引用本文： 任利, 王志鑫, 劉志勝, 候立朝, 陽丹才讓, 王海久, 周瀛, 溫浩, 樊海寧. 泡球蚴囊液對大鼠肝臟星狀細胞增殖的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(5): 517-520. doi: 10.7507/1007-9424.20160137 復制
泡型包蟲病是由多房棘球絳蟲幼蟲寄生于人體所致的一種致死性寄生蟲病，75%原發于肝臟[1]，若未經及時治療，5年和10年死亡率分別高達70%和93% [2]。肝包蟲病在世界各地均有報道，但以牧區多見。近年來，隨著移民和旅游的興盛，造成了大量的人口流動，很多非流行地區也出現了該病的報道[3, 4]，使得該病逐漸成為全球性的公共衛生問題[5, 6]。經篩查發現，我國部分地區仍然是泡型肝包蟲病的高發地區[7, 8]。目前，對于泡球蚴所致的肝損傷發生機制尚不清楚，其可能存在肝纖維化及膠原纖維組織過度沉積，而肝星狀細胞在肝損傷局部的病理性改變中發揮了重要作用，其激活被公認為是肝纖維化形成的中心環節[9]，所以多房棘球絳蟲原頭蚴對肝星狀細胞的影響可能是導致泡球蚴造成肝臟局部纖維化和肉芽腫形成的主要環節[10]，研究肝星狀細胞的激活和增殖對探索泡球蚴所致的肝損傷以及肉芽腫的發生機理具有特別重要的現實意義。本實驗利用不同濃度（0.00～0.90 mg/mL）泡球蚴囊液干預體外培養的肝星狀細胞，初步探討了泡球蚴囊液對肝星狀細胞增殖的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料
大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；泡球蚴囊液由新疆醫科大學提供。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及形態觀察
大鼠肝星狀細胞株HSC-T6使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM培養液，在5% CO2、37 ℃的細胞培養箱中培養。每隔24 h將細胞培養瓶從37 ℃ CO2培養箱（或溫箱）中取出，瓶口稍稍向上傾斜以免瓶內液體接觸瓶塞或流出瓶口，觀察細胞培養液的顏色和清澈度。然后，將培養瓶平穩地放在倒置顯微鏡載物臺上，用10×物鏡觀察細胞的輪廓、形狀和內部結構。
1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖能力
按5 000個/孔的密度接種HSC-T6細胞于96孔板中，6 h后觀察細胞貼壁融合達50%～60%，換無血清培養基進行饑餓24 h，然后加入不同濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.90 mg/mL）泡球蚴囊液繼續培養24 h后，吸出每孔中的培養基加入100 μL含10%的CCK-8的無血清培養基，并設置無細胞孔作為陰性對照，繼續孵育3 h，在酶標儀450 nm下檢測光密度值（OD值），分別進行5次重復，并以5次重復檢測的OD值繪制細胞生長曲線。
1.2.3 細胞周期分析
以細胞數3×105個/孔接種于6孔板中，孵育24 h后加入不同濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.90 mg/mL）泡球蚴囊液干預的HSC-T6細胞。24 h后收集上清及貼壁的細胞，并使用0.25%胰酶消化，800 r/min（r=6 cm），離心5 min，收集貼壁細胞，均置入同一離心管，離心后用預冷（4 ℃）磷酸鹽緩沖液重懸細胞團塊，并將該細胞懸液中加入預冷（4 ℃）的無水乙醇（確保最終無水乙醇的體積分數為70%），4 ℃過夜。次日將細胞懸液重新離心，棄去固定液上清，再用磷酸鹽緩沖液漂洗2遍，之后向細胞懸液中加入RNase A酶100 μL（終濃度為100 μg/mL），37 ℃水浴30 min，再加入400 μL碘化丙啶染液（終濃度為5 mg/mL），室溫避光染色130 min。經300目尼龍網過濾樣品后，流式細胞儀測定并分析細胞周期變化。
