仍然存在取樣點不能完全代表整個組織中腫瘤情況的缺點。②激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）技術是一項在顯微鏡下利用激光將所要研究的單一類型細胞群或單個細胞從組織切片中分離及純化的技術。理論上說它成功地解決了組織中的細胞異質性問題，是分子病理學和腫瘤基因組學研究的一項革命性技術。雖然該方法可以提取單個細胞進行單獨地檢測，但是如果將整個腫瘤組織中的上億個腫瘤細胞進行單獨切割檢測，來準確判斷 1例患者的腫瘤細胞分子分型，其時間和經濟上的花費都是巨大的，因而很難在臨床中使用[30]。③正電子斷層顯像（positron emission tomography，PET）能夠無創、動態及定量地從分子水平觀察腫瘤組織的代謝特征，由于不同表型的腫瘤細胞其代謝能力可能存在差異，因此PET-CT可能能反映出不同腫瘤細胞在腫瘤組織中的分布情況。van Baardwijk等[70] 將非小細胞肺癌患者術后的標本進行了18F標記的氟脫氧葡萄糖（18F-fluorodexoy glucose，18F-FDG）PET顯像，勾畫出攝取高、中及低區域，再按照勾畫圖紙分別取三類區域的組織進行病理學檢查，發 現18F-FDG攝取的差異與組織中細胞成分的差異相關。但是18F-FDG是非特異性的代謝標識，攝取的差異尚不能完全等同于腫瘤抗原表達的差異。④在最新的研究[71]中使用了發射正電子的18F與ER抗體結合的顯像劑18F-fluoroestradiol（18F-FES），該顯像劑能準確地和ER結合，能在PET-CT上準確地顯示ER （+）細胞的分布。但是該法價格昂貴，很難廣泛使用，而且也有研究[59, 72]表明，其結果同IHC檢測結果不一致的比例達10%～37%。
病理大切片能完整地觀察到整個組織每一個切面的所有腫瘤情況，如果結合連續切片或小間隔切片，再輔助計算機顯微掃描技術，即能準確、全面地反映整個組織中主要的細胞分布情況。該方法具有準確性高，花費相對較小，采集的圖像便于進一步分析、處理等優點，但是該技術由于切片大，不能采用自動化處理，對標本采集、固定、切片及染色的要求均非常高，質量控制較難，如今只能在大的病理中心的科研中使用[29, 73]。
綜上所述，乳腺癌同其他上皮性腫瘤一樣存在異質性，而決定乳腺癌分子分型的ER、PR、Ki-67及HER-2這四種特征性分子病理學指標在腫瘤組織中的分布也存在異質性。這種異質性會導致常規病理學檢查對這四種指標檢測的不準確、甚至錯誤，進而影響患者治療方案的選擇，并在一定程度上影響患者的預后。如今，雖然有不少新技術用于乳腺癌異質性的研究，但由于各種方法均存在一定缺陷，且有關報道較少，仍需要進一步深入研究以揭示乳腺癌異質性的原因及規律，并尋找減少其影響的可靠方法。
乳腺癌是歐美國家女性最常見的惡性腫瘤，近20年在我國其發病率也呈持續上升態勢，目前已躍居部分城市女性惡性腫瘤的第一位[1]。30年來，隨著乳腺癌研究的深入，手術、放療、細胞毒藥物治療、內分泌治療、分子靶向治療、免疫治療等綜合治療手段的廣泛使用，乳腺癌患者的生存率已得到了明顯的提高[2]。特別是隨著內分泌治療和基因靶向治療被成功應用于乳腺癌的治療之后，乳腺癌的療效得到了非常顯著的提高，患者的生活質量也得到較大改善[3]。然而不是每一種乳腺癌都適合上述所有的治療方法，需要根據腫瘤不同的分子類型，選擇不同的、有針對性的治療方法。