引用本文： 劉元, 錢軍, 郭晨旭, 承澤農. 茯苓對裸鼠SGC-7901胃癌細胞移植瘤的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(3): 286-290. doi: 10.7507/1007-9424.20160079 復制
胃癌目前仍是最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前臨床上胃癌的治療主要是手術及術后化療，但基礎研究已開始轉向于中藥方面的研究。茯苓是我國傳統中藥，具有利水滲濕、養心安神、健脾、抗癌等作用，以往研究發現其對乳腺癌[2]、胰腺癌[3]、喉癌[4]等腫瘤細胞均較敏感。當前國內外就茯苓對胃癌裸鼠移植瘤療效的研究仍然較少，本實驗擬采用SGC-7901胃癌細胞建立裸鼠移植瘤模型，利用免疫組化及Western blot技術，來探究茯苓對移植瘤生長及其對凋亡蛋白等蛋白表達的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要試劑及設備
10只SPF級BALB/c-nu裸鼠購于維通利華實驗動物技術有限公司，均為雌性，4周齡，許可證號：SCXK（京）2012-0001；10只雌性新西蘭大白兔由蚌埠醫學院動物房提供（體質量約為2.0 kg）；SGC-7901胃癌細胞株購自南京凱基生物科技發展有限公司。主要試劑：RPMI-1640不完全培養液（含有雙抗，青霉素：80 U/mL；鏈霉素：0.08 mg/mL）、0.25%胰蛋白酶消化液、磷酸鹽緩沖液（PBS液）及胎牛血清（FBS）購于杭州四季青公司，兔抗人B細胞淋巴瘤基因-2 （B cell lymphoma 2，Bcl-2） /Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗購于Abcam公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠/兔IgG購于BIOSHARP公司，鼠抗人Bax蛋白單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2蛋白單克隆抗體、鼠抗人胱天蛋白酶-3 （Caspase-3）蛋白單克隆抗體、鼠抗人胱天蛋白酶-9 （Caspase-9）蛋白單克隆抗體及鼠抗人血管內皮生長因子（VEGF）單克隆抗體均購自杭州聯科生物股份有限公司，Western試劑盒購自碧云天公司，茯苓由蚌埠醫學院第一附屬醫院中藥房提供。主要設備：CX-201型垂直層流工作臺（蚌埠凈化設備廠）、Thermo 3111型CO2細胞培養箱（美國Thermo公司）、OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、Eppendorf Centrifuge 5810R低溫離心機（德國eppen-dorf公司）及LC-20AD高效液相色譜分析儀（日本島津公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 茯苓湯劑的熬制
稱取茯苓10 g，于20 mL蒸餾水內浸泡30 min后，加蒸餾水400 mL煮至150 mL；過濾出藥液，再加蒸餾水400 mL煮至150 mL，過濾出藥液；將兩次煎煮所得藥液合并，再次煮至150 mL，藥液濃度約為0.2 g/mL。于4 ℃冰箱保存備用。
1.2.2 細胞培養
細胞培養在37 ℃、5% CO2、95%濕度的恒溫培養箱中。每隔2天換液1次，當細胞鋪滿培養瓶底約90%時，予以1∶3傳代3次。
1.2.3 裸鼠接種細胞懸液的制備
取對數期生長細胞，以0.25%胰蛋白酶消化液消化3 min，4 ℃離心（1 000 r/min，r=17.3 cm，5 min），棄上清液；用PBS液重懸離心后的細胞，取0.1 mL稀釋10倍；用0.4%臺盼藍染色后，用血球計數板記數活細胞，當活細胞比例＞95%時，調整細胞濃度至5×106個/mL。
1.2.4 裸鼠移植瘤實驗
將10只裸鼠隨機分為2組（隨機數字表法）：空白對照組和茯苓組，每組5只。將細胞懸液混勻，取0.2 mL接種于裸鼠右腋部偏后方皮下；接種細胞24 h后，茯苓組予以0.5 mL茯苓、空白對照組予以0.5 mL生理鹽水灌胃，1次/d。查看裸鼠生長狀態和移植瘤的生長情況，測量（第1次測量為間隔5 d，之后每次均是間隔3 d）裸鼠移植瘤的長/短徑（a/b），計算瘤體體積V，V=a×b2/2。于第32天處死裸鼠，剝離瘤體，稱取瘤體重量，計算抑瘤率，抑瘤率= （空白對照組瘤體平均質量-茯苓組瘤體平均質量）/空白對照組瘤體平均質量×100%。
1.2.5 茯苓對SGC-7901胃癌細胞的影響
