引用本文： 崔飛博, 陳南征, 鄭見寶, 張冠軍, 孫學軍, CUIFei-bo, CHENNan-zheng, ZHENGJian-bao, ZHANGGuan-jun, SUNXue-jun. 結直腸癌組織中EGFR、BRAF和K-Ras基因的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(5): 556-560. doi: 10.7507/1007-9424.20160149 復制
結直腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，病死率位居惡性腫瘤死因的第2位，治療效果不甚理想[1]。在我國，隨著飲食結構、生活習慣、環境的改變以及致病因素的增多，結直腸癌的發病率也有逐年增高的趨勢[2]。早發現、早治療對結直腸癌患者的預后有著非常重要的意義。研究[3]發現，結直腸惡性腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移等依賴多種生長因子的刺激、介導細胞內級聯信號轉導，其中最重要的是血管內皮生長因子受體（EGFR）信號通路，即Ras/Raf/MEK/ERK/MARP信號通路。位于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通道起始處的鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1 （BRAF）是一種癌基因，它受上游Ras蛋白激酶的調控[4]。鼠Kirsten肉瘤病毒致癌基因（K-Ras）是MAPK信號轉導通路中的下游基因[5]。由于EGFR、BRAF、K-Ras可在同一信號轉導通路中發揮作用，參與腫瘤的發生、發展，并且三者在甲狀腺癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中研究較為普遍，但在結直腸癌中卻鮮有報道。因此，在本研究中，我們通過檢測結直腸癌組織中EGFR、K-Ras及BRAF的表達，探討三者在結直腸癌發生、發展中的研究價值。
1 資料與方法
1.1 組織標本
收集西安交通大學醫學院第一附屬醫院2011年1月至2013年12月期間的結直腸癌手術組織標本136例及其相應的癌旁正常結直腸組織。所有患者術前均未接受放、化療。結直腸癌組織取自原發灶中央非壞死部分，正常結直腸組織取自距離腫瘤原發灶≥5 cm處。所有病例均經病理檢查證實，每例標本經切片后HE染色鏡檢再次復查認定。標本離體后浸入10%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋、切片，用于病理組織學檢查以及免疫組織化學染色。本研究經西安交通大學第一附屬醫院倫理委員會審核批準。
1.2 免疫組織化學方法檢測EGFR、K-Ras及BRAF基因的蛋白表達
1.2.1 主要試劑及方法
EGFR （1 : 500）、K-Ras （1 : 500）及BRAF （1 : 200）兔抗人單克隆抗體均購自美國Epitomics公司，免疫組織化學SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。采用免疫組織化學SP法進行檢測，嚴格按SP試劑盒說明書進行實驗操作。
1.2.2 結果判斷標準
EGFR、K-Ras及BRAF蛋白陽性表達均為細胞漿或細胞膜內出現棕黃色細顆粒，在細胞靶部位著色者計為陽性細胞。隨機選取5個高倍鏡視野進行觀察，根據陽性細胞的染色強度及比例評分。染色強度（與背景著色對比）：無色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分；陽性細胞染色比例：陰性記為0分，≤25%記為1分，25%～75%記為2分，>75%記為3分。取5個視野兩者乘積的平均值即為最終陽性染色得分：0～2分（-），3～4分（+），5～7分（++），8～9分（+++）。由兩名有經驗的病理醫師獨立進行判斷[6]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 18.0統計軟件。采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗。相關性采用Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EGFR、K-Ras及BRAF基因在結直腸癌組織及正常結直腸組織中表達的免疫組織化學結果