Perou等[4]在2000年首 先提出了乳腺癌的分子分型并在2011年的St.Gallen會議上得到公認，該方法根據患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor， PR）、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）及增殖細胞核抗原Ki-67的表達情況，將乳腺癌分成四種類型，以指導乳腺癌的個體化治療及預后判斷。因此，2007年美國病理學會的指南明確要求以上四個指標是乳腺癌病理報告中必不可少的內容[5]。由于這四個指標的準確檢測具有舉足輕重的作用，若有偏差可能會導致治療方案發生顛覆性的變化，嚴重影響患者的治療結局，所以對其準確檢測是非常重要的。然而，Moeder等[6]將669例乳腺癌病理標本重新切片后進行ER及PR檢測，發現同以前的病理報告相比，ER的一致性只有0.75，而PR的一致性也只有0.86。在不少臨床試驗中，雖然對ER的檢測進行了嚴格地規定和監測，但研究者[7]仍然發現，對于ER （-） 的患者，仍然有5%～8%的患者對內分泌治療有效。因此推測在日常的診治中，有一部分本來是ER （+）的患者，被誤診為ER （-），而且這個誤診的比例還并不完全清楚。其原因一方面可以歸咎為腫瘤取材、固定、染色試劑等多方面因素的影響，但是隨著免疫組織化學（immunohistochemical，IHC）全封閉自動化檢測系統越來越廣泛的應用和取材固定操作越來越規范，其影響檢測結果的可能性也就越來越小。另一方面，常規病理切片要想精確、全面地判斷不一定均勻性分布的腫瘤分子指標/標志物是非常困難的，因而，腫瘤的異質性（heterogeneity）成為了人們關注的、影響常規腫瘤病理切片檢測結果的最重要的因素。現就乳腺癌分子病理學指標分布的異質性做一綜述。
1 人體實性腫瘤的異質性
腫瘤的異質性系指在同一腫瘤內，由于腫瘤細胞系不同而造成腫瘤細胞特質的差異[8]。腫瘤最初是在組織學方面被發現存在異質性，后來又發現在抗原性、免疫性、激素受體、代謝性、生長速度、對化學藥物的敏感性等方面均存在異質性[9]。且有研 究[10]表明，腫瘤內部構造非常復雜，在不同區域其血管構成、間質成分也不盡相同，也存在異質性。據此Yarbro [11]甚至認為，所有的腫瘤均可被視為“混合”瘤。
幾乎所有的上皮性腫瘤都存在異質性。有研究者[12]估計，在肺癌組織中有高達66%的腫瘤會表現出異質性。李巖磊等[13]檢測了肺癌細胞中CD44的分布，結果提示肺癌細胞存在異質性。胃癌存在異質性的比例也較高，劉麗江等[14]的研究表明，在胃癌組織的同一張切片里出現兩種及以上類型的癌細胞的比例高達58.7%。Gerlinger等[15]的研究也顯示，在腎癌患者中，“預后良好”的基因譜與“預后不良”的基因譜可以出現在同一患者腫瘤的不同位點。于丹等[16]原代培養了人喉癌細胞，將單細胞進行體外克隆，分離喉癌細胞亞群，并進行了形態學、功能狀態、分化增殖能力、裸鼠異體移植成瘤能力等指標的檢測，也證實了喉癌細胞存在異質性。Arnerl?v等[17]對處于乳腺癌瘤體內不同部位的DNA倍體狀態進行了研究，發現轉移潛能較大的亞群較轉移潛能較小的亞群更具有異質性。田海梅等[18]將乳腺癌細胞系MCF-27亞群培養后，也發現乳腺癌細胞在DNA含量和細胞周期時相分布方面存在異質性。許健等[19]更是利用Percoll不連續密度梯度技術，將MCF-7細胞分離成了5個具有異質性的亞群，因此進一步證實了乳腺癌也存在異質性。
2 乳腺癌分子病理學指標的異質性