將10只新西蘭大白兔隨機（隨機數字表法）均分為空白對照組和茯苓組，根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”，用藥劑量按如下公式計算：家兔用藥量（g/kg ? d）=人日用劑量 （g/kg ? d）×0.007/1.5。2組大白兔分別給予茯苓和生理鹽水 〔14 mL/（kg ? d）〕灌胃，每次灌胃前禁食12 h、不禁水，連續灌胃2周，2次/d。末次灌胃后1 h，用1%水合氯醛催眠大白兔（具體量依據大白兔不再掙扎為止），施行無菌心臟采血，4 ℃離心（4 000 r/min，r=17.3 cm，60 min）后收集血清，過濾除菌，用EP管分裝，-20 ℃保存。利用高效液相色譜分析法[5]檢測血清中所含茯苓的濃度。將胃癌SGC-7901細胞以4 ℃離心（1 000 r/min，r=17.3 cm，5 min）后，調整細胞懸液濃度至1×106個/mL，分為2組，分別加入含10%茯苓的血清（因在進行細胞培養的時候所用的培養液是含10%的胎牛血清，所以茯苓組用所取出的含茯苓藥物的兔血清來代替正常細胞培養時的胎牛血清）和空白對照組血清（指用生理鹽水給予大白兔灌胃后的血清）的細胞培養液5 mL進行培養，于24 h和48 h時提取蛋白。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 免疫組化法檢測瘤體組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表達
將瘤組織在Carnoy固定液中固定，依次行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋及4 μm厚連續切片。將切片脫蠟水化，于pH=6.0的PBS液中微波加熱以修復抗原，用FBS液代替一抗做陰性對照。切片上滴1滴0.3% H2O2溶液，室溫下孵育15 min后，用PBS液沖洗5 min×3次；切片上滴加50 μL非免疫性動物血清，常溫下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL一抗4 ℃過夜后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL二抗，在常溫下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL三抗，室溫下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL新配置的DAB液，顯微鏡下控制發色，自來水沖洗終止顯色；行Mayer蘇木精復染、脫水透明及中性樹膠封片。結果判斷如下。①陽性細胞百分比（PP）：在高倍（400倍）顯微鏡下選擇5個不同視野，每個視野計數陽性細胞數2次，計算平均值，為該視野陽性細胞數，陽性細胞數與該視野中細胞總數的比值為PP。然后將5個視野的PP求平均值，作為該切片的PP。無陽性細胞記為0分，PP在10%及以下記為1分，11%～50%記為2分，51%～75%記為3分，＞75%記為4分。②染色強度（SI）：0分為染色陰性，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。將每張切片的PP和SI相乘得到該切片的免疫組化評分（IRS） [6]。
1.3.2 Western-blot法檢測胃癌細胞中Bcl-2及Bax的表達
分別在干預24和48 h后提取空白對照組和茯苓組胃癌細胞的蛋白，用BCA蛋白檢測方法定量后進行電泳、轉膜，分別加入1∶200稀釋的Bcl-2/Bax抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜后再加入1∶6 000稀釋的二抗，4 ℃孵育2 h后洗膜。應用Quantity one軟件（Bio-Rad）分析掃描蛋白條帶的光密度，取目的蛋白條帶的光密度值與相應β-actin光密度值之比值為其相對表達量。每組重復測量3次。
1.4 統計學方法
利用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 茯苓對裸鼠及移植瘤的影響
2組裸鼠一般情況較好，實驗過程中無裸鼠死亡。各裸鼠于接種細胞后5 d均可見移植瘤，隨后瘤體逐漸增大（圖 1）。第32天時，空白對照組〔（2 652.17±225.01） mm3〕 裸鼠的移植瘤體積大于茯苓組 〔（1 247.56±277.23） mm3〕，差異具有統計學意義（P＜0.050），見圖 2。處死裸鼠后，完整剝離出瘤體，稱瘤體質量，結果空白對照組 〔（2.48±0.21） g〕 裸鼠的瘤體質量大于茯苓組 〔（1.28±0.28） g〕，差異具有統計學意義（P＜0.001）。茯苓的抑瘤率為48.39%。
2.2 2組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表達