在136例結直腸癌組織及其相應的癌旁正常結直腸組織中均檢測到EGFR、K-Ras及BRAF的蛋白陽性表達，三者均主要表達于細胞漿中，呈棕黃色顆粒表現，正常結直腸黏膜上皮細胞呈彌漫性分布，著色較淺，部分呈局灶性，結直腸癌組織多呈陽性反應，著色較重（圖 1、2）。EGFR和K-Ras蛋白在136例結直腸癌組織中的表達陽性率明顯高于其在相應的癌旁正常結直腸組織中的表達（P <0.05），而K-Ras蛋白在兩種組織中的蛋白表達陽性率比較差異無統計學意義（P >0.05），見表 1。
圖1
EGFR、BRAF及K-Ras蛋白在結直腸癌組織中的表達結果（SP ×200）。1A： EGFR、BRAF及K-Ras陰性表達；1B：EGFR陽性表達；1C：BRAF陽性表達；1D：K-Ras陽性表達??圖2??EGFR、BRAF及K-Ras蛋白在癌旁正常結直腸組織中的表達結果（SP ×200）。2A：EGFR、BRAF及K-Ras 陰性表達；2B：EGFR陽性表達；2C：BRAF陽性表達；2D：K-Ras陽性表達
表1
EGFR、BRAF及K-Ras基因在結直腸癌組織及其相應的癌旁正常結直腸組織中的表達情況（例）
2.2 EGFR、K-Ras及BRAF在結直腸癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系
EGFR、K-Ras及BRAF在結直腸癌組織中的表達與患者的性別和年齡均無關（P >0.05）。EGFR表達與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結轉移有關（P <0.05）；BRAF表達與TNM分期有關（P < 0.05），而與腫瘤分化程度及淋巴結轉移無關（P > 0.05）；K-Ras在結直腸癌組織中表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均無關（P > 0.05）。見表 2。
表2
EGFR、K-Ras、BRAF基因在結直腸癌組織中的表達與其臨床病理因素的關系（例）
2.3 EGFR、BRAF及K-Ras在結直腸癌組織中表達的相關性分析結果
結直腸癌組織中EGFR、K-Ras及BRAF的蛋白表達經相關性分析證實，三者之間均無相關性（P >0.05）。 見表 3、4。
表3
EGFR與BRAF、K-Ras在結直腸癌組織中表達的相關性分析結果
表4
BRAF與K-Ras在結直腸癌組織中表達的相關性分析結果
3 討論
結直腸癌在女性惡性腫瘤中位居第4位，在男性惡性腫瘤中位居第3位[7]。近年來，結直腸癌發病率逐漸升高，且呈低齡化趨勢。與大多數惡性腫瘤相似，結直腸癌的發生同樣受環境因素和遺傳因素的共同作用，體細胞惡變過程涉及多個癌基因和抑癌基因的改變，是多基因、多步驟協同累積的結果[8]。隨著對腫瘤研究的深入及分子靶向治療藥物的出現為腫瘤治療提供了新思路，其中以EGFR為靶點的研究最為廣泛[9]。目前抗EGFR單克隆抗體已進入臨床，且發揮著重要的抗腫瘤效應，EGFR信號轉導通路已經成為抗腫瘤藥物的重要研究靶點。但是，僅依靠EGFR蛋白表達的高低不能指導臨床工作評估抗EGFR分子靶向藥物的應用，也不能準確預測患者預后。因此，尋找預測性的生物標志物，建立一套較為準確的EGFR靶向治療療效預測體系，真正實現結直腸癌患者的個體化治療，顯得尤為必要。