1.3 統計學方法
統計分析采用SPSS 19.0軟件。計量資料的統計使用均數±標準差，兩組間比較采用配對Student t檢驗。所有檢驗為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同濃度泡球蚴囊液培養條件下的肝星狀細胞的形態變化情況
利用不同濃度（0.00～0.90 mg/mL）泡球蚴囊液干預體外培養的肝星狀細胞，所有細胞均出現不同程度的形態學改變，細胞形狀變化呈長梭形，生出許多細長的偽足等。見圖 1。
圖1
不同濃度泡球蚴囊液對肝星狀細胞形態的影響（倒置顯微鏡×100）。1A：0 mg/mL；1B：0.10 mg/mL；1C：0.40 mg/mL；1D：0.90 mg/mL
2.2 不同濃度泡球蚴囊液對HSC-T6細胞增殖活性的影響
CCK-8實驗檢測結果發現，當泡球蚴囊液濃度<0.05 mg/mL時，與0 mg/mL濃度時相比，泡球蚴囊液干預對細胞增殖活性無明顯影響（P>0.05），而當泡球蚴囊液濃度>0.05 mg/mL時，隨著作用濃度的增加，細胞增殖活性則顯著增強（P<0.05）。見圖 2。
圖2
不同濃度泡球蚴囊液作用24 h后對HSC-T6細胞增殖活性的影響
2.3 不同濃度泡球蚴囊液對大鼠HSC-T6細胞周期分布的影響
流式細胞儀進一步檢測不同濃度泡球蚴囊液干預HSC-T6后細胞周期的分布情況，0.00～0.90 mg/mL濃度的泡球蚴囊液干預下，與0 mg/mL濃度時比較，隨著濃度升高，處于靜止期/DNA合成前期（G0/G1期）的HSC-T6細胞略有減少，處于DNA合成期（S期）的HSC-T6細胞數量略有增加，而處于DNA合成后期、細胞分裂期（G2/M期）的細胞數量顯著增多（P <0.05），說明HSC-T6細胞在受到泡球蚴囊液作用時，對細胞增殖有一定的促進作用。見圖 3。
圖3
不同濃度泡球蚴囊液作用24 h后對HSC-T6細胞周期分布的影響
3 討論
泡球蚴在中間宿主肝內以出芽的方式生長或浸潤式增殖，產生新囊泡，囊壁外角皮層很薄且常不完整，囊體與周圍組織間無明顯界限，囊液持續滲漏可與正常肝組織接觸，引起局部肝組織病變、增生、肝纖維化、變性和壞死，晚期似肝癌樣轉移或侵害周圍臟器，臨床上有“蟲癌”之稱，預后極差[9, 10]。泡球蚴在體內的長期存在及進展，除了“蟲源”因素（即包蟲囊壁、蟲體、囊液等自身保護因素外），還與其誘導的宿主免疫耐受密不可分。肝纖維化在泡型肝包蟲的發展中扮演著重要角色。研究[11, 12, 13]表明，肝星狀細胞位于肝竇Disse間隙，約占肝細胞總數的8%～13%，與肝細胞及肝竇內皮細胞直接接觸。正常情況下，肝星狀細胞是靜止的，它形態較小且細胞內含有脂質顆粒。在肝竇狀間隙微環境中，肝星狀細胞能夠生成多種細胞外基質，介導細胞間的接觸，并在促進血管生成、調控氧化應激反應方面發揮著重要的作用[14]。活化的肝星狀細胞發生了角色轉換，不再是正常肝臟中的貯脂細胞，而成為了肝臟中產生細胞外基質成分的主要細胞[15, 16]；除了在功能上的改變，肝星狀細胞還出現大量增殖的情況，細胞數量明顯增加，這意味著其細胞周期發生改變[17, 18]。所以肝星狀細胞的激活和增殖在肝纖維化的發生中起重要作用，治療肝硬化的手段也主要以肝星狀細胞作為靶細胞[19]。
研究[20, 21, 22]發現，肝星狀細胞除在肝臟損傷修復以及纖維化中發揮重要的作用外，其具備強大的免疫調節功能，活化的肝星狀細胞參與抗原提呈，可激活初始T細胞并促進其增殖，啟動免疫應答。既往研究[23, 24]已發現：①在小鼠胰島移植模型中，共植入的肝星狀細胞不僅可包繞在胰腺細胞周圍形成免疫防御屏障，還可通過B7-H1介導細胞凋亡從而抑制移植物內T淋巴細胞的浸潤；②肝星狀細胞以依賴IL-2的方式選擇性擴增同種異體小鼠nTreg[25]，而 干擾素-γ信號通路在其中發揮著重要作用[26]。此外，近來還有研究表明，肝星狀細胞還可參與Foxp3+Treg誘導分化[27]，并與髓系抑制細胞的分化相關[28]，進一步提示其在誘導機體免疫耐受方面的地位。故而可以得出結論：肝星狀細胞作為肝臟局部的抗原呈遞細胞，不僅能夠啟動免疫應答，還能誘導免疫耐受。