癌細胞的分子病理學指標是腫瘤診斷、治療和預后判斷中非常重要的指標。這些指標的異質性可以導致在同一個患者的同一個腫瘤中，不同位置的腫瘤細胞有著陰性或陽性兩種截然不同的表達；甚至在同一張病理切片中也存在顯色的差異、腫瘤細胞染色強弱不等及陽性范圍的不同，從而在顯微鏡下形成斑點狀著色（patchy staining） [20]。龔西騟等[21]在1992年開展了乳腺癌腫瘤標本連續切片研究，發現多種抗乳腺癌單克隆抗體在腫瘤組織中的分布呈現明顯的異質性，其主要表現為：①在陽性染色的癌巢內或鄰近區域，可見染色陰性的癌細胞，二者分布互相連續或交叉，構成斑塊狀染色圖案；②強陽性和弱陽性的癌細胞也呈交叉分布。
早在1978年，Tilley等[22]就發現ER在乳腺癌組織中的分布存在著異質性。Taylor等[23]也通過實驗發現，ER在分布、染色強度以及定位諸方面均存在著異質性，因此認為大多數乳腺癌是由各種不同比例的ER陽性和ER陰性細胞群體所構成。Chung等[24]的研究也證實：由于ER的分布存在異質性，導致空芯針穿刺活檢（the core needle biopsy，CNB）結果同術后標本結果的符合率只有75%；通過計算顯示，對于1個體積為1 cm3的乳腺癌組織，1張標準的一般病理切片（一般為10 mm×10 mm×5 μm大）只能代表整個腫瘤組織的0.05%區域的情況，因此，1張或幾張任選的切片并不能完全代表整個腫瘤的ER狀況；同時，該研究者還發現，在同一個標本中，不同部位的ER的一致性很差，能夠達到一致的比例最高才只有22%；而且在腫瘤組織中，還存在ER （+） 細胞聚集的情況。其他的研究者[25-27]也發現，在乳腺癌組織中，約有17%～40%組織的ER分布具有不均勻性。Douglas-Jones等[28]的研究更是表明，乳腺癌從外周向中心，其ER的陽性率逐漸降低，下降的比例是2%/mm。也就是說，如果是1個直徑為 20mm的腫瘤，從邊緣到中心其ER陽性率的下降比率為20%。因此取材部位的不同，會嚴重影響對腫瘤ER結果的真實判斷，甚至導致結果從ER （+）變為ER （-）。
Chen等[29]的研究也提示，HER-2在乳腺癌組織中的分布也具有異質性。而Lehmann等[30]更是使用激光顯微鏡切割技術，精確地分割出了每個乳腺癌腫瘤細胞，并進行實時定量（real-time）的多聚酶鏈聚合反應（polymerase chain reaction）檢測，其結果顯示HER-2基因在腫瘤組織中的分布存在異質性。Ohlschlegel等[31]的研究表明，HER-2的異質率約為14.7%，且在HER-2 （2+） 的標本中最明顯。Seol等[32]的研究更是將HER-2的異質性分為了瘤內分布的異質性和基因擴增的異質性，其中瘤內分布的異質性約占18%，且在激素受體陽性的患者中更明顯。此外，PR及Ki-67在乳腺癌組織中的分布中也被證實存在異質性[6, 33-34]。
由此可見，現有的乳腺癌最基本的分子分型指標ER、PR、HER-2及Ki-67，在腫瘤組織中的分布都存在異質性。
3 乳腺癌分子病理學指標異質性的成因
造成腫瘤異質性的原因有很多。現在有學者[35]認為是腫瘤發生之后，自原發的區域開始，隨著不斷向四周特別是深層的擴展，腫瘤亦不斷演變，導致異質性。在腫瘤發生的不同階段，宿主對腫瘤發生不同的反應，同時又有新的基因參與細胞的活動，從而可能使腫瘤細胞表現出不同的生物學特征。Bryne [10]報道，口腔鱗狀細胞癌（OSCC）浸潤區的細胞同中心區的細胞相比，其分化程度更低。Riviére等[36]也發現，在口腔頜面部和外陰部的鱗狀細胞癌中，深層浸潤區C-myc mRNA的表達水平高于腫瘤表面區。有學者[37-38]認為，大多數腫瘤是單克隆起源，但是其生長過程中的亞組分化導致了異質性的發生。亞群細胞在形態、增殖能力、成瘤性、DNA相對含量及克隆能力方面均存在異質性[39]。