EGFR廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞等細胞的表面，它是一種酪氨酸激酶受體，位于第7號染色體p13～q22區的人EGFR基因，由28個外顯子組成，編碼1 186個氨基酸，它的異常表達可以使細胞信號通路持續活化、細胞無限制生長、轉移以及血管生成，最終導致腫瘤的發生和發展[10]，包括結直腸癌在內的大多數惡性腫瘤的發生、發展與EGFR過表達有關[11]。研究[12-15]發現，高達65%～70%的結直腸癌患者存在EGFR過表達，腫瘤的淋巴結轉移、浸潤、臨床分期等與EGFR過表達密切相關。因此，EGFR成為抑制腫瘤生長的一個重要靶點。本研究結果發現，在136例結直腸癌組織中EGFR的表達陽性率為70.59%，明顯高于其在癌旁正常結直腸組織的35.29%，兩者比較差異有統計學意義（P <0.05），結果提示，EGFR表達失控在結直腸癌的發生、發展過程中起著重要作用。隨著結直腸癌的TNM分期和分化程度增加以及淋巴結轉移的發生，EGFR的蛋白表達陽性率也隨之升高，提示EGFR有促進結直腸癌生長與轉移的作用，其有可能成為判斷腫瘤惡性程度和預后的一個指標。
BRAF基因屬于RAF家族，受其上游Ras蛋白激酶的調控，是Ras/MAPK最重要的激活因子之一，通過增加基質金屬蛋白酶分泌，改變整合素表達，從而促進細胞增殖和侵襲，影響腫瘤進展[16-18]。本研究結果發現，結直腸癌組織中BRAF蛋白的表達陽性率遠高于其癌旁正常結直腸組織（P<0.05），隨著TNM分期的增加而其表達陽性率升高，提示BRAF過表達可能促進結直腸癌的發生、發展。
K-Ras基因是EGFR信號轉導通路的下游基因[19]，激活后的Ras蛋白始終與GTP結合，并保持活化狀態，可以持續激活下游信號轉導[20]，通過Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK細胞轉導途徑，促進細胞不可控制的增殖、惡變，即該信號通路失控與腫瘤細胞的異常分化、惡性增殖、血管形成、凋亡受抑等密切相關[21]。本研究中K-Ras蛋白表達陽性率在結直腸癌組織中與其癌旁正常結直腸組織中表達差異無統計學意義（P >0.05），且其表達陽性率與腫瘤臨床分期、分化程度及淋巴結轉移亦均無關（P >0.05），其在結直腸癌發生、發展中的作用有待進一步研究。
新近的研究[22-24]發現，結直腸癌細胞的增殖是依賴多種基因的共同調控的結果。本研究中，結直腸癌組織中EGFR、K-Ras及BRAF蛋白表達陽性之間并無相關性，因此我們認為，EGFR、K-Ras及BRAF可能是相互獨立地影響著結直腸癌的進程，有待進一步進行研究。
結直腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，病死率位居惡性腫瘤死因的第2位，治療效果不甚理想[1]。在我國，隨著飲食結構、生活習慣、環境的改變以及致病因素的增多，結直腸癌的發病率也有逐年增高的趨勢[2]。早發現、早治療對結直腸癌患者的預后有著非常重要的意義。研究[3]發現，結直腸惡性腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移等依賴多種生長因子的刺激、介導細胞內級聯信號轉導，其中最重要的是血管內皮生長因子受體（EGFR）信號通路，即Ras/Raf/MEK/ERK/MARP信號通路。位于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通道起始處的鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1 （BRAF）是一種癌基因，它受上游Ras蛋白激酶的調控[4]。鼠Kirsten肉瘤病毒致癌基因（K-Ras）是MAPK信號轉導通路中的下游基因[5]。由于EGFR、BRAF、K-Ras可在同一信號轉導通路中發揮作用，參與腫瘤的發生、發展，并且三者在甲狀腺癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中研究較為普遍，但在結直腸癌中卻鮮有報道。因此，在本研究中，我們通過檢測結直腸癌組織中EGFR、K-Ras及BRAF的表達，探討三者在結直腸癌發生、發展中的研究價值。
1 資料與方法
1.1 組織標本