免疫組化檢測結果顯示，各蛋白染色為淡黃色、棕黃色、棕褐色不等，均在胞漿內著色（圖 3）。茯苓組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2和VEGF的表達均低于空白對照組（P＜0.050），而Bax、Caspase-3及Caspase-9 的表達均高于空白對照組（P＜0.050），見表 1。
表1
2組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表達（分，2.3 含藥血清干預后SGC-7901胃癌細胞中Bcl-2和Bax的表達
與空白對照組比較，24 h和48 h時茯苓組Bcl-2的表達水平均較低（P＜0.050），且茯苓組48 h時Bcl-2的表達水平低于24 h時（P＜0.050）；與空白對照組比較，24 h時茯苓組Bax的表達水平變化不明顯（P＞0.050），但48 h時Bax的表達水平高于空白對照組和24 h茯苓組（P＜0.050），見表 2和圖 4。
表2
2組SGC-7901胃癌細胞中Bcl-2和Bax的表達（3 討論
在基礎研究中，中藥對腫瘤的治療受到越來越多的關注，主要原因是其具有有效、副作用低、價廉等優點。隨著對中藥的不斷研究，其抗腫瘤的作用機制也得到進一步的了解，如對溶酶體的影響[7]、誘導腫瘤細胞凋亡[8]、 增強機體免疫系統[9]等。茯苓生于松樹根上，分布于我國大部分地區，為我國經典的傳統中藥，在中醫大部分的名方中都有茯苓的配伍，如四君子湯、桂枝茯苓湯、二陳湯等。
在實驗中，筆者發現，茯苓對SGC-7901胃癌細胞移植瘤的生長具有明顯的抑制作用。筆者進一步從腫瘤組織凋亡相關蛋白及VEGF入手，來研究茯苓對腫瘤生長的抑制機理。細胞凋亡是細胞程序性的死亡，其不僅僅是一種正常生理性過程，還與腫瘤、自身免疫性疾病等[10-11]有一定的關系。細胞凋亡開始是由Bcl-2蛋白家族引發細胞色素c通過膜通透性增加的線粒體，進入細胞質，發生級聯反應，隨之Caspase-9及Caspase-3被激活，促進細胞凋亡信號的傳導，進而引起細胞發生凋亡[12-14]。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的重要調節因子，根據功能作用可以分為抗凋亡蛋白（如Bcl-2）和促凋亡蛋白（如Bax），抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比例最終決定了在線粒體凋亡通路中細胞的死亡或存活[15-17]。Pietrantonio等[18]也證明，卡培他濱（希羅達）可以通過誘導Bax的表達而促進腫瘤細胞死亡。抗凋亡蛋白的過表達常常與腫瘤復發、不良預后及耐藥均有一定的關系[19]。Caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶家族，根據其在凋亡級聯反應中的作用位置分為起始Caspase（如Caspase-8及9）和效應Caspase（Caspase-3、6及7），其中Caspase-3和Caspase-9對細胞的凋亡起著關鍵性的作用[20-21]。VEGF也稱為血管通透因子，是可以促進血管內皮細胞分裂增殖及新生血管形成的一種蛋白質。腫瘤組織中的血管存在于腫瘤間質中，起著營養腫瘤實質的作用。關于胃癌[22]和宮頸癌[23]的研究表明，癌組織中VEGF的表達高于正常人。一些研究還表明，在實體腫瘤組織內，VEGF的表達與腫瘤進展有著直接的關系[24]，而且在患者預后方面起著重要的作用[25]。本實驗結果顯示，茯苓組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2和VEGF的表達均低于空白對照組，而Bax、Caspase-3及Caspase-9的表達均高于空白對照組。該結果提示，茯苓可以抑制Bcl-2表達而誘導Bax、Caspase-3及Caspase-9的表達，其可以通過改變Bcl-2和Bax的比例而觸發線粒體凋亡信號的傳導，引起腫瘤細胞凋亡；在體外細胞水平，隨著茯苓作用時間的延長，Bcl-2的表達水平逐漸降低，但Bax的表達水平在茯苓作用48 h時才升高較為明顯，表明茯苓含藥血清可以抑制細胞Bcl-2表達，誘導Bax表達，進一步驗證了裸鼠移植瘤免疫組化的結果；此外，茯苓可以抑制移植瘤組織中VEGF的表達，但是否會因此減少腫瘤新生血管的形成，使腫瘤實質得不到血供而抑制腫瘤的發展，本實驗尚不確定，筆者下一步將深入研究茯苓作用下VEGF在體內外實驗中的表達及其關系。
綜上所述，茯苓對移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，其作用機理與茯苓促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤VEGF的表達相關。由于目前對于茯苓的研究尚處于基礎實驗階段，其確切機理尚待探討，望不久可以應用于臨床治療。
