引用本文： 涂燦能, 陳建立, 陳俊卯, 王長友, 王曉濤, 張國志. 低分子肝素鈣聯合曲美他嗪對大鼠急性腸系膜靜脈血栓腸道平滑肌的保護作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(4): 416-420. doi: 10.7507/1007-9424.20160111 復制
急性腸系膜靜脈血栓（AMVT）是外科急重癥，近10年來，隨著影像學技術的快速發展，早期診斷技術的提高，迅速的外科干預及抗凝治療等措施，盡管AMVT的死亡率在下降，但病死率仍較高。既往陳建立等[1]建立了AMVT大鼠模型，模擬周圍型MVT和中央型MVT的病理生理過程，研究了AMVT腸道微循環障礙和氧自由基變化規律，提出靜脈瘀滯性損傷及微循環障礙是造成腸道損傷的主要因素；同時研究了低分子肝素治療AMVT的病理生理學機理，并對影響AMVT發生、發展及預后的相關因素做了多因素分析。本研究通過建立大鼠AMVT周圍型模型，以探討低分肝素鈣（LHC）抗凝基礎上聯合曲美他嗪在AMVT治療中對腸道平滑肌的保護作用及其可能的作用機理。
1 材料與方法
1.1 材料
曲美他嗪注射液購自天津施維雅公司，LHC購自葛蘭素史克（天津）有限公司，丙二醛（MDA）試劑盒、肌酸激酶（CK）試劑盒、考馬斯亮藍檢測蛋白試劑盒和三磷酸腺苷（ATP）試劑盒購自南京建成公司。健康雄性SD大鼠購自北京阜康生物科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組與處理
健康雄性SD大鼠120只，體質量250～300 g，先將大鼠編號（1～120號），應用隨機數字表法簡單隨機抽取大鼠分成3組，每組40只，即LHC組、LHC+曲美他嗪組（LHCT組）和生理鹽水組（NS組）。LHC組、LHCT組及NS組均制作AMVT模型，造模成功后，LHC組和LHCT組大鼠于術后0 h給予LHC（30 U/100 g）皮下注射，同時LHCT組大鼠經尾靜脈注射曲美他嗪（10 mg/kg），NS組大鼠經皮下注射生理鹽水0.2 mL/100 g；每間隔12 h重復給予藥物干預，直至術后72 h。
1.2.2 AMVT模型制備
采用結扎8 cm長回腸段腸系膜上靜脈及邊緣靜脈弓的方法建立AMVT模周圍型[1]。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 標本采集
大鼠分別均于造模術后6 h、12 h、24 h、48 h及72 h再次開腹，3組SD大鼠分別于造模術后各時相隨機抽取8只抽取下腔靜脈血3 mL，靜置10～20 min，高速離心機（3 500 r/min，r=13.5 cm）離心15 min后，采集血清-80℃保存待檢。采集血液標本后，處死大鼠，切取結扎靜脈回腸組織樣本3份，每份各200 mg，其中2份在冰生理鹽水中漂洗，濾紙擦干，稱重后-80℃保存待檢；另1份經9%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片、行HE染色。
1.3.2 血清MDA和CK水平以及回腸組織勻漿液ATP水平檢測
均采用ELISA法檢測，回腸組織勻漿液中的蛋白濃度用考馬斯亮藍試劑盒進行檢測, 操作按照各試劑盒操作說明進行。
1.3.3 回腸組織損傷病理學評分
取HE染色的回腸組織切片，請病理科專科醫師在光鏡下閱片，并行回腸病理組織損傷病理學評分。參照Mesemeche腸壁層次損傷分級為評分標準[2]：0分，小腸黏膜絨毛正常；1分，黏膜層部分壞死；2分，黏膜層全層壞死；3分，肌層部分壞死；4分，肌層全層壞死。
1.4 統計學方法
采用SPSS 21.0統計軟件。所有數據均以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組大鼠不同時間點血清MDA水平檢測結果
3組大鼠血清MDA水平隨著時間的延長逐漸升高，各時相間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHCT組各時間點血清MDA水平均明顯低于LHC組及NS組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHC組各時間點的MDA水平又均明顯低于NS組，差異也具有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠造模術后不同時相血清MDA水平檢測結果（nmol/mL，2.2 各組大鼠不同時間點血清CK水平檢測結果