收集西安交通大學醫學院第一附屬醫院2011年1月至2013年12月期間的結直腸癌手術組織標本136例及其相應的癌旁正常結直腸組織。所有患者術前均未接受放、化療。結直腸癌組織取自原發灶中央非壞死部分，正常結直腸組織取自距離腫瘤原發灶≥5 cm處。所有病例均經病理檢查證實，每例標本經切片后HE染色鏡檢再次復查認定。標本離體后浸入10%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋、切片，用于病理組織學檢查以及免疫組織化學染色。本研究經西安交通大學第一附屬醫院倫理委員會審核批準。
1.2 免疫組織化學方法檢測EGFR、K-Ras及BRAF基因的蛋白表達
1.2.1 主要試劑及方法
EGFR （1 : 500）、K-Ras （1 : 500）及BRAF （1 : 200）兔抗人單克隆抗體均購自美國Epitomics公司，免疫組織化學SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。采用免疫組織化學SP法進行檢測，嚴格按SP試劑盒說明書進行實驗操作。
1.2.2 結果判斷標準
EGFR、K-Ras及BRAF蛋白陽性表達均為細胞漿或細胞膜內出現棕黃色細顆粒，在細胞靶部位著色者計為陽性細胞。隨機選取5個高倍鏡視野進行觀察，根據陽性細胞的染色強度及比例評分。染色強度（與背景著色對比）：無色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分；陽性細胞染色比例：陰性記為0分，≤25%記為1分，25%～75%記為2分，>75%記為3分。取5個視野兩者乘積的平均值即為最終陽性染色得分：0～2分（-），3～4分（+），5～7分（++），8～9分（+++）。由兩名有經驗的病理醫師獨立進行判斷[6]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 18.0統計軟件。采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗。相關性采用Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EGFR、K-Ras及BRAF基因在結直腸癌組織及正常結直腸組織中表達的免疫組織化學結果
在136例結直腸癌組織及其相應的癌旁正常結直腸組織中均檢測到EGFR、K-Ras及BRAF的蛋白陽性表達，三者均主要表達于細胞漿中，呈棕黃色顆粒表現，正常結直腸黏膜上皮細胞呈彌漫性分布，著色較淺，部分呈局灶性，結直腸癌組織多呈陽性反應，著色較重（圖 1、2）。EGFR和K-Ras蛋白在136例結直腸癌組織中的表達陽性率明顯高于其在相應的癌旁正常結直腸組織中的表達（P <0.05），而K-Ras蛋白在兩種組織中的蛋白表達陽性率比較差異無統計學意義（P >0.05），見表 1。
圖1
EGFR、BRAF及K-Ras蛋白在結直腸癌組織中的表達結果（SP ×200）。1A： EGFR、BRAF及K-Ras陰性表達；1B：EGFR陽性表達；1C：BRAF陽性表達；1D：K-Ras陽性表達??圖2??EGFR、BRAF及K-Ras蛋白在癌旁正常結直腸組織中的表達結果（SP ×200）。2A：EGFR、BRAF及K-Ras 陰性表達；2B：EGFR陽性表達；2C：BRAF陽性表達；2D：K-Ras陽性表達
表1
EGFR、BRAF及K-Ras基因在結直腸癌組織及其相應的癌旁正常結直腸組織中的表達情況（例）
2.2 EGFR、K-Ras及BRAF在結直腸癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系
EGFR、K-Ras及BRAF在結直腸癌組織中的表達與患者的性別和年齡均無關（P >0.05）。EGFR表達與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結轉移有關（P <0.05）；BRAF表達與TNM分期有關（P < 0.05），而與腫瘤分化程度及淋巴結轉移無關（P > 0.05）；K-Ras在結直腸癌組織中表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均無關（P > 0.05）。見表 2。
