引用本文： 魏晰麟, 周忠笑, 張健, 邊剛, 李金暉. Hedgehog信號通路蛋白Ptch1和Gli1在膽管癌組織中的表達及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(1): 70-74. doi: 10.7507/1007-9424.20160018 復制
大多數膽管癌是高、中、低分化腺癌，很少有其他組織學類型。所有類型的膽管癌首選手術治療，但要考慮腫瘤是否侵犯了血管和淋巴結。膽管癌的高度促結蹄組織增生能力、豐富的腫瘤微環境及異質性決定了其對治療的耐藥性[1]。針對該基因進行靶向治療可提高患者的生存率，但很難找到實體瘤的治療方法。在膽管癌分子機理中，一些信號通路在細胞的生長發育過程中發揮重要作用并可調節膽管的形成[2]，對膽管癌的生物學過程及靶向治療具有重要意義。
Hedgehog (Hh)信號通路是胚胎發育過程中各種組織生長和圖式發育及成人組織穩態必不可少的一個重要的發育信號通路[3]。該信號功能失常與諸如先天畸形、癌癥等許多人類疾病相關。有實驗研究[4]表明，Hh信號途徑在膽管癌中也起重要作用，抑制該途徑可抑制腫瘤的生長。目前在對消化道腫瘤的研究中，發現絕大部分腫瘤(包括起源于食管、胃、膽管以及胰腺的腫瘤)中Hh通路的活性是增加的，Ptch1和Gli1蛋白呈高表達狀態[5]。本研究擬檢測膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達情況，并同癌旁組織進行比較，分析蛋白表達率與膽管癌臨床病理學特征的相關性，旨在為膽管癌的臨床診斷、治療及預后提供依據。
1 資料與方法
1.1 主要試劑
免疫組化SP試劑盒購自武漢博士德生物公司，一抗兔抗人Gli1抗體及羊抗人Ptch1抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗均購自武漢凌飛生物工程公司。
1.2 研究對象
選取2012年1月至2013年12月期間沈陽醫學院附屬中心醫院普外科行膽管癌手術患者62例，男37例，女25例；年齡年齡(57.7±10.4)歲(32～78)歲。按照TNM分期[6]：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期22例；其中上段膽管癌39例，中段膽管癌10例，下段膽管癌13例；低分化癌36例，中分化癌15例，高分化癌11例。行根治性切除患者47例，肝門部姑息性手術15例；其中45例腫瘤未侵及肝實質者行肝門部膽管、膽總管及膽管切除、膽腸吻合術；17例匯合部膽管癌或肝總管癌者行肝方葉或加部分肝右前葉切除及肝門部膽管、肝外膽管切除、膽腸吻合術。
1.3 入組標準
取患者新鮮癌組織和癌旁組織標本均得到患者或家屬知情同意，且腫瘤標本均經病理學檢查證實診斷；所有患者術前均未進行放療、化療及其他抗腫瘤治療；術后可以進行隨訪至死亡患者。
1.4 檢測指標及方法
應用免疫組化方法檢測膽管癌組織及其癌旁組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達。所有標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，5μm厚切片，脫蠟、脫苯及水化后進行微波抗原修復，滴加羊抗人Ptch1和兔抗人Gli1抗體，2種抗體的工作濃度均為1 : 200，滴入后置于4℃冰箱過夜，分別按試劑盒說明進行HE染色和免疫組化染色。以PBS替代第一抗體作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。
1.5 結果判定[7 ]
倒置顯微鏡下觀察免疫組織化學染色照片，Ptch1定位于細胞膜或者細胞漿內，陽性染色為棕黃色；Gli1定位于細胞漿內，陽性染色為黃色或深棕黃色。陽性的染色強度分為+(淡黃色)，++(黃色)，+++(棕黃色)。于光鏡下隨機5個視野，計數1 000個細胞數，計算染色細胞所占的百分比，陽性細胞百分比< 10%為陰性，≥10%為陽性；陽性細胞百分比< 50%為低表達，≥50%為高表達。