本研究利用泡球蚴囊液干預體外培養的大鼠HSC-T6細胞，觀察了HSC-T6細胞的形態變化、增殖能力和周期分布的改變。形態學觀察結果發現，利用不同濃度（0.00～0.90 mg/mL）泡球蚴囊液干預體外培養的肝星狀細胞，各組細胞均出現不同程度的形態學改變，細胞形狀變化呈長梭形，生出許多細長的偽足等，這種形態學改變提示HSC-T6細胞發生活化及增殖改變。進一步的CCK-8檢測結果也發現，當泡球蚴囊液濃度>0.05 mg/mL時，隨著作用濃度的增加，細胞增殖活性顯著增強（P <0.05），與形態學觀察結果相一致，證實泡球蚴囊液對肝星狀細胞增殖能力有顯著促進作用。
細胞的增殖分裂與細胞周期密不可分，后者包括G0/G1期、S期、G2/M期，其中S期的主要任務是完成對DNA以及與DNA組裝構成染色質等有關的組蛋白等的合成，而由于DNA在細胞生命周期中的核心地位，故S期、G2/M期細胞比例的多少可以反映細胞增殖活性的強弱。本研究利用流式細胞儀檢測泡球蚴囊液對體外培養大鼠肝星狀細胞周期分布比例的改變發現，隨著泡球蚴囊液濃度的增加，處于DNA合成期（S期）的HSC-T6細胞數量略有增加，而處于DNA合成后期、細胞分裂期（G2/M期）的細胞數量顯著增多，提示泡球蚴囊液對大鼠肝星狀細胞的增殖促進作用與其對細胞周期的影響密不可分。然而本研究僅涉及細胞層次的檢測，并未對其影響大鼠肝星狀細胞細胞周期分布的具體分子調控機制研究，故有待進一步通過從分子、基因等水平的變化檢測來探索其詳細機制。
綜上所述，泡球蚴囊液在體外可促進大鼠肝星狀細胞的增殖，其機制涉及細胞周期調控，該機制可能是泡球蚴誘導宿主肝組織纖維化等肝損傷的重要途徑，相關研究可能成為抗肝包蟲病及其相關纖維化提供新思路和切入點。
泡型包蟲病是由多房棘球絳蟲幼蟲寄生于人體所致的一種致死性寄生蟲病，75%原發于肝臟[1]，若未經及時治療，5年和10年死亡率分別高達70%和93% [2]。肝包蟲病在世界各地均有報道，但以牧區多見。近年來，隨著移民和旅游的興盛，造成了大量的人口流動，很多非流行地區也出現了該病的報道[3, 4]，使得該病逐漸成為全球性的公共衛生問題[5, 6]。經篩查發現，我國部分地區仍然是泡型肝包蟲病的高發地區[7, 8]。目前，對于泡球蚴所致的肝損傷發生機制尚不清楚，其可能存在肝纖維化及膠原纖維組織過度沉積，而肝星狀細胞在肝損傷局部的病理性改變中發揮了重要作用，其激活被公認為是肝纖維化形成的中心環節[9]，所以多房棘球絳蟲原頭蚴對肝星狀細胞的影響可能是導致泡球蚴造成肝臟局部纖維化和肉芽腫形成的主要環節[10]，研究肝星狀細胞的激活和增殖對探索泡球蚴所致的肝損傷以及肉芽腫的發生機理具有特別重要的現實意義。本實驗利用不同濃度（0.00～0.90 mg/mL）泡球蚴囊液干預體外培養的肝星狀細胞，初步探討了泡球蚴囊液對肝星狀細胞增殖的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料
大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；泡球蚴囊液由新疆醫科大學提供。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及形態觀察
大鼠肝星狀細胞株HSC-T6使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM培養液，在5% CO2、37 ℃的細胞培養箱中培養。每隔24 h將細胞培養瓶從37 ℃ CO2培養箱（或溫箱）中取出，瓶口稍稍向上傾斜以免瓶內液體接觸瓶塞或流出瓶口，觀察細胞培養液的顏色和清澈度。然后，將培養瓶平穩地放在倒置顯微鏡載物臺上，用10×物鏡觀察細胞的輪廓、形狀和內部結構。