3組大鼠血清CK水平隨著時間的延長逐漸升高，各時相間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHCT組各時間點血清CK水平均明顯低于LHC組及NS組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHC組各時間點血清CK水平又均明顯低于NS組，差異也具有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠造模術后不同時相血清CK含量檢測結果（U/mL，2.3 各組大鼠不同時間點回腸組織中ATP水平檢測結果
3組大鼠回腸組織中ATP水平隨著時間的延長逐漸降低，各時相間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHCT組各時間點回腸組織中ATP水平均明顯高于LHC組及NS組，其差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHC組各時間點回腸組織中ATP含量又高于NS組，其差異也有統計學意義（P < 0.05）。見表 3。
表3
各組大鼠造模術后不同時相回腸組織中ATP含量檢測結果（μmol/g prot，2.4 各組大鼠不同時間點回腸組織損傷病理學評分結果
參照Mesemeche腸壁層次損傷分級為評分標準，NS組大鼠腸壁組織損傷明顯，且隨著時間推移漸行性加重，術后24～48 h腸壁部分肌層壞死，術后48～72 h腸壁壞死層達全層，即發生透壁性梗死（圖 1）；LHC組腸壁平滑肌部分發生壞死（圖 2）；LHCT組腸道平滑肌未發生明顯損傷（圖 3）。3組大鼠回腸組織損傷病理學評分隨著時間的延長逐漸升高，各時相間比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；LHCT組各時間點回腸組織損傷病理學評分明顯低于LHC組及NS組，差異均有統計學意義（P < 0.05）, LHC組各時間點回腸組織損傷病理學評分又均明顯低于NS組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 4。
圖1
示NC組造模術后72 h結腸組織的病理學改變（HE×100） 圖 2 示LHC組術后72 h結腸組織的病理學改變（HE×100） 圖 3 示LHCT組術后72 h結腸組織的病理學改變（HE×100）
表4
各組大鼠造模術后不同時相回腸組織損傷病理學評分結果（分，3 討論
AMVT為腸缺血性疾病急腹癥之一，誤診率高，通常癥狀與體征不符[3]，AMVT的死亡率雖然有所下降，但病死率仍較高。外科手術是目前臨床上影響AMVT患者30 d死亡率最為重要的因素[4]；復發率高，大部分患者腹痛后30 d再次形成血栓的發生率為3%～40%[5]。66.7%的AMVT患者血液呈高凝狀態[6]，早期仍以抗凝為首選，因為抗凝治療可使阻塞的血管再通[7]，阻止腸系膜靜脈主干及其分支靜脈血栓的進一步擴大蔓延，從而可中止AMVT時腸道靜脈血栓的發展。我們發現[1]，不論是絞窄型MVT還是單純性MVT，早期即可造成腸黏膜脫落壞死。所不同的是，絞窄型MVT發生了腸道平滑肌的壞死，即透壁性梗死，需立即行手術治療，而單純性MVT沒有發生腸道平滑肌完整性破壞[8]。AMVT時建立側支循環僅需2～3 d，如果腸道順利通過2～3 d的側支建立期，則可不發生透壁性梗死，腸道功能就可以恢復[1]。因此，改善MVT預后的關鍵是對腸道平滑肌的保護，優化平滑肌細胞能量代謝，增加平滑肌中ATP含量，平滑細胞骨架得以維持，可防止平滑肌能量消耗導致的骨架解聚，若腸道骨架作用減弱，腸壁通透性增大，則可促進腸道細菌移位的發生[9-10]。能不能在肝素抗凝治療改善腸壁組織局部血供基礎上，采用保護腸道平滑肌的干預措施，從而改善預后？