如今，有兩種關于腫瘤異質性成因的假說得到多數學者的認可[39-44]。一種是干細胞學說，該假說認為腫瘤實際上是由一小群具有無限自我更新能力的干細胞樣細胞，及其產生的分化程度不同的細胞團組成。腫瘤干細胞的不對稱分裂，產生細胞質和細胞器的不均勻分布，從而導致腫瘤存在異質性。另一種克隆進化論假說則認為，腫瘤的異質性是由于由單個細胞形成的腫瘤細胞群，在發展的過程中發生突變，引起腫瘤細胞遺傳水平和表型上的多樣性和異質性。腫瘤新發生時所攜帶的突變較少，但在腫瘤發展過程中突變會逐步積累，進而導致異質性逐漸變得更加明顯。如今這兩種假說孰是孰非還沒有定論，有待進一步的研究加以證實。
4 乳腺癌分子病理學指標異質性的影響
ER、PR、Ki-67及HER-2這四種指標在乳腺癌的診斷、治療及預后判斷方面都具有非常重要的作用，但是這些指標的異質性，會給其檢測結果帶來較大的影響。
4.1 對彩超引導下的乳腺腫瘤CNB的影響
由于CNB能提供足夠的組織學標本并進行IHC檢測，具有診斷準確、創傷小、價格便宜等優點[45]， 被公認為是乳腺癌診斷治療的標準流程之一，廣泛應用于臨床。同時隨著乳腺癌術前新輔助治療的廣泛應用，CNB穿刺的標本不光能提供IHC的結果，指導術前新輔助治療方案的選擇，而且對于新輔助治療后達病理完全緩解（pathologic complete response，PCR）的患者來說，新輔助治療前的CNB標本是其乳腺癌的唯一病理學證據，因此CNB更對這類患者的整個治療方案起著決定性作用。如今在歐美國家及我國的大多數乳腺中心，CNB是術前必備的一種檢查方法。現已有很多研究[46-50]證實了CNB對乳腺癌病理類型診斷的準確性，其結果和手術完整切除標本（surgical specimens，SS）的結果具有很高的一致性，達80%～96%。雖然有的回顧性研究[51] 顯示CNB和SS在ER檢測上的一致性高達90%左右，但Sutela等[52]的研究卻顯示，ER在CNB和SS標本的一致性只有83%，一致性檢驗的κ=0.39，一致性較差；但PR的一致性為88%，κ=0.69，反而一致性較好。Chen等[53]的Meta分析納入了27個相關研究，提示ER的一致性只有77.7%～80%，PR的一致性為66.2%～69.5%。Seferina等[54]回顧性分析了526例患者的IHC結果，表明ER在CNB和SS之間的一致率為89.5%，PR為82.5%。但筆者認為這樣的一致性仍然較低，會導致不少患者內分泌治療的錯誤使用或漏用，故還是建議對未行新輔助化療的患者使用SS標本進行ER、PR等檢測。
關于Ki-67及HER-2的檢測準確性，Ricci等[55]也回顧性分析了69例患者的資料，結果顯示Ki-67的CNB與SS檢測的一致率為83%，κ=0.71；HER-2的一致率為78%，κ=0.61，故認為CNB雖然可以用于Ki-67的診斷，但是不建議用于HER-2的判斷。但Greer等[56]的對165例患者的研究結果顯示，CNB和SS中Ki-67的一致率只有73%，κ=0.48；HER-2的一致率雖然為93%，但κ=0.63，故認為二者的一致性仍然較差，所以建議單獨的CNB的IHC結果不能用于患者治療方案的制定。Ough等[57]對209例患者的研究結果更是顯示HER-2的一致率僅56%，κ=0.392 0；Ki-67的一致率僅為59%，κ=0.360 2。 雖然導致CNB和SS在IHC檢測結果上不一致的原因有很多，但是腫瘤的異質性會導致不同特質的腫瘤細胞在瘤體內不均勻分布，而CNB時只切取了腫瘤中的幾條組織，顯然無法代表整個腫瘤的情況，所以腫瘤的異質性可能是導致這種差異的主要原因[58]。