1.6 統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件包對所得數據進行單因素方差分析。計數資料采用χ2檢驗；膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白表達的相關性分析采用配對資料Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 膽管癌及癌旁組織的病理學改變
HE染色顯示，癌細胞核染色質濃染，細胞形狀極不規則，排列松散。細胞質淡染或嗜堿性，纖維間質豐富，可見膽管黏膜下層浸潤，使膽管壁增厚、大量纖維組織增生，并向管外浸潤形成纖維性硬塊。而癌旁組織則少見纖維增生，細胞組織規則(圖 1)。
圖1
示膽管癌組織(1A)及其癌旁組織(1B)的病理學改變(HE×200)??圖 2示Ptch1和Gli1蛋白在膽管癌及其癌旁組織中的表達。2A：Ptch1蛋白在膽管癌組織中呈陽性表達(免疫組化染色×400)；2B：Ptch1蛋白在膽管癌癌旁組織中呈陰性表達(免疫組化染色×400)；2C：Gli1蛋白在膽管癌組織中呈陽性表達(免疫組化染色×400)；2D：Gli1蛋白在膽管癌癌旁組織中呈陰性表達(免疫組化染色×400)
2.2 膽管癌及其癌旁組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達檢測結果
Ptch1和Gli1蛋白在膽管癌組織中均呈高表達；Ptch1蛋白表達定位于細胞質，呈棕色至褐色，Gli1蛋白表達定位于細泡漿及細泡核內，均呈棕黃色(圖 2)。在膽管癌組織中，Ptch1蛋白表達陽性率為74.2% (46/62)，而癌旁組織中其表達陽性率為14.5% (9/62)，差異有統計學意義(χ2=26.54，P < 0.05)；Gli1蛋白在膽管癌組織中表達陽性率為88.7% (55/62)，在癌旁組織中其表達陽性率為9.7% (6/62)，兩者比較差異也有統計學意義(χ2=39.75，P < 0.05)。
2.3 膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白表達與其臨床病理學特征的關系
膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達與患者年齡、腫瘤大小及腫瘤部位均無相關性(P>0.05)，而與淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤分化程度、手術方式以及生存時間有關(P < 0.05)，見表 1。
表1
膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達與其臨床病理學特征的關系
2.4 膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白表達的相關性分析結果
經Spearman等級相關分析顯示，膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達呈正相關關系(rs=0.789，P < 0.001)。
3 討論
目前已有研究[8-9]證實，消化道腫瘤的發生與Hh信號通路異常激活有關。Jinawath等[10]研究發現，膽管癌7種細胞系(HuCCT1、HuH-28、MEC、TFK-1、RBE、TGBC24TKB和dKKU-M156)均表達Ptch1，Gli1也表達于大多數細胞系(除HuCCT-1和TFK-1)。Ptch1不僅是Hh信號的受體，也是Hh信號通路的目的基因，是參與信號通路重要的負反饋調節因子；而Gli1也是Hh信號通路下游的一個重要因子，起著承上啟下的關鍵性調控作用，Ptch1和Gli1的高表達是Hh信號通路的過度激活的重要特征[11-12]。近年來臨床研究[13-14]發現，肝癌組織中Ptch1和Gli1的mRNA轉錄水平相對正常肝組織分別增加65%和30%，Hh信號通路的異常激活存在于各種癌癥中。然而，Hh信號通路在膽管癌組織中表達的研究目前國內少有報道，因此本研究進行了試驗性探索，擬為膽管癌診斷及治療提供新途徑[15-16]。