胃癌目前仍是最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前臨床上胃癌的治療主要是手術及術后化療，但基礎研究已開始轉向于中藥方面的研究。茯苓是我國傳統中藥，具有利水滲濕、養心安神、健脾、抗癌等作用，以往研究發現其對乳腺癌[2]、胰腺癌[3]、喉癌[4]等腫瘤細胞均較敏感。當前國內外就茯苓對胃癌裸鼠移植瘤療效的研究仍然較少，本實驗擬采用SGC-7901胃癌細胞建立裸鼠移植瘤模型，利用免疫組化及Western blot技術，來探究茯苓對移植瘤生長及其對凋亡蛋白等蛋白表達的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要試劑及設備
10只SPF級BALB/c-nu裸鼠購于維通利華實驗動物技術有限公司，均為雌性，4周齡，許可證號：SCXK（京）2012-0001；10只雌性新西蘭大白兔由蚌埠醫學院動物房提供（體質量約為2.0 kg）；SGC-7901胃癌細胞株購自南京凱基生物科技發展有限公司。主要試劑：RPMI-1640不完全培養液（含有雙抗，青霉素：80 U/mL；鏈霉素：0.08 mg/mL）、0.25%胰蛋白酶消化液、磷酸鹽緩沖液（PBS液）及胎牛血清（FBS）購于杭州四季青公司，兔抗人B細胞淋巴瘤基因-2 （B cell lymphoma 2，Bcl-2） /Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗購于Abcam公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠/兔IgG購于BIOSHARP公司，鼠抗人Bax蛋白單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2蛋白單克隆抗體、鼠抗人胱天蛋白酶-3 （Caspase-3）蛋白單克隆抗體、鼠抗人胱天蛋白酶-9 （Caspase-9）蛋白單克隆抗體及鼠抗人血管內皮生長因子（VEGF）單克隆抗體均購自杭州聯科生物股份有限公司，Western試劑盒購自碧云天公司，茯苓由蚌埠醫學院第一附屬醫院中藥房提供。主要設備：CX-201型垂直層流工作臺（蚌埠凈化設備廠）、Thermo 3111型CO2細胞培養箱（美國Thermo公司）、OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、Eppendorf Centrifuge 5810R低溫離心機（德國eppen-dorf公司）及LC-20AD高效液相色譜分析儀（日本島津公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 茯苓湯劑的熬制
稱取茯苓10 g，于20 mL蒸餾水內浸泡30 min后，加蒸餾水400 mL煮至150 mL；過濾出藥液，再加蒸餾水400 mL煮至150 mL，過濾出藥液；將兩次煎煮所得藥液合并，再次煮至150 mL，藥液濃度約為0.2 g/mL。于4 ℃冰箱保存備用。
1.2.2 細胞培養
細胞培養在37 ℃、5% CO2、95%濕度的恒溫培養箱中。每隔2天換液1次，當細胞鋪滿培養瓶底約90%時，予以1∶3傳代3次。
1.2.3 裸鼠接種細胞懸液的制備
取對數期生長細胞，以0.25%胰蛋白酶消化液消化3 min，4 ℃離心（1 000 r/min，r=17.3 cm，5 min），棄上清液；用PBS液重懸離心后的細胞，取0.1 mL稀釋10倍；用0.4%臺盼藍染色后，用血球計數板記數活細胞，當活細胞比例＞95%時，調整細胞濃度至5×106個/mL。
1.2.4 裸鼠移植瘤實驗
將10只裸鼠隨機分為2組（隨機數字表法）：空白對照組和茯苓組，每組5只。將細胞懸液混勻，取0.2 mL接種于裸鼠右腋部偏后方皮下；接種細胞24 h后，茯苓組予以0.5 mL茯苓、空白對照組予以0.5 mL生理鹽水灌胃，1次/d。查看裸鼠生長狀態和移植瘤的生長情況，測量（第1次測量為間隔5 d，之后每次均是間隔3 d）裸鼠移植瘤的長/短徑（a/b），計算瘤體體積V，V=a×b2/2。于第32天處死裸鼠，剝離瘤體，稱取瘤體重量，計算抑瘤率，抑瘤率= （空白對照組瘤體平均質量-茯苓組瘤體平均質量）/空白對照組瘤體平均質量×100%。
1.2.5 茯苓對SGC-7901胃癌細胞的影響
