引用本文： 張乙川, 劉峰, 王俊, 徐杰, 楊茂輝, 李勁. 雷公藤紅素誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(1): 48-51. doi: 10.7507/1007-9424.20160013 復制
肝癌是常見的惡性腫瘤之一，是引起癌癥相關死亡的主要原因，目前對于肝癌并沒有有效的治療方案[1-3]。全世界每年大約有50萬人罹患肝癌，而我國占全世界肝癌發病的50%以上，可見肝癌的高發趨勢已十分嚴峻，應引起足夠的重視[4-5]。
雷公藤紅素是從中藥雷公藤的根皮當中提取出的一種三萜類的天然產物[6-8]。2006年，中美兩國科學家的經體內和體外抗癌機理研究證實，雷公藤紅素是一種有效的抗癌活性成分，從此掀起了雷公藤紅素抗癌研究的熱潮[9-11]。相繼發現雷公藤紅素對前列腺癌、子宮癌、乳腺癌等多種癌癥的癌細胞具有較強的殺傷作用[12-16]。然而，雷公藤紅素對肝癌細胞增殖及凋亡影響的研究較少，因此，本研究以人肝癌SMMC-7721細胞為對象，觀察了雷公藤紅素對人肝癌SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其可能的作用機理，為其臨床應用提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑
雷公藤紅素（純度> 98%）購于中國藥品生物制品檢定所，CCK-8試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI）購自GIBCO公司，Caspase-3活性檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，RPMI 1640培養基購于Hyclone公司，NF-κB p65抗體購于Cell Signaling Technology（Beverly，MA），β-actin（I-19）購于Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA）。
1.2 細胞培養
人肝癌細胞系SMMC-7721購于中國科學院上海細胞庫。將SMMC-7721細胞置于含RPMI 1640培養液（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的培養瓶中，于37°C、5% CO2的恒溫細胞培養箱中進行培養。
1.3 CCK-8實驗
采用RPMI 1 640培養液將SMMC-7721細胞密度調整至5×104個/mL，以100μL每孔將細胞懸液接種于96孔板中間孔，細胞貼壁之后分別向培養液中加入用培養基稀釋的濃度為1、2、及5μmol/L的雷公藤紅素溶液100μL，細胞接受藥物處理24、48及72 h后每孔加入10μL的CCK-8溶液，然后將細胞置于培養箱中繼續培養，4 h后采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度值（A值），計算細胞活力。
1.4 Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測
SMMC-7721細胞接受不同濃度的雷公藤紅素（1、2、5μmol/L）處理24 h之后，采用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀（FACSCalibur，BD公司，San Jose，CA）檢測細胞凋亡情況。
1.5 Caspase-3酶活性測定
SMMC-7721細胞接受2μmol/L的雷公藤紅素處理6、12及24 h之后，采用Caspase-3活性檢測試劑盒按照說明書對Caspase-3活性進行測定。采用空白對照組A值對藥物處理組A值進行歸一化。
1.6 Western blot實驗
SMMC-7721細胞接受2μmol/L的雷公藤紅素處理12、24及36 h之后，700×g離心10 min收集細胞，然后采用RIPA裂解液于4℃裂解15 min重懸細胞。采用BCA試劑盒對蛋白含量進行測定。然后采用Western blot法對NF-κB蛋白表達進行檢測。
1.7 裸鼠成瘤實驗
將24只6周齡裸鼠（由攀枝花學院提供，18～22 g、雌雄各半），于每只裸鼠右側腋腹壁皮下接種SMMC-7721細胞懸液0.2 mL（5×106/100μL）。每日觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤體積，腫瘤體積=（D×d×π）/6（D表示腫瘤的長徑，d表示腫瘤的短徑）。當腫瘤體積約為80 mm3時，采用完全隨機設計的方法的將裸鼠分為3組，每組8只。分別為對照組（含10%胎牛血清的DMEM培養液）、雷公藤紅素低劑量組（15 mg/kg)及雷公藤紅素高劑量組（30 mg/kg）。各組分別于腹腔注射相應的藥物（雷公藤紅素以含10%胎牛血清的DMEM培養液為溶劑），每次注射200μL，隔日注射，連續7次給藥。于給藥后的第16天處死裸鼠，剝離腫瘤，稱取腫瘤質量。計算抑瘤率：抑瘤率=（對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量）/對照組平均瘤質量×100%。
1.8 統計學方法
采用SPSS 20進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（
2 結果
2.1 雷公藤紅素對SMMC-7721細胞增殖的影響
結果見圖 1。由圖 1所示，雷公藤紅素可以抑制SMMC-7721細胞的增殖，并呈現出時間和劑量依賴性。當藥物濃度為2和5μmol/L時，呈現出明顯的抑制作用（P < 0.05）。
圖1
示不同濃度雷公藤紅素對SMMC-7721細胞增殖的影響。同時相與1μL組比較，* P < 0.05；同濃度不同時相間比較，△P < 0.05??圖 2?示不同濃度雷公藤紅素誘導SMMC-7721細胞凋亡結果。2A：對照組；2B：雷公藤紅素1μmol/L組；2C：雷公藤紅素2μmol/L組；2D：雷公藤紅素5μmol/L組??圖 3?示SMMC-7721細胞接受2μmol/L的雷公藤紅素處理6、12及24 h后Caspase-3活性變化。與6 h組比較，* P < 0.05
2.2 雷公藤紅素誘導SMMC-7721細胞凋亡情況
結果見圖 2。由圖 2所示，雷公藤紅素可以誘導SMMC-7721細胞出現凋亡，對照組細胞凋亡率為4.3%，而給藥組（1、2、5μmol/L）的細胞凋亡率分別為7.2%、34.8和37.3%。結果表明雷公藤紅素可以明顯促進SMMC-7721細胞凋亡，當濃度為2和5μmol/L時，SMMC-7721細胞出現明顯的凋亡（P < 0.05）。
圖4
示SMCC-7721細胞接受2μmol/L雷公藤紅素處理12、24及36 h后NF-κB蛋白表達檢測結果
2.3 雷公藤紅素對Caspase-3酶活性的影響
結果見圖 3。由圖 3所示，隨著藥物處理時間的延長，Caspase-3酶活性明顯增強（P < 0.05）。提示Caspase-3在雷公藤紅素誘導的細胞凋亡過程中可能發揮著重要的作用。
2.4 雷公藤紅素對NF-κB蛋白表達的影響
結果見圖 4。由圖 4所示，隨著藥物處理時間的延長，NF-κB蛋白表達呈現下調趨勢。提示雷公藤紅素可能通過抑制人肝癌SMCC-7721細胞中NF-κB蛋白的表達，從而達到抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡的作用。
2.5 雷公藤紅素對裸鼠種植瘤生長的影響
在雷公藤紅素對裸鼠種植瘤生長影響的實驗中發現，高劑量和低劑量的雷公藤紅素均可抑制種植瘤的生長，其中高劑量組與對照組比較差異具有統計學意義（P < 0.05）。該結果表明，雷公藤紅素可以顯著抑制裸鼠種植瘤生長，種植瘤體積和質量較對照組明顯減小，其中低劑量組抑瘤率為26.27%，高劑量組抑瘤率為56.24%，抑瘤效果明顯。見表 1。
表1
3組裸鼠種植瘤生長情況比較
3 討論
本研究發現，雷公藤紅素可以抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖并誘導其凋亡，并呈現一定的時間和劑量依賴性，同時裸鼠種植瘤實驗顯示雷公藤紅素可以明顯抑制裸鼠種植瘤