本研究結果顯示，在癌旁組織中Ptch1蛋白和Gli1蛋白表達陽性率分別為14.5%和9.7%，但在膽管癌組織中Ptch1蛋白和Gli1蛋白的表達陽性率分別為74.2%和88.7%，均顯著高于癌旁組織中的表達，提示膽管癌的發生可能與Ptch1和Gli1蛋白的異常高表達有關, 與Hh信號通路異常激活有關，這與國外文獻[17-19]報道其在其他腫瘤組織表達結果相一致。本研究分析了膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達與其臨床病理特征的關系，結果發現：Ptch1和Gli1蛋白在膽管癌組織中的表達與患者年齡、腫瘤大小及腫瘤部位均無相關性(P > 0.05)，而與手術方式、腫瘤分化程度、淋巴結轉移狀況、TNM分期以及患者生存時間均有關(P < 0.05)。Ptch1和Gli1蛋白在低分化癌中的表達陽性率最高，中分化癌次之，高分化癌最低；在淋巴結轉移陽性癌組織中表達陽性率高，而淋巴結轉移陰性癌組織中表達陽性率低；在Ⅲ～Ⅳ期癌組織中表達陽性率高，而Ⅰ～Ⅱ期癌組織中表達陽性率低。該結果間接提示Hh信號通路可能與細胞增殖有關，在膽管癌的發生發展中起到了一定的作用[20-21]。進行根治性切除的患者兩種蛋白的表達陽性率要低于姑息性手術患者(P < 0.05)，且表達陽性率高的患者其生存時間短(P < 0.05)；從手術方式及術后生存可以看出，腫瘤分化程度越低，Ptch1和Gli1蛋白表達陽性率越高，與腫瘤分化程度越好，患者預后效果越好、生存率越高一致[22-23]。另外，本研究還分析了膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白表達的相關性, 結果發現，Ptch1和Gli1蛋白表達呈正相關關系(rs=0.789，P < 0.001)。本研究結果提示，膽管癌的發生發展過程中Hh信號通路可能呈現異常激活狀態，而這種異常的活性狀態很可能與Ptch1蛋白上調下游轉錄因子Gli1蛋白的高表達水平相關[24-26]。
綜上所述, Hh信號通路的異常激活可能直接參與了膽管癌的發生、轉移及浸潤發展，并且膽管癌中Hh信號通路異常激活的機理可能與Ptch1蛋白上調Gli1蛋白的高表達水平有關, 兩種蛋白的表達與患者術后生存時間相關，其在膽管癌發生發展過程中的具體作用機理還需要進行大樣本的mRNA及DNA水平的研究來證實。
大多數膽管癌是高、中、低分化腺癌，很少有其他組織學類型。所有類型的膽管癌首選手術治療，但要考慮腫瘤是否侵犯了血管和淋巴結。膽管癌的高度促結蹄組織增生能力、豐富的腫瘤微環境及異質性決定了其對治療的耐藥性[1]。針對該基因進行靶向治療可提高患者的生存率，但很難找到實體瘤的治療方法。在膽管癌分子機理中，一些信號通路在細胞的生長發育過程中發揮重要作用并可調節膽管的形成[2]，對膽管癌的生物學過程及靶向治療具有重要意義。
Hedgehog (Hh)信號通路是胚胎發育過程中各種組織生長和圖式發育及成人組織穩態必不可少的一個重要的發育信號通路[3]。該信號功能失常與諸如先天畸形、癌癥等許多人類疾病相關。有實驗研究[4]表明，Hh信號途徑在膽管癌中也起重要作用，抑制該途徑可抑制腫瘤的生長。目前在對消化道腫瘤的研究中，發現絕大部分腫瘤(包括起源于食管、胃、膽管以及胰腺的腫瘤)中Hh通路的活性是增加的，Ptch1和Gli1蛋白呈高表達狀態[5]。本研究擬檢測膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達情況，并同癌旁組織進行比較，分析蛋白表達率與膽管癌臨床病理學特征的相關性，旨在為膽管癌的臨床診斷、治療及預后提供依據。
1 資料與方法
1.1 主要試劑
免疫組化SP試劑盒購自武漢博士德生物公司，一抗兔抗人Gli1抗體及羊抗人Ptch1抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗均購自武漢凌飛生物工程公司。
1.2 研究對象