筆者從心肌細胞能量代謝優化的研究中得到啟發。曲美他嗪為抗心肌缺血一線能量代謝調節劑，是當前臨床上治療缺血性心肌病的主要藥物[11-13]。在心肌細胞能量代謝方面，在缺血心肌中除具有促進葡萄糖完全代謝、抑制心肌細胞脂肪酸β氧化、提高心肌細胞對氧利用、促進葡萄糖氧化供能、增加心肌細胞高能磷酸鍵的產生和維持心肌存活的作用，曲美他嗪還可作用于部分細胞內代謝相關酶，可減少乳酸脫氫酶的釋放[14]，丙酮酸脫氫酶活性，間接加強葡萄糖氧化，減少細胞內的乳酸堆積，減輕細胞內酸中毒[15-16]，可抑制心肌組織中性粒細胞浸潤，抑制血小板聚集[17]，對縮小心肌梗塞面積起到有益的作用[18]，減少肌酸磷酸激酶釋放，對缺血心肌具有保護作用[14]，并可促進心肌細胞功能的恢復。曲美他嗪還可保護線粒體的正常功能，增加心肌細胞ATP含量[19] 20；減少氧化應激下心肌內及線粒體鈣超負荷, 因細胞內鈣超載激活中性蛋白酶（CANP），亦可引起細胞骨架斷裂、破壞[20-22]。曲美他嗪在不影響血流動力學的情況下可改善缺血心肌能量代謝[23]，改善心肌缺血狀態，提高療效[24]。王健等[25]對家兔缺血再灌注損傷的研究中發現，曲美他嗪可降低血清MDA和CK含量，增加心肌中ATP含量，具有清除自由基對心肌細胞損害的優勢，是一種治療缺血性心肌病應用較為廣泛的優化能量代謝劑。
本實驗結果發現，LHCT組血清MDA及CK水平以及回腸組織損傷病理學評分均明顯低于LHC組（P < 0.05），而回腸組織中ATP水平卻明顯明顯高于LHC組（P < 0.05），提示曲美他嗪可增加AMVT大鼠腸道平滑肌中ATP水平，減少脂質類過氧化反應終產物MDA的含量，減少血液中CK活性，減輕了腸道平滑肌損傷。進而推測，曲美他嗪可能以保護缺血心肌相似的作用機理保護了AMVT大鼠的缺血腸道平滑肌。既往研究[1]發現，腸道平滑肌層出現透壁性梗死常在AMVT發病后2～3 d，AMVT建立側支循環僅需2～3 d，曲美他嗪在早期治療AMVT可能會降低腸道穿孔的發生率，而AMVT死亡原因主要為延誤診斷的同時腸道平滑肌發生透壁性梗死并發腹膜炎。曲美他嗪在改善腸道平滑肌能量代謝，為腸道平滑肌度過側支循環代償期贏得更多的時間，可避免透壁性腸梗死的發生。
綜上所述，AMVT早期確診后，應盡早在使用低分子肝素鈣抗凝的同時聯合使用曲美他嗪，可改善腸道平滑肌代謝，保護腸道平滑肌，從而避免腸道平滑肌透壁性壞死發生。血管造影可發現栓塞血管周圍有側支循環形成[26]，后期側支循環得以充分建立[27-28]，因為后期側支循環建立后，代償充分者則不發生腸壞死[29]，預防腸穿孔及腹膜炎發生，從而縮短患者的住院時間，減少并發癥發生率、病死率及復發率，改善預后。二者聯合應用，既增加了腸道缺血平滑肌的血液供應，又優化腸道缺血平滑肌的能量代謝，起到了良好的協同作用。
急性腸系膜靜脈血栓（AMVT）是外科急重癥，近10年來，隨著影像學技術的快速發展，早期診斷技術的提高，迅速的外科干預及抗凝治療等措施，盡管AMVT的死亡率在下降，但病死率仍較高。既往陳建立等[1]建立了AMVT大鼠模型，模擬周圍型MVT和中央型MVT的病理生理過程，研究了AMVT腸道微循環障礙和氧自由基變化規律，提出靜脈瘀滯性損傷及微循環障礙是造成腸道損傷的主要因素；同時研究了低分子肝素治療AMVT的病理生理學機理，并對影響AMVT發生、發展及預后的相關因素做了多因素分析。本研究通過建立大鼠AMVT周圍型模型，以探討低分肝素鈣（LHC）抗凝基礎上聯合曲美他嗪在AMVT治療中對腸道平滑肌的保護作用及其可能的作用機理。
1 材料與方法
1.1 材料
曲美他嗪注射液購自天津施維雅公司，LHC購自葛蘭素史克（天津）有限公司，丙二醛（MDA）試劑盒、肌酸激酶（CK）試劑盒、考馬斯亮藍檢測蛋白試劑盒和三磷酸腺苷（ATP）試劑盒購自南京建成公司。健康雄性SD大鼠購自北京阜康生物科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組與處理
健康雄性SD大鼠120只，體質量250～300 g，先將大鼠編號（1～120號），應用隨機數字表法簡單隨機抽取大鼠分成3組，每組40只，即LHC組、LHC+曲美他嗪組（LHCT組）和生理鹽水組（NS組）。LHC組、LHCT組及NS組均制作AMVT模型，造模成功后，LHC組和LHCT組大鼠于術后0 h給予LHC（30 U/100 g）皮下注射，同時LHCT組大鼠經尾靜脈注射曲美他嗪（10 mg/kg），NS組大鼠經皮下注射生理鹽水0.2 mL/100 g；每間隔12 h重復給予藥物干預，直至術后72 h。
1.2.2 AMVT模型制備
采用結扎8 cm長回腸段腸系膜上靜脈及邊緣靜脈弓的方法建立AMVT模周圍型[1]。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 標本采集