將10只新西蘭大白兔隨機（隨機數字表法）均分為空白對照組和茯苓組，根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”，用藥劑量按如下公式計算：家兔用藥量（g/kg ? d）=人日用劑量 （g/kg ? d）×0.007/1.5。2組大白兔分別給予茯苓和生理鹽水 〔14 mL/（kg ? d）〕灌胃，每次灌胃前禁食12 h、不禁水，連續灌胃2周，2次/d。末次灌胃后1 h，用1%水合氯醛催眠大白兔（具體量依據大白兔不再掙扎為止），施行無菌心臟采血，4 ℃離心（4 000 r/min，r=17.3 cm，60 min）后收集血清，過濾除菌，用EP管分裝，-20 ℃保存。利用高效液相色譜分析法[5]檢測血清中所含茯苓的濃度。將胃癌SGC-7901細胞以4 ℃離心（1 000 r/min，r=17.3 cm，5 min）后，調整細胞懸液濃度至1×106個/mL，分為2組，分別加入含10%茯苓的血清（因在進行細胞培養的時候所用的培養液是含10%的胎牛血清，所以茯苓組用所取出的含茯苓藥物的兔血清來代替正常細胞培養時的胎牛血清）和空白對照組血清（指用生理鹽水給予大白兔灌胃后的血清）的細胞培養液5 mL進行培養，于24 h和48 h時提取蛋白。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 免疫組化法檢測瘤體組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表達
將瘤組織在Carnoy固定液中固定，依次行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋及4 μm厚連續切片。將切片脫蠟水化，于pH=6.0的PBS液中微波加熱以修復抗原，用FBS液代替一抗做陰性對照。切片上滴1滴0.3% H2O2溶液，室溫下孵育15 min后，用PBS液沖洗5 min×3次；切片上滴加50 μL非免疫性動物血清，常溫下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL一抗4 ℃過夜后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL二抗，在常溫下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL三抗，室溫下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL新配置的DAB液，顯微鏡下控制發色，自來水沖洗終止顯色；行Mayer蘇木精復染、脫水透明及中性樹膠封片。結果判斷如下。①陽性細胞百分比（PP）：在高倍（400倍）顯微鏡下選擇5個不同視野，每個視野計數陽性細胞數2次，計算平均值，為該視野陽性細胞數，陽性細胞數與該視野中細胞總數的比值為PP。然后將5個視野的PP求平均值，作為該切片的PP。無陽性細胞記為0分，PP在10%及以下記為1分，11%～50%記為2分，51%～75%記為3分，＞75%記為4分。②染色強度（SI）：0分為染色陰性，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。將每張切片的PP和SI相乘得到該切片的免疫組化評分（IRS） [6]。
1.3.2 Western-blot法檢測胃癌細胞中Bcl-2及Bax的表達
分別在干預24和48 h后提取空白對照組和茯苓組胃癌細胞的蛋白，用BCA蛋白檢測方法定量后進行電泳、轉膜，分別加入1∶200稀釋的Bcl-2/Bax抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜后再加入1∶6 000稀釋的二抗，4 ℃孵育2 h后洗膜。應用Quantity one軟件（Bio-Rad）分析掃描蛋白條帶的光密度，取目的蛋白條帶的光密度值與相應β-actin光密度值之比值為其相對表達量。每組重復測量3次。
1.4 統計學方法
利用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 茯苓對裸鼠及移植瘤的影響
2組裸鼠一般情況較好，實驗過程中無裸鼠死亡。各裸鼠于接種細胞后5 d均可見移植瘤，隨后瘤體逐漸增大（圖 1）。第32天時，空白對照組〔（2 652.17±225.01） mm3〕 裸鼠的移植瘤體積大于茯苓組 〔（1 247.56±277.23） mm3〕，差異具有統計學意義（P＜0.050），見圖 2。處死裸鼠后，完整剝離出瘤體，稱瘤體質量，結果空白對照組 〔（2.48±0.21） g〕 裸鼠的瘤體質量大于茯苓組 〔（1.28±0.28） g〕，差異具有統計學意義（P＜0.001）。茯苓的抑瘤率為48.39%。
2.2 2組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表達