4.2 異質性同預后的關系
在胃癌的研究中，研究者[14]發現腫瘤的異質性越高，淋巴結轉移數目也越多。初步研究[58]也提示，ER及HER-2的異質性和乳腺癌患者的預后也有關。Yang等[59]前瞻性研究了32例復發或轉移的乳腺癌患者，發現乳腺癌組織中ER異質性越高，對內分泌治療的反應越差。同時，Seol等[32]的96例回顧性分析結果提示，HER-2分布的異質性在激素受體陽性的患者中更多見；而且異質性高的患者的無瘤生存率（disease free survival，DFS）更低（P=0.018）；進一步分析顯示，同年齡、T分期（腫瘤大小）、N分期（淋巴結轉移情況）等因素比較，HER-2分布的異質性是獨立的預后影響因素。對中國患者的研究[60]也顯示，原發包塊更大、分化更差、分期更晚（Ⅲ期），腋淋巴結（+）≥4枚及絕經前的患者，HER-2的異質性更高。
4.3 對內分泌治療的影響
研究者[61]發現，即使SS標本診斷為luminal A型的患者，其內分泌治療的有效率也不是100%，而只有60%～70%，而三陰型和HER-2 （+）型患者中卻有10%～20%的患者對內分泌治療有效，其原因即考慮同乳腺癌細胞的異質性有關。
4.4 導致原發灶同復發灶/轉移灶的表達不一致
乳腺癌分子病理學指標的異質性還表現在原發灶同轉移灶或復發灶指標的表達上存在差異[62-63]。
由于大多數轉移或復發灶很難取得病理學活檢標本，臨床中對于無法活檢的患者均按照原發灶的分子病理學指標情況進行治療，因此，這種異質性必將會導致一部分患者接受了錯誤的內分泌及分子靶向治療，或者誤失了內分泌及分子靶向治療的機會。有學者[64]對近年相關文獻進行了Meta分析，在總結的48篇文獻、近4 200例患者中，原發灶和復發病灶中ER和PR不一致的比例分別高達20%和33%。由此則更容易理解中國抗癌協會乳腺癌專業委員會制定的“中國晚期乳腺癌診治專家共識”中，對于進展緩慢、無復發生存時間較長的ER/PR （-）患者，建議仍然可以給予內分泌治療[65]。在陳志萍等[34]的研究中則有高達50%患者的ER、PR及HER-2在原發灶與復發灶間的表達存在差異，其中以激素受體由（+）轉為（-）多見，而HER-2由（-）轉為（+）多見，而且發生這種變化常常提示預后不佳。
5 乳腺癌分子病理學指標異質性的檢測
由于乳腺癌ER、PR、Ki-67及HER-2這四種指標在乳腺癌診斷、治療及預后判斷中均具有非常重要的作用，不少方法和檢測手段被使用以降低腫瘤的異質性對乳腺癌病理檢測結果的影響，提高檢測的準確性[33, 66]。
首先，在取材、固定、染色及結果判讀上，需要嚴格按照國際質量控制標準和規范進行操作，以減少實驗室的誤差。美國臨床腫瘤學會（ASCO）及美國病理醫師協會（CAP）分別在2007年及2010年聯合發布了《乳腺癌HER-2檢測指南》 和《乳腺癌患者雌激素受體及孕激素受體免疫組織化學檢測指南》，并于2013年進行了更新，我國也于2009年發布了國內的HER-2檢測指南[67-69]。隨著這些指南的制定及全自動IHC染色機的廣泛使用，減少了由于病理切片制作中的誤差導致的技術性異質性。