大鼠分別均于造模術后6 h、12 h、24 h、48 h及72 h再次開腹，3組SD大鼠分別于造模術后各時相隨機抽取8只抽取下腔靜脈血3 mL，靜置10～20 min，高速離心機（3 500 r/min，r=13.5 cm）離心15 min后，采集血清-80℃保存待檢。采集血液標本后，處死大鼠，切取結扎靜脈回腸組織樣本3份，每份各200 mg，其中2份在冰生理鹽水中漂洗，濾紙擦干，稱重后-80℃保存待檢；另1份經9%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片、行HE染色。
1.3.2 血清MDA和CK水平以及回腸組織勻漿液ATP水平檢測
均采用ELISA法檢測，回腸組織勻漿液中的蛋白濃度用考馬斯亮藍試劑盒進行檢測, 操作按照各試劑盒操作說明進行。
1.3.3 回腸組織損傷病理學評分
取HE染色的回腸組織切片，請病理科專科醫師在光鏡下閱片，并行回腸病理組織損傷病理學評分。參照Mesemeche腸壁層次損傷分級為評分標準[2]：0分，小腸黏膜絨毛正常；1分，黏膜層部分壞死；2分，黏膜層全層壞死；3分，肌層部分壞死；4分，肌層全層壞死。
1.4 統計學方法
采用SPSS 21.0統計軟件。所有數據均以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組大鼠不同時間點血清MDA水平檢測結果
3組大鼠血清MDA水平隨著時間的延長逐漸升高，各時相間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHCT組各時間點血清MDA水平均明顯低于LHC組及NS組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHC組各時間點的MDA水平又均明顯低于NS組，差異也具有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠造模術后不同時相血清MDA水平檢測結果（nmol/mL，2.2 各組大鼠不同時間點血清CK水平檢測結果
3組大鼠血清CK水平隨著時間的延長逐漸升高，各時相間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHCT組各時間點血清CK水平均明顯低于LHC組及NS組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHC組各時間點血清CK水平又均明顯低于NS組，差異也具有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠造模術后不同時相血清CK含量檢測結果（U/mL，2.3 各組大鼠不同時間點回腸組織中ATP水平檢測結果
3組大鼠回腸組織中ATP水平隨著時間的延長逐漸降低，各時相間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHCT組各時間點回腸組織中ATP水平均明顯高于LHC組及NS組，其差異均有統計學意義（P < 0.05）；LHC組各時間點回腸組織中ATP含量又高于NS組，其差異也有統計學意義（P < 0.05）。見表 3。
表3
各組大鼠造模術后不同時相回腸組織中ATP含量檢測結果（μmol/g prot，2.4 各組大鼠不同時間點回腸組織損傷病理學評分結果
參照Mesemeche腸壁層次損傷分級為評分標準，NS組大鼠腸壁組織損傷明顯，且隨著時間推移漸行性加重，術后24～48 h腸壁部分肌層壞死，術后48～72 h腸壁壞死層達全層，即發生透壁性梗死（圖 1）；LHC組腸壁平滑肌部分發生壞死（圖 2）；LHCT組腸道平滑肌未發生明顯損傷（圖 3）。3組大鼠回腸組織損傷病理學評分隨著時間的延長逐漸升高，各時相間比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；LHCT組各時間點回腸組織損傷病理學評分明顯低于LHC組及NS組，差異均有統計學意義（P < 0.05）, LHC組各時間點回腸組織損傷病理學評分又均明顯低于NS組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 4。
圖1
