引用本文： 劉駁強, 冉江華, 李溫凱, 鄭克譜. 糖皮質激素應用對大鼠肝移植模型的意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(5): 552-555. doi: 10.7507/1007-9424.20160148 復制
大鼠肝移植作為研究缺血再灌注損傷、移植免疫、細胞再生等方面的可靠動物模型，對于移植相關課題的研究具有重要意義。因此，摸索如何建立高成活率的大鼠肝移植模型對于上述研究至關重要。本實驗采用Kamada等[1]的二袖套法進行肝上下腔靜脈及門靜脈吻合，成功建立大鼠肝移植模型，并初步探索激素使用在大鼠肝移植模型建立中的意義。
1 材料與方法
1.1 主要材料及動物分組
1.1.1 主要材料
①套管：門靜脈、肝下下腔靜脈分別選用5～7 G的血管介入外鞘，門靜脈套管內徑約0.20 cm，下腔靜脈套管內徑0.25～0.30 cm，膽管支撐管采用直徑0.9 mm的硬膜外導管制成約1 cm長的套管[2]。② 縫線：腹腔內結扎線采用4-0縫線，肝上下腔靜脈采用7-0的Prolene線縫合。③主要試劑：硫酸阿托品購自天通動保藥業，頭孢唑林鈉購自華潤九新藥業，氫化可的松購自金耀藥業，肝素鈉購自萬邦生化。
1.1.2 實驗動物及分組
200只體質量為220～240 g的雄性清潔級SD大鼠購于昆明醫科大學實驗動物中心，隨機將200只SD大鼠從1到200編號，奇數號作為實驗組，偶數號作為對照組，每組100只。供、受體配對時盡量使受體體質量比供體體質量重10%，各50只。
1.2 液體配制
灌注保存液：生理鹽水500 mL+肝素12 500 U×2支，混搖均勻[3]。沖洗液及驅血液均為生理鹽水。術后補液：5%碳酸氫鈉溶液+生理鹽水，體積比為1 : 1。
1.3 實驗方法
1.3.1 術前準備
術前禁食12 h，不禁水。用乙醇對手術器械進行消毒。實驗組術前30 min肌肉注射硫酸阿托品溶液0.1 mg/kg、頭孢唑林鈉0.3 g/kg及氫化可的松5 mg/kg。對照組術前30 min肌肉注射硫酸阿托品溶液0.1 mg/kg、頭孢唑林鈉0.3 g/kg及與實驗組的激素抗生素等量的生理鹽水。采用乙醚吸入麻醉，用棉球蘸取乙醚后置入50 mL離心管后密封管口以誘導麻醉。
1.3.2 供體手術
將大鼠于仰臥位固定，碘酒消毒后備皮。采用大“十”字切口開腹。撥開胃腸道，暴露腹主動脈及肝下下腔靜脈，用棉簽鈍性分離腹主動脈至髂總動脈分叉處，再從此處用灌注液針頭穿刺進入腹主動脈（圖 1），關閉輸液閥，待用。快速從胸壁剪開皮膚肌肉進入胸腔，用止血鉗夾閉降主動脈后剪斷胸腔段的下腔靜脈，打開輸液閥以2.5 mL/min的速度開始灌注。灌注的同時用0～4 ℃生理鹽水沖淋肝臟表面，待肝臟變為土黃色后可以開始進行分離操作（圖 2）。剪開鐮狀韌帶及左右三角韌帶，暴露肝上下腔靜脈及左膈下靜脈，游離左膈下靜脈近端，結扎遠端切斷。游離、結扎并切斷肝-食管下段靜脈叢。游離膽管，插入膽管支撐管后切斷（圖 3）。游離后切斷肝動脈以便游離門靜脈，近端結扎胃冠狀靜脈后遠端切斷，于脾靜脈水平切斷門靜脈。游離肝下下腔靜脈，結扎右腎靜脈、腰靜脈及右腎上腺靜脈并切斷，于髂總靜脈水平切斷下腔靜脈。盡量留長肝上下腔靜脈后沿膈肌環剪斷，膈肌環保留給供肝，將供肝置于裝有0～4 ℃保存液的培養皿中[4]。
圖1
示穿刺供體腹主動脈??圖2??示灌注后的供肝??圖3??示套膽管??圖4?示完成修整后的肝臟??圖5??示結扎受體肝動脈??圖6??示在受體完成吊線后的供體肝
供肝修整