表2
EGFR、K-Ras、BRAF基因在結直腸癌組織中的表達與其臨床病理因素的關系（例）
2.3 EGFR、BRAF及K-Ras在結直腸癌組織中表達的相關性分析結果
結直腸癌組織中EGFR、K-Ras及BRAF的蛋白表達經相關性分析證實，三者之間均無相關性（P >0.05）。 見表 3、4。
表3
EGFR與BRAF、K-Ras在結直腸癌組織中表達的相關性分析結果
表4
BRAF與K-Ras在結直腸癌組織中表達的相關性分析結果
3 討論
結直腸癌在女性惡性腫瘤中位居第4位，在男性惡性腫瘤中位居第3位[7]。近年來，結直腸癌發病率逐漸升高，且呈低齡化趨勢。與大多數惡性腫瘤相似，結直腸癌的發生同樣受環境因素和遺傳因素的共同作用，體細胞惡變過程涉及多個癌基因和抑癌基因的改變，是多基因、多步驟協同累積的結果[8]。隨著對腫瘤研究的深入及分子靶向治療藥物的出現為腫瘤治療提供了新思路，其中以EGFR為靶點的研究最為廣泛[9]。目前抗EGFR單克隆抗體已進入臨床，且發揮著重要的抗腫瘤效應，EGFR信號轉導通路已經成為抗腫瘤藥物的重要研究靶點。但是，僅依靠EGFR蛋白表達的高低不能指導臨床工作評估抗EGFR分子靶向藥物的應用，也不能準確預測患者預后。因此，尋找預測性的生物標志物，建立一套較為準確的EGFR靶向治療療效預測體系，真正實現結直腸癌患者的個體化治療，顯得尤為必要。
EGFR廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞等細胞的表面，它是一種酪氨酸激酶受體，位于第7號染色體p13～q22區的人EGFR基因，由28個外顯子組成，編碼1 186個氨基酸，它的異常表達可以使細胞信號通路持續活化、細胞無限制生長、轉移以及血管生成，最終導致腫瘤的發生和發展[10]，包括結直腸癌在內的大多數惡性腫瘤的發生、發展與EGFR過表達有關[11]。研究[12-15]發現，高達65%～70%的結直腸癌患者存在EGFR過表達，腫瘤的淋巴結轉移、浸潤、臨床分期等與EGFR過表達密切相關。因此，EGFR成為抑制腫瘤生長的一個重要靶點。本研究結果發現，在136例結直腸癌組織中EGFR的表達陽性率為70.59%，明顯高于其在癌旁正常結直腸組織的35.29%，兩者比較差異有統計學意義（P <0.05），結果提示，EGFR表達失控在結直腸癌的發生、發展過程中起著重要作用。隨著結直腸癌的TNM分期和分化程度增加以及淋巴結轉移的發生，EGFR的蛋白表達陽性率也隨之升高，提示EGFR有促進結直腸癌生長與轉移的作用，其有可能成為判斷腫瘤惡性程度和預后的一個指標。
BRAF基因屬于RAF家族，受其上游Ras蛋白激酶的調控，是Ras/MAPK最重要的激活因子之一，通過增加基質金屬蛋白酶分泌，改變整合素表達，從而促進細胞增殖和侵襲，影響腫瘤進展[16-18]。本研究結果發現，結直腸癌組織中BRAF蛋白的表達陽性率遠高于其癌旁正常結直腸組織（P<0.05），隨著TNM分期的增加而其表達陽性率升高，提示BRAF過表達可能促進結直腸癌的發生、發展。
K-Ras基因是EGFR信號轉導通路的下游基因[19]，激活后的Ras蛋白始終與GTP結合，并保持活化狀態，可以持續激活下游信號轉導[20]，通過Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK細胞轉導途徑，促進細胞不可控制的增殖、惡變，即該信號通路失控與腫瘤細胞的異常分化、惡性增殖、血管形成、凋亡受抑等密切相關[21]。本研究中K-Ras蛋白表達陽性率在結直腸癌組織中與其癌旁正常結直腸組織中表達差異無統計學意義（P >0.05），且其表達陽性率與腫瘤臨床分期、分化程度及淋巴結轉移亦均無關（P >0.05），其在結直腸癌發生、發展中的作用有待進一步研究。
新近的研究[22-24]發現，結直腸癌細胞的增殖是依賴多種基因的共同調控的結果。本研究中，結直腸癌組織中EGFR、K-Ras及BRAF蛋白表達陽性之間并無相關性，因此我們認為，EGFR、K-Ras及BRAF可能是相互獨立地影響著結直腸癌的進程，有待進一步進行研究。