1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖能力
按5 000個/孔的密度接種HSC-T6細胞于96孔板中，6 h后觀察細胞貼壁融合達50%～60%，換無血清培養基進行饑餓24 h，然后加入不同濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.90 mg/mL）泡球蚴囊液繼續培養24 h后，吸出每孔中的培養基加入100 μL含10%的CCK-8的無血清培養基，并設置無細胞孔作為陰性對照，繼續孵育3 h，在酶標儀450 nm下檢測光密度值（OD值），分別進行5次重復，并以5次重復檢測的OD值繪制細胞生長曲線。
1.2.3 細胞周期分析
以細胞數3×105個/孔接種于6孔板中，孵育24 h后加入不同濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.90 mg/mL）泡球蚴囊液干預的HSC-T6細胞。24 h后收集上清及貼壁的細胞，并使用0.25%胰酶消化，800 r/min（r=6 cm），離心5 min，收集貼壁細胞，均置入同一離心管，離心后用預冷（4 ℃）磷酸鹽緩沖液重懸細胞團塊，并將該細胞懸液中加入預冷（4 ℃）的無水乙醇（確保最終無水乙醇的體積分數為70%），4 ℃過夜。次日將細胞懸液重新離心，棄去固定液上清，再用磷酸鹽緩沖液漂洗2遍，之后向細胞懸液中加入RNase A酶100 μL（終濃度為100 μg/mL），37 ℃水浴30 min，再加入400 μL碘化丙啶染液（終濃度為5 mg/mL），室溫避光染色130 min。經300目尼龍網過濾樣品后，流式細胞儀測定并分析細胞周期變化。
1.3 統計學方法
統計分析采用SPSS 19.0軟件。計量資料的統計使用均數±標準差，兩組間比較采用配對Student t檢驗。所有檢驗為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同濃度泡球蚴囊液培養條件下的肝星狀細胞的形態變化情況
利用不同濃度（0.00～0.90 mg/mL）泡球蚴囊液干預體外培養的肝星狀細胞，所有細胞均出現不同程度的形態學改變，細胞形狀變化呈長梭形，生出許多細長的偽足等。見圖 1。
圖1
不同濃度泡球蚴囊液對肝星狀細胞形態的影響（倒置顯微鏡×100）。1A：0 mg/mL；1B：0.10 mg/mL；1C：0.40 mg/mL；1D：0.90 mg/mL
2.2 不同濃度泡球蚴囊液對HSC-T6細胞增殖活性的影響
CCK-8實驗檢測結果發現，當泡球蚴囊液濃度<0.05 mg/mL時，與0 mg/mL濃度時相比，泡球蚴囊液干預對細胞增殖活性無明顯影響（P>0.05），而當泡球蚴囊液濃度>0.05 mg/mL時，隨著作用濃度的增加，細胞增殖活性則顯著增強（P<0.05）。見圖 2。
圖2
不同濃度泡球蚴囊液作用24 h后對HSC-T6細胞增殖活性的影響
2.3 不同濃度泡球蚴囊液對大鼠HSC-T6細胞周期分布的影響
流式細胞儀進一步檢測不同濃度泡球蚴囊液干預HSC-T6后細胞周期的分布情況，0.00～0.90 mg/mL濃度的泡球蚴囊液干預下，與0 mg/mL濃度時比較，隨著濃度升高，處于靜止期/DNA合成前期（G0/G1期）的HSC-T6細胞略有減少，處于DNA合成期（S期）的HSC-T6細胞數量略有增加，而處于DNA合成后期、細胞分裂期（G2/M期）的細胞數量顯著增多（P <0.05），說明HSC-T6細胞在受到泡球蚴囊液作用時，對細胞增殖有一定的促進作用。見圖 3。
圖3
不同濃度泡球蚴囊液作用24 h后對HSC-T6細胞周期分布的影響