用血管鉗夾住套管柄并固定于橡皮泥上，使套管位于所要套入血管的上方。將肝上下腔靜脈及門靜脈外翻包住套管，再用4-0縫線打結固定（圖 4）。分別從肝上下腔靜脈左右角由外向內穿過一根7-0的帶針線留待吻合。
受體手術
麻醉同前，將大鼠于仰臥位固定，胸部可墊一5 mL注射器以便暴露視野，碘酒消毒后備皮，用自恥骨聯合上方至劍突下的正中切口。自制拉鉤呈三角形闊視野，用棉簽將腸道撥出后覆以濕紗布包裹。切斷鐮狀韌帶及左右三角韌帶暴露肝上下腔靜脈，順時針進行操作。游離、兩端結扎并切斷左膈下靜脈、肝-食管下段靜脈叢。游離膽管并結扎最遠的匯入分支后將其切斷，保留1 cm的線頭。再盡量留長膽管后結扎保留1 cm的線頭切斷，從最遠分支匯入膽管的岔口套管。于門靜脈側游離肝動脈（圖 5），兩端結扎后中間切斷，至此，使門靜脈有約1.5 cm完全游離。游離肝下下腔靜脈使其有約1.5 cm完全游離。小心游離、結扎右腎上腺靜脈及腰靜脈。小心游離肝上下腔靜脈，切斷其后韌帶并穿過一根皮筋為無肝期做準備。夾閉肝下下腔靜脈及門靜脈開始無肝期。從門靜脈分岔處穿刺驅血，注入生理鹽水約3 mL，待驅血完成后提起皮筋再用血管夾連同一部分膈肌夾閉肝上下腔靜脈，抽出皮筋后切斷肝上下腔靜脈及肝下下腔靜脈移出受體肝臟。將供體肝臟置入受體肝臟位置后用之前的7-0帶針線從內往外穿刺受體肝上下腔靜脈并打結固定完成吊線（圖 6）。先從左往右連續縫合后壁，打結后從右往左縫合前壁，針距約2 mm，縫合完成前將沖洗液注入沖出氣泡，最后一針應超出吊線點，打結后結束肝上下腔靜脈吻合[5]。雙人配合插入門靜脈套管后打結固定，開放門靜脈夾結束無肝期。待肝下下腔靜脈套管有血液滴出時套入肝下下腔靜脈套管，打結固定后開放肝下下腔靜脈夾及肝上下腔靜脈夾。用溫生理鹽水沖洗凈腹腔后套入膽管支撐管，復位腸道，洗凈腹腔液體后關腹，根據術中出血情況酌情補液[6]，受體手術完成。
術后護理
術后用小太陽加熱復溫，單籠飼養，3 h后自由飲水，6 h自由進食，12 h后可與術后大鼠同籠飼養。術中記錄供體手術、修肝、受體手術時間及無肝期，術后記錄2組大鼠7 d內的存活情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件分析數據。計量資料采用均數±標準差（
2 結果
實驗組供體手術時間、修肝時間、受體手術時間及無肝期與對照組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
2組術中指標比較結果（n=50，min，實驗組術后第1 d肝上下腔靜脈吻合口出血1例，肺梗死1例；術后第3 d腸梗阻1例，門靜脈套管漏血1例；術后第6 d膽管梗阻1例；術后第7 d存活45例。對照組術后第1 d肝上下腔靜脈吻合口出血1例，腸道淤血2例，肺梗死2例，不明原因死亡5例；術后第2 d不明原因死亡8例；術后第4 d腸梗阻2例，門靜脈套管漏血1例，腹腔感染2例；術后第7 d存活27例。以上結果均通過大鼠死后尸體解剖獲得。
實驗組術后第1 d、第3 d、第7 d的成活率均分別明顯高于對照組 〔96% （48/50） 比80% （40/50），P < 0.05；92% （46/50）比72% （36/50），P < 0.05；90% （45/50） 比54% （27/50），P < 0.05〕，可以認為激素的使用可能提高大鼠肝移植模型的成活率。
3 討論
自1979年Kamada等[7]提出使用“袖套法”建立大鼠原位肝移植模型后，顯著提高了大鼠肝移植成功率。經過一段時間的摸索，研究者們[8-11]進一步改良了大鼠原位肝移植模型的建立方法，使得大鼠原位肝移植模型成為一個成熟且易實現的動物模型，其中的技術要點如供肝保存、肝上下腔靜脈吻合等都已有所探討，供肝的獲取也有所研究。而李軍等[12]的供肝快速切取法則側重于研究供肝的獲取對手術成功率的影響。史源等[13]和李萌等[14]創新性使用磁環進行血管吻合，極大地縮短了無肝期以及手術時間，開創了血管吻合新方法。