選取2012年1月至2013年12月期間沈陽醫學院附屬中心醫院普外科行膽管癌手術患者62例，男37例，女25例；年齡年齡(57.7±10.4)歲(32～78)歲。按照TNM分期[6]：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期22例；其中上段膽管癌39例，中段膽管癌10例，下段膽管癌13例；低分化癌36例，中分化癌15例，高分化癌11例。行根治性切除患者47例，肝門部姑息性手術15例；其中45例腫瘤未侵及肝實質者行肝門部膽管、膽總管及膽管切除、膽腸吻合術；17例匯合部膽管癌或肝總管癌者行肝方葉或加部分肝右前葉切除及肝門部膽管、肝外膽管切除、膽腸吻合術。
1.3 入組標準
取患者新鮮癌組織和癌旁組織標本均得到患者或家屬知情同意，且腫瘤標本均經病理學檢查證實診斷；所有患者術前均未進行放療、化療及其他抗腫瘤治療；術后可以進行隨訪至死亡患者。
1.4 檢測指標及方法
應用免疫組化方法檢測膽管癌組織及其癌旁組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達。所有標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，5μm厚切片，脫蠟、脫苯及水化后進行微波抗原修復，滴加羊抗人Ptch1和兔抗人Gli1抗體，2種抗體的工作濃度均為1 : 200，滴入后置于4℃冰箱過夜，分別按試劑盒說明進行HE染色和免疫組化染色。以PBS替代第一抗體作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。
1.5 結果判定[7 ]
倒置顯微鏡下觀察免疫組織化學染色照片，Ptch1定位于細胞膜或者細胞漿內，陽性染色為棕黃色；Gli1定位于細胞漿內，陽性染色為黃色或深棕黃色。陽性的染色強度分為+(淡黃色)，++(黃色)，+++(棕黃色)。于光鏡下隨機5個視野，計數1 000個細胞數，計算染色細胞所占的百分比，陽性細胞百分比< 10%為陰性，≥10%為陽性；陽性細胞百分比< 50%為低表達，≥50%為高表達。
1.6 統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件包對所得數據進行單因素方差分析。計數資料采用χ2檢驗；膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白表達的相關性分析采用配對資料Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 膽管癌及癌旁組織的病理學改變
HE染色顯示，癌細胞核染色質濃染，細胞形狀極不規則，排列松散。細胞質淡染或嗜堿性，纖維間質豐富，可見膽管黏膜下層浸潤，使膽管壁增厚、大量纖維組織增生，并向管外浸潤形成纖維性硬塊。而癌旁組織則少見纖維增生，細胞組織規則(圖 1)。
圖1
示膽管癌組織(1A)及其癌旁組織(1B)的病理學改變(HE×200)??圖 2示Ptch1和Gli1蛋白在膽管癌及其癌旁組織中的表達。2A：Ptch1蛋白在膽管癌組織中呈陽性表達(免疫組化染色×400)；2B：Ptch1蛋白在膽管癌癌旁組織中呈陰性表達(免疫組化染色×400)；2C：Gli1蛋白在膽管癌組織中呈陽性表達(免疫組化染色×400)；2D：Gli1蛋白在膽管癌癌旁組織中呈陰性表達(免疫組化染色×400)
2.2 膽管癌及其癌旁組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達檢測結果
Ptch1和Gli1蛋白在膽管癌組織中均呈高表達；Ptch1蛋白表達定位于細胞質，呈棕色至褐色，Gli1蛋白表達定位于細泡漿及細泡核內，均呈棕黃色(圖 2)。在膽管癌組織中，Ptch1蛋白表達陽性率為74.2% (46/62)，而癌旁組織中其表達陽性率為14.5% (9/62)，差異有統計學意義(χ2=26.54，P < 0.05)；Gli1蛋白在膽管癌組織中表達陽性率為88.7% (55/62)，在癌旁組織中其表達陽性率為9.7% (6/62)，兩者比較差異也有統計學意義(χ2=39.75，P < 0.05)。
2.3 膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白表達與其臨床病理學特征的關系
膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達與患者年齡、腫瘤大小及腫瘤部位均無相關性(P>0.05)，而與淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤分化程度、手術方式以及生存時間有關(P < 0.05)，見表 1。
表1
膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達與其臨床病理學特征的關系
2.4 膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白表達的相關性分析結果
經Spearman等級相關分析顯示，膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達呈正相關關系(rs=0.789，P < 0.001)。
3 討論
目前已有研究[8-9]證實，消化道腫瘤的發生與Hh信號通路異常激活有關。Jinawath等[10]研究發現，膽管癌7種細胞系(HuCCT1、HuH-28、MEC、TFK-1、RBE、TGBC24TKB和dKKU-M156)均表達Ptch1，Gli1也表達于大多數細胞系(除HuCCT-1和TFK-1)。Ptch1不僅是Hh信號的受體，也是Hh信號通路的目的基因，是參與信號通路重要的負反饋調節因子；而Gli1也是Hh信號通路下游的一個重要因子，起著承上啟下的關鍵性調控作用，Ptch1和Gli1的高表達是Hh信號通路的過度激活的重要特征[11-12]。近年來臨床研究[13-14]發現，肝癌組織中Ptch1和Gli1的mRNA轉錄水平相對正常肝組織分別增加65%和30%，Hh信號通路的異常激活存在于各種癌癥中。然而，Hh信號通路在膽管癌組織中表達的研究目前國內少有報道，因此本研究進行了試驗性探索，擬為膽管癌診斷及治療提供新途徑[15-16]。
本研究結果顯示，在癌旁組織中Ptch1蛋白和Gli1蛋白表達陽性率分別為14.5%和9.7%，但在膽管癌組織中Ptch1蛋白和Gli1蛋白的表達陽性率分別為74.2%和88.7%，均顯著高于癌旁組織中的表達，提示膽管癌的發生可能與Ptch1和Gli1蛋白的異常高表達有關, 與Hh信號通路異常激活有關，這與國外文獻[17-19]報道其在其他腫瘤組織表達結果相一致。本研究分析了膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白的表達與其臨床病理特征的關系，結果發現：Ptch1和Gli1蛋白在膽管癌組織中的表達與患者年齡、腫瘤大小及腫瘤部位均無相關性(P > 0.05)，而與手術方式、腫瘤分化程度、淋巴結轉移狀況、TNM分期以及患者生存時間均有關(P < 0.05)。Ptch1和Gli1蛋白在低分化癌中的表達陽性率最高，中分化癌次之，高分化癌最低；在淋巴結轉移陽性癌組織中表達陽性率高，而淋巴結轉移陰性癌組織中表達陽性率低；在Ⅲ～Ⅳ期癌組織中表達陽性率高，而Ⅰ～Ⅱ期癌組織中表達陽性率低。該結果間接提示Hh信號通路可能與細胞增殖有關，在膽管癌的發生發展中起到了一定的作用[20-21]。進行根治性切除的患者兩種蛋白的表達陽性率要低于姑息性手術患者(P < 0.05)，且表達陽性率高的患者其生存時間短(P < 0.05)；從手術方式及術后生存可以看出，腫瘤分化程度越低，Ptch1和Gli1蛋白表達陽性率越高，與腫瘤分化程度越好，患者預后效果越好、生存率越高一致[22-23]。另外，本研究還分析了膽管癌組織中Ptch1和Gli1蛋白表達的相關性, 結果發現，Ptch1和Gli1蛋白表達呈正相關關系(rs=0.789，P < 0.001)。本研究結果提示，膽管癌的發生發展過程中Hh信號通路可能呈現異常激活狀態，而這種異常的活性狀態很可能與Ptch1蛋白上調下游轉錄因子Gli1蛋白的高表達水平相關[24-26]。
綜上所述, Hh信號通路的異常激活可能直接參與了膽管癌的發生、轉移及浸潤發展，并且膽管癌中Hh信號通路異常激活的機理可能與Ptch1蛋白上調Gli1蛋白的高表達水平有關, 兩種蛋白的表達與患者術后生存時間相關，其在膽管癌發生發展過程中的具體作用機理還需要進行大樣本的mRNA及DNA水平的研究來證實。