其次，如今探索各種新型檢測技術手段以降低腫瘤異質性對檢測結果準確性的影響的研究也越來越深入。①組織微陣列技術（tissue microaray）即組織芯片技術（tissue chip），是將幾十甚至上百個微組織放在1個載體上（比如1張載玻片）進行組織學研究的技術。該方法可以保證所取的所有樣本在相同的試驗條件下進行處理，減少了實驗誤差，同時具有所需組織量小、能批量處理等優點，是一種高通量、多樣本的分析工具。Moeder等[6]利用該技術將乳腺癌組織石蠟標本的每個切面重新進行多點取樣，以提高ER和PR診斷的一致性。但是該技術仍然存在取樣點不能完全代表整個組織中腫瘤情況的缺點。②激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）技術是一項在顯微鏡下利用激光將所要研究的單一類型細胞群或單個細胞從組織切片中分離及純化的技術。理論上說它成功地解決了組織中的細胞異質性問題，是分子病理學和腫瘤基因組學研究的一項革命性技術。雖然該方法可以提取單個細胞進行單獨地檢測，但是如果將整個腫瘤組織中的上億個腫瘤細胞進行單獨切割檢測，來準確判斷 1例患者的腫瘤細胞分子分型，其時間和經濟上的花費都是巨大的，因而很難在臨床中使用[30]。③正電子斷層顯像（positron emission tomography，PET）能夠無創、動態及定量地從分子水平觀察腫瘤組織的代謝特征，由于不同表型的腫瘤細胞其代謝能力可能存在差異，因此PET-CT可能能反映出不同腫瘤細胞在腫瘤組織中的分布情況。van Baardwijk等[70] 將非小細胞肺癌患者術后的標本進行了18F標記的氟脫氧葡萄糖（18F-fluorodexoy glucose，18F-FDG）PET顯像，勾畫出攝取高、中及低區域，再按照勾畫圖紙分別取三類區域的組織進行病理學檢查，發 現18F-FDG攝取的差異與組織中細胞成分的差異相關。但是18F-FDG是非特異性的代謝標識，攝取的差異尚不能完全等同于腫瘤抗原表達的差異。④在最新的研究[71]中使用了發射正電子的18F與ER抗體結合的顯像劑18F-fluoroestradiol（18F-FES），該顯像劑能準確地和ER結合，能在PET-CT上準確地顯示ER （+）細胞的分布。但是該法價格昂貴，很難廣泛使用，而且也有研究[59, 72]表明，其結果同IHC檢測結果不一致的比例達10%～37%。
病理大切片能完整地觀察到整個組織每一個切面的所有腫瘤情況，如果結合連續切片或小間隔切片，再輔助計算機顯微掃描技術，即能準確、全面地反映整個組織中主要的細胞分布情況。該方法具有準確性高，花費相對較小，采集的圖像便于進一步分析、處理等優點，但是該技術由于切片大，不能采用自動化處理，對標本采集、固定、切片及染色的要求均非常高，質量控制較難，如今只能在大的病理中心的科研中使用[29, 73]。
綜上所述，乳腺癌同其他上皮性腫瘤一樣存在異質性，而決定乳腺癌分子分型的ER、PR、Ki-67及HER-2這四種特征性分子病理學指標在腫瘤組織中的分布也存在異質性。這種異質性會導致常規病理學檢查對這四種指標檢測的不準確、甚至錯誤，進而影響患者治療方案的選擇，并在一定程度上影響患者的預后。如今，雖然有不少新技術用于乳腺癌異質性的研究，但由于各種方法均存在一定缺陷，且有關報道較少，仍需要進一步深入研究以揭示乳腺癌異質性的原因及規律，并尋找減少其影響的可靠方法。