相對于肝移植模型的建立，臨床肝移植術后需更精心的治療[15, 16, 17]，其中免疫抑制治療[18-21]和抗感染治療[22-24]是重要組成部分。糖皮質激素作為最早使用的免疫抑制劑[25, 26]曾經扮演著不可或缺的角色，但由于其影響骨代謝等眾多副作用，隨著近年來他克莫司[27]、雷帕霉素等新藥物的開發其被逐漸替代。激素免疫抑制治療相對于非激素免疫抑制方案而言，其最大的弊端是免疫力下降、感染發生率[28]增加。
在臨床實踐中發現，糖皮質激素的應用對于肝臟功能的狀態有著極其重要的影響。李銳鋒等[29]研究了糖皮質激素在HBV相關性肝功能衰竭中起到的積極作用，該研究認為，糖皮質激素能阻止急性肝功能衰竭的發生，減輕肝損傷，改善肝功能，提高存活率，其原因是糖皮質激素促進了肝組織中P-gp的表達，而P-gp具有保護肝細胞的作用；此外，該研究還指出，糖皮質激素治療重度慢性乙型肝炎，能有效改善患者的肝功能、阻止疾病進展，其機制可能與其能顯著降低血清白介素-1α水平有關。這一結果可以對本研究的結論起到支持作用。我們在預實驗階段，從無肝期等眾多細節方面有明顯提升直到無明顯提升的時候，大鼠的生存時間并沒有明顯變化，因此嘗試性使用糖皮質激素，結果發現，生存時間明顯延長，最長者已近8個月。特別是相比于對照組中有13只不明原因死亡的大鼠，在使用過激素的實驗組沒有發生這種情況，推測是激素提高了大鼠對肝移植手術耐受力的作用。糖皮質激素具有抗炎、抗過敏、免疫抑制、抗微生物毒素和抗休克作用，在移植手術中使用所表現出來即是增強手術耐受力[30]。
本研究采用單中心隨機對照研究驗證糖皮質激素應用對于大鼠肝移植模型存活率的影響，結果顯示，糖皮質激素應用可有效提高肝移植術后大鼠存活率。
大鼠肝移植作為研究缺血再灌注損傷、移植免疫、細胞再生等方面的可靠動物模型，對于移植相關課題的研究具有重要意義。因此，摸索如何建立高成活率的大鼠肝移植模型對于上述研究至關重要。本實驗采用Kamada等[1]的二袖套法進行肝上下腔靜脈及門靜脈吻合，成功建立大鼠肝移植模型，并初步探索激素使用在大鼠肝移植模型建立中的意義。
1 材料與方法
1.1 主要材料及動物分組
1.1.1 主要材料
①套管：門靜脈、肝下下腔靜脈分別選用5～7 G的血管介入外鞘，門靜脈套管內徑約0.20 cm，下腔靜脈套管內徑0.25～0.30 cm，膽管支撐管采用直徑0.9 mm的硬膜外導管制成約1 cm長的套管[2]。② 縫線：腹腔內結扎線采用4-0縫線，肝上下腔靜脈采用7-0的Prolene線縫合。③主要試劑：硫酸阿托品購自天通動保藥業，頭孢唑林鈉購自華潤九新藥業，氫化可的松購自金耀藥業，肝素鈉購自萬邦生化。
1.1.2 實驗動物及分組
200只體質量為220～240 g的雄性清潔級SD大鼠購于昆明醫科大學實驗動物中心，隨機將200只SD大鼠從1到200編號，奇數號作為實驗組，偶數號作為對照組，每組100只。供、受體配對時盡量使受體體質量比供體體質量重10%，各50只。
1.2 液體配制
灌注保存液：生理鹽水500 mL+肝素12 500 U×2支，混搖均勻[3]。沖洗液及驅血液均為生理鹽水。術后補液：5%碳酸氫鈉溶液+生理鹽水，體積比為1 : 1。
1.3 實驗方法
1.3.1 術前準備