示NC組造模術后72 h結腸組織的病理學改變（HE×100） 圖 2 示LHC組術后72 h結腸組織的病理學改變（HE×100） 圖 3 示LHCT組術后72 h結腸組織的病理學改變（HE×100）
表4
各組大鼠造模術后不同時相回腸組織損傷病理學評分結果（分，3 討論
AMVT為腸缺血性疾病急腹癥之一，誤診率高，通常癥狀與體征不符[3]，AMVT的死亡率雖然有所下降，但病死率仍較高。外科手術是目前臨床上影響AMVT患者30 d死亡率最為重要的因素[4]；復發率高，大部分患者腹痛后30 d再次形成血栓的發生率為3%～40%[5]。66.7%的AMVT患者血液呈高凝狀態[6]，早期仍以抗凝為首選，因為抗凝治療可使阻塞的血管再通[7]，阻止腸系膜靜脈主干及其分支靜脈血栓的進一步擴大蔓延，從而可中止AMVT時腸道靜脈血栓的發展。我們發現[1]，不論是絞窄型MVT還是單純性MVT，早期即可造成腸黏膜脫落壞死。所不同的是，絞窄型MVT發生了腸道平滑肌的壞死，即透壁性梗死，需立即行手術治療，而單純性MVT沒有發生腸道平滑肌完整性破壞[8]。AMVT時建立側支循環僅需2～3 d，如果腸道順利通過2～3 d的側支建立期，則可不發生透壁性梗死，腸道功能就可以恢復[1]。因此，改善MVT預后的關鍵是對腸道平滑肌的保護，優化平滑肌細胞能量代謝，增加平滑肌中ATP含量，平滑細胞骨架得以維持，可防止平滑肌能量消耗導致的骨架解聚，若腸道骨架作用減弱，腸壁通透性增大，則可促進腸道細菌移位的發生[9-10]。能不能在肝素抗凝治療改善腸壁組織局部血供基礎上，采用保護腸道平滑肌的干預措施，從而改善預后？
筆者從心肌細胞能量代謝優化的研究中得到啟發。曲美他嗪為抗心肌缺血一線能量代謝調節劑，是當前臨床上治療缺血性心肌病的主要藥物[11-13]。在心肌細胞能量代謝方面，在缺血心肌中除具有促進葡萄糖完全代謝、抑制心肌細胞脂肪酸β氧化、提高心肌細胞對氧利用、促進葡萄糖氧化供能、增加心肌細胞高能磷酸鍵的產生和維持心肌存活的作用，曲美他嗪還可作用于部分細胞內代謝相關酶，可減少乳酸脫氫酶的釋放[14]，丙酮酸脫氫酶活性，間接加強葡萄糖氧化，減少細胞內的乳酸堆積，減輕細胞內酸中毒[15-16]，可抑制心肌組織中性粒細胞浸潤，抑制血小板聚集[17]，對縮小心肌梗塞面積起到有益的作用[18]，減少肌酸磷酸激酶釋放，對缺血心肌具有保護作用[14]，并可促進心肌細胞功能的恢復。曲美他嗪還可保護線粒體的正常功能，增加心肌細胞ATP含量[19] 20；減少氧化應激下心肌內及線粒體鈣超負荷, 因細胞內鈣超載激活中性蛋白酶（CANP），亦可引起細胞骨架斷裂、破壞[20-22]。曲美他嗪在不影響血流動力學的情況下可改善缺血心肌能量代謝[23]，改善心肌缺血狀態，提高療效[24]。王健等[25]對家兔缺血再灌注損傷的研究中發現，曲美他嗪可降低血清MDA和CK含量，增加心肌中ATP含量，具有清除自由基對心肌細胞損害的優勢，是一種治療缺血性心肌病應用較為廣泛的優化能量代謝劑。
本實驗結果發現，LHCT組血清MDA及CK水平以及回腸組織損傷病理學評分均明顯低于LHC組（P < 0.05），而回腸組織中ATP水平卻明顯明顯高于LHC組（P < 0.05），提示曲美他嗪可增加AMVT大鼠腸道平滑肌中ATP水平，減少脂質類過氧化反應終產物MDA的含量，減少血液中CK活性，減輕了腸道平滑肌損傷。進而推測，曲美他嗪可能以保護缺血心肌相似的作用機理保護了AMVT大鼠的缺血腸道平滑肌。既往研究[1]發現，腸道平滑肌層出現透壁性梗死常在AMVT發病后2～3 d，AMVT建立側支循環僅需2～3 d，曲美他嗪在早期治療AMVT可能會降低腸道穿孔的發生率，而AMVT死亡原因主要為延誤診斷的同時腸道平滑肌發生透壁性梗死并發腹膜炎。曲美他嗪在改善腸道平滑肌能量代謝，為腸道平滑肌度過側支循環代償期贏得更多的時間，可避免透壁性腸梗死的發生。
綜上所述，AMVT早期確診后，應盡早在使用低分子肝素鈣抗凝的同時聯合使用曲美他嗪，可改善腸道平滑肌代謝，保護腸道平滑肌，從而避免腸道平滑肌透壁性壞死發生。血管造影可發現栓塞血管周圍有側支循環形成[26]，后期側支循環得以充分建立[27-28]，因為后期側支循環建立后，代償充分者則不發生腸壞死[29]，預防腸穿孔及腹膜炎發生，從而縮短患者的住院時間，減少并發癥發生率、病死率及復發率，改善預后。二者聯合應用，既增加了腸道缺血平滑肌的血液供應，又優化腸道缺血平滑肌的能量代謝，起到了良好的協同作用。