免疫組化檢測結果顯示，各蛋白染色為淡黃色、棕黃色、棕褐色不等，均在胞漿內著色（圖 3）。茯苓組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2和VEGF的表達均低于空白對照組（P＜0.050），而Bax、Caspase-3及Caspase-9 的表達均高于空白對照組（P＜0.050），見表 1。
表1
2組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表達（分，2.3 含藥血清干預后SGC-7901胃癌細胞中Bcl-2和Bax的表達
與空白對照組比較，24 h和48 h時茯苓組Bcl-2的表達水平均較低（P＜0.050），且茯苓組48 h時Bcl-2的表達水平低于24 h時（P＜0.050）；與空白對照組比較，24 h時茯苓組Bax的表達水平變化不明顯（P＞0.050），但48 h時Bax的表達水平高于空白對照組和24 h茯苓組（P＜0.050），見表 2和圖 4。
表2
2組SGC-7901胃癌細胞中Bcl-2和Bax的表達（3 討論
在基礎研究中，中藥對腫瘤的治療受到越來越多的關注，主要原因是其具有有效、副作用低、價廉等優點。隨著對中藥的不斷研究，其抗腫瘤的作用機制也得到進一步的了解，如對溶酶體的影響[7]、誘導腫瘤細胞凋亡[8]、 增強機體免疫系統[9]等。茯苓生于松樹根上，分布于我國大部分地區，為我國經典的傳統中藥，在中醫大部分的名方中都有茯苓的配伍，如四君子湯、桂枝茯苓湯、二陳湯等。
在實驗中，筆者發現，茯苓對SGC-7901胃癌細胞移植瘤的生長具有明顯的抑制作用。筆者進一步從腫瘤組織凋亡相關蛋白及VEGF入手，來研究茯苓對腫瘤生長的抑制機理。細胞凋亡是細胞程序性的死亡，其不僅僅是一種正常生理性過程，還與腫瘤、自身免疫性疾病等[10-11]有一定的關系。細胞凋亡開始是由Bcl-2蛋白家族引發細胞色素c通過膜通透性增加的線粒體，進入細胞質，發生級聯反應，隨之Caspase-9及Caspase-3被激活，促進細胞凋亡信號的傳導，進而引起細胞發生凋亡[12-14]。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的重要調節因子，根據功能作用可以分為抗凋亡蛋白（如Bcl-2）和促凋亡蛋白（如Bax），抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比例最終決定了在線粒體凋亡通路中細胞的死亡或存活[15-17]。Pietrantonio等[18]也證明，卡培他濱（希羅達）可以通過誘導Bax的表達而促進腫瘤細胞死亡。抗凋亡蛋白的過表達常常與腫瘤復發、不良預后及耐藥均有一定的關系[19]。Caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶家族，根據其在凋亡級聯反應中的作用位置分為起始Caspase（如Caspase-8及9）和效應Caspase（Caspase-3、6及7），其中Caspase-3和Caspase-9對細胞的凋亡起著關鍵性的作用[20-21]。VEGF也稱為血管通透因子，是可以促進血管內皮細胞分裂增殖及新生血管形成的一種蛋白質。腫瘤組織中的血管存在于腫瘤間質中，起著營養腫瘤實質的作用。關于胃癌[22]和宮頸癌[23]的研究表明，癌組織中VEGF的表達高于正常人。一些研究還表明，在實體腫瘤組織內，VEGF的表達與腫瘤進展有著直接的關系[24]，而且在患者預后方面起著重要的作用[25]。本實驗結果顯示，茯苓組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2和VEGF的表達均低于空白對照組，而Bax、Caspase-3及Caspase-9的表達均高于空白對照組。該結果提示，茯苓可以抑制Bcl-2表達而誘導Bax、Caspase-3及Caspase-9的表達，其可以通過改變Bcl-2和Bax的比例而觸發線粒體凋亡信號的傳導，引起腫瘤細胞凋亡；在體外細胞水平，隨著茯苓作用時間的延長，Bcl-2的表達水平逐漸降低，但Bax的表達水平在茯苓作用48 h時才升高較為明顯，表明茯苓含藥血清可以抑制細胞Bcl-2表達，誘導Bax表達，進一步驗證了裸鼠移植瘤免疫組化的結果；此外，茯苓可以抑制移植瘤組織中VEGF的表達，但是否會因此減少腫瘤新生血管的形成，使腫瘤實質得不到血供而抑制腫瘤的發展，本實驗尚不確定，筆者下一步將深入研究茯苓作用下VEGF在體內外實驗中的表達及其關系。
綜上所述，茯苓對移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，其作用機理與茯苓促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤VEGF的表達相關。由于目前對于茯苓的研究尚處于基礎實驗階段，其確切機理尚待探討，望不久可以應用于臨床治療。