術前禁食12 h，不禁水。用乙醇對手術器械進行消毒。實驗組術前30 min肌肉注射硫酸阿托品溶液0.1 mg/kg、頭孢唑林鈉0.3 g/kg及氫化可的松5 mg/kg。對照組術前30 min肌肉注射硫酸阿托品溶液0.1 mg/kg、頭孢唑林鈉0.3 g/kg及與實驗組的激素抗生素等量的生理鹽水。采用乙醚吸入麻醉，用棉球蘸取乙醚后置入50 mL離心管后密封管口以誘導麻醉。
1.3.2 供體手術
將大鼠于仰臥位固定，碘酒消毒后備皮。采用大“十”字切口開腹。撥開胃腸道，暴露腹主動脈及肝下下腔靜脈，用棉簽鈍性分離腹主動脈至髂總動脈分叉處，再從此處用灌注液針頭穿刺進入腹主動脈（圖 1），關閉輸液閥，待用。快速從胸壁剪開皮膚肌肉進入胸腔，用止血鉗夾閉降主動脈后剪斷胸腔段的下腔靜脈，打開輸液閥以2.5 mL/min的速度開始灌注。灌注的同時用0～4 ℃生理鹽水沖淋肝臟表面，待肝臟變為土黃色后可以開始進行分離操作（圖 2）。剪開鐮狀韌帶及左右三角韌帶，暴露肝上下腔靜脈及左膈下靜脈，游離左膈下靜脈近端，結扎遠端切斷。游離、結扎并切斷肝-食管下段靜脈叢。游離膽管，插入膽管支撐管后切斷（圖 3）。游離后切斷肝動脈以便游離門靜脈，近端結扎胃冠狀靜脈后遠端切斷，于脾靜脈水平切斷門靜脈。游離肝下下腔靜脈，結扎右腎靜脈、腰靜脈及右腎上腺靜脈并切斷，于髂總靜脈水平切斷下腔靜脈。盡量留長肝上下腔靜脈后沿膈肌環剪斷，膈肌環保留給供肝，將供肝置于裝有0～4 ℃保存液的培養皿中[4]。
圖1
示穿刺供體腹主動脈??圖2??示灌注后的供肝??圖3??示套膽管??圖4?示完成修整后的肝臟??圖5??示結扎受體肝動脈??圖6??示在受體完成吊線后的供體肝
供肝修整
用血管鉗夾住套管柄并固定于橡皮泥上，使套管位于所要套入血管的上方。將肝上下腔靜脈及門靜脈外翻包住套管，再用4-0縫線打結固定（圖 4）。分別從肝上下腔靜脈左右角由外向內穿過一根7-0的帶針線留待吻合。
受體手術
麻醉同前，將大鼠于仰臥位固定，胸部可墊一5 mL注射器以便暴露視野，碘酒消毒后備皮，用自恥骨聯合上方至劍突下的正中切口。自制拉鉤呈三角形闊視野，用棉簽將腸道撥出后覆以濕紗布包裹。切斷鐮狀韌帶及左右三角韌帶暴露肝上下腔靜脈，順時針進行操作。游離、兩端結扎并切斷左膈下靜脈、肝-食管下段靜脈叢。游離膽管并結扎最遠的匯入分支后將其切斷，保留1 cm的線頭。再盡量留長膽管后結扎保留1 cm的線頭切斷，從最遠分支匯入膽管的岔口套管。于門靜脈側游離肝動脈（圖 5），兩端結扎后中間切斷，至此，使門靜脈有約1.5 cm完全游離。游離肝下下腔靜脈使其有約1.5 cm完全游離。小心游離、結扎右腎上腺靜脈及腰靜脈。小心游離肝上下腔靜脈，切斷其后韌帶并穿過一根皮筋為無肝期做準備。夾閉肝下下腔靜脈及門靜脈開始無肝期。從門靜脈分岔處穿刺驅血，注入生理鹽水約3 mL，待驅血完成后提起皮筋再用血管夾連同一部分膈肌夾閉肝上下腔靜脈，抽出皮筋后切斷肝上下腔靜脈及肝下下腔靜脈移出受體肝臟。將供體肝臟置入受體肝臟位置后用之前的7-0帶針線從內往外穿刺受體肝上下腔靜脈并打結固定完成吊線（圖 6）。先從左往右連續縫合后壁，打結后從右往左縫合前壁，針距約2 mm，縫合完成前將沖洗液注入沖出氣泡，最后一針應超出吊線點，打結后結束肝上下腔靜脈吻合[5]。雙人配合插入門靜脈套管后打結固定，開放門靜脈夾結束無肝期。待肝下下腔靜脈套管有血液滴出時套入肝下下腔靜脈套管，打結固定后開放肝下下腔靜脈夾及肝上下腔靜脈夾。用溫生理鹽水沖洗凈腹腔后套入膽管支撐管，復位腸道，洗凈腹腔液體后關腹，根據術中出血情況酌情補液[6]，受體手術完成。
術后護理