3 討論
泡球蚴在中間宿主肝內以出芽的方式生長或浸潤式增殖，產生新囊泡，囊壁外角皮層很薄且常不完整，囊體與周圍組織間無明顯界限，囊液持續滲漏可與正常肝組織接觸，引起局部肝組織病變、增生、肝纖維化、變性和壞死，晚期似肝癌樣轉移或侵害周圍臟器，臨床上有“蟲癌”之稱，預后極差[9, 10]。泡球蚴在體內的長期存在及進展，除了“蟲源”因素（即包蟲囊壁、蟲體、囊液等自身保護因素外），還與其誘導的宿主免疫耐受密不可分。肝纖維化在泡型肝包蟲的發展中扮演著重要角色。研究[11, 12, 13]表明，肝星狀細胞位于肝竇Disse間隙，約占肝細胞總數的8%～13%，與肝細胞及肝竇內皮細胞直接接觸。正常情況下，肝星狀細胞是靜止的，它形態較小且細胞內含有脂質顆粒。在肝竇狀間隙微環境中，肝星狀細胞能夠生成多種細胞外基質，介導細胞間的接觸，并在促進血管生成、調控氧化應激反應方面發揮著重要的作用[14]。活化的肝星狀細胞發生了角色轉換，不再是正常肝臟中的貯脂細胞，而成為了肝臟中產生細胞外基質成分的主要細胞[15, 16]；除了在功能上的改變，肝星狀細胞還出現大量增殖的情況，細胞數量明顯增加，這意味著其細胞周期發生改變[17, 18]。所以肝星狀細胞的激活和增殖在肝纖維化的發生中起重要作用，治療肝硬化的手段也主要以肝星狀細胞作為靶細胞[19]。
研究[20, 21, 22]發現，肝星狀細胞除在肝臟損傷修復以及纖維化中發揮重要的作用外，其具備強大的免疫調節功能，活化的肝星狀細胞參與抗原提呈，可激活初始T細胞并促進其增殖，啟動免疫應答。既往研究[23, 24]已發現：①在小鼠胰島移植模型中，共植入的肝星狀細胞不僅可包繞在胰腺細胞周圍形成免疫防御屏障，還可通過B7-H1介導細胞凋亡從而抑制移植物內T淋巴細胞的浸潤；②肝星狀細胞以依賴IL-2的方式選擇性擴增同種異體小鼠nTreg[25]，而 干擾素-γ信號通路在其中發揮著重要作用[26]。此外，近來還有研究表明，肝星狀細胞還可參與Foxp3+Treg誘導分化[27]，并與髓系抑制細胞的分化相關[28]，進一步提示其在誘導機體免疫耐受方面的地位。故而可以得出結論：肝星狀細胞作為肝臟局部的抗原呈遞細胞，不僅能夠啟動免疫應答，還能誘導免疫耐受。
本研究利用泡球蚴囊液干預體外培養的大鼠HSC-T6細胞，觀察了HSC-T6細胞的形態變化、增殖能力和周期分布的改變。形態學觀察結果發現，利用不同濃度（0.00～0.90 mg/mL）泡球蚴囊液干預體外培養的肝星狀細胞，各組細胞均出現不同程度的形態學改變，細胞形狀變化呈長梭形，生出許多細長的偽足等，這種形態學改變提示HSC-T6細胞發生活化及增殖改變。進一步的CCK-8檢測結果也發現，當泡球蚴囊液濃度>0.05 mg/mL時，隨著作用濃度的增加，細胞增殖活性顯著增強（P <0.05），與形態學觀察結果相一致，證實泡球蚴囊液對肝星狀細胞增殖能力有顯著促進作用。
細胞的增殖分裂與細胞周期密不可分，后者包括G0/G1期、S期、G2/M期，其中S期的主要任務是完成對DNA以及與DNA組裝構成染色質等有關的組蛋白等的合成，而由于DNA在細胞生命周期中的核心地位，故S期、G2/M期細胞比例的多少可以反映細胞增殖活性的強弱。本研究利用流式細胞儀檢測泡球蚴囊液對體外培養大鼠肝星狀細胞周期分布比例的改變發現，隨著泡球蚴囊液濃度的增加，處于DNA合成期（S期）的HSC-T6細胞數量略有增加，而處于DNA合成后期、細胞分裂期（G2/M期）的細胞數量顯著增多，提示泡球蚴囊液對大鼠肝星狀細胞的增殖促進作用與其對細胞周期的影響密不可分。然而本研究僅涉及細胞層次的檢測，并未對其影響大鼠肝星狀細胞細胞周期分布的具體分子調控機制研究，故有待進一步通過從分子、基因等水平的變化檢測來探索其詳細機制。
綜上所述，泡球蚴囊液在體外可促進大鼠肝星狀細胞的增殖，其機制涉及細胞周期調控，該機制可能是泡球蚴誘導宿主肝組織纖維化等肝損傷的重要途徑，相關研究可能成為抗肝包蟲病及其相關纖維化提供新思路和切入點。