術后用小太陽加熱復溫，單籠飼養，3 h后自由飲水，6 h自由進食，12 h后可與術后大鼠同籠飼養。術中記錄供體手術、修肝、受體手術時間及無肝期，術后記錄2組大鼠7 d內的存活情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件分析數據。計量資料采用均數±標準差（
2 結果
實驗組供體手術時間、修肝時間、受體手術時間及無肝期與對照組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
2組術中指標比較結果（n=50，min，實驗組術后第1 d肝上下腔靜脈吻合口出血1例，肺梗死1例；術后第3 d腸梗阻1例，門靜脈套管漏血1例；術后第6 d膽管梗阻1例；術后第7 d存活45例。對照組術后第1 d肝上下腔靜脈吻合口出血1例，腸道淤血2例，肺梗死2例，不明原因死亡5例；術后第2 d不明原因死亡8例；術后第4 d腸梗阻2例，門靜脈套管漏血1例，腹腔感染2例；術后第7 d存活27例。以上結果均通過大鼠死后尸體解剖獲得。
實驗組術后第1 d、第3 d、第7 d的成活率均分別明顯高于對照組 〔96% （48/50） 比80% （40/50），P < 0.05；92% （46/50）比72% （36/50），P < 0.05；90% （45/50） 比54% （27/50），P < 0.05〕，可以認為激素的使用可能提高大鼠肝移植模型的成活率。
3 討論
自1979年Kamada等[7]提出使用“袖套法”建立大鼠原位肝移植模型后，顯著提高了大鼠肝移植成功率。經過一段時間的摸索，研究者們[8-11]進一步改良了大鼠原位肝移植模型的建立方法，使得大鼠原位肝移植模型成為一個成熟且易實現的動物模型，其中的技術要點如供肝保存、肝上下腔靜脈吻合等都已有所探討，供肝的獲取也有所研究。而李軍等[12]的供肝快速切取法則側重于研究供肝的獲取對手術成功率的影響。史源等[13]和李萌等[14]創新性使用磁環進行血管吻合，極大地縮短了無肝期以及手術時間，開創了血管吻合新方法。
相對于肝移植模型的建立，臨床肝移植術后需更精心的治療[15, 16, 17]，其中免疫抑制治療[18-21]和抗感染治療[22-24]是重要組成部分。糖皮質激素作為最早使用的免疫抑制劑[25, 26]曾經扮演著不可或缺的角色，但由于其影響骨代謝等眾多副作用，隨著近年來他克莫司[27]、雷帕霉素等新藥物的開發其被逐漸替代。激素免疫抑制治療相對于非激素免疫抑制方案而言，其最大的弊端是免疫力下降、感染發生率[28]增加。
在臨床實踐中發現，糖皮質激素的應用對于肝臟功能的狀態有著極其重要的影響。李銳鋒等[29]研究了糖皮質激素在HBV相關性肝功能衰竭中起到的積極作用，該研究認為，糖皮質激素能阻止急性肝功能衰竭的發生，減輕肝損傷，改善肝功能，提高存活率，其原因是糖皮質激素促進了肝組織中P-gp的表達，而P-gp具有保護肝細胞的作用；此外，該研究還指出，糖皮質激素治療重度慢性乙型肝炎，能有效改善患者的肝功能、阻止疾病進展，其機制可能與其能顯著降低血清白介素-1α水平有關。這一結果可以對本研究的結論起到支持作用。我們在預實驗階段，從無肝期等眾多細節方面有明顯提升直到無明顯提升的時候，大鼠的生存時間并沒有明顯變化，因此嘗試性使用糖皮質激素，結果發現，生存時間明顯延長，最長者已近8個月。特別是相比于對照組中有13只不明原因死亡的大鼠，在使用過激素的實驗組沒有發生這種情況，推測是激素提高了大鼠對肝移植手術耐受力的作用。糖皮質激素具有抗炎、抗過敏、免疫抑制、抗微生物毒素和抗休克作用，在移植手術中使用所表現出來即是增強手術耐受力[30]。
本研究采用單中心隨機對照研究驗證糖皮質激素應用對于大鼠肝移植模型存活率的影響，結果顯示，糖皮質激素應用可有效提高肝移植術后大鼠存活率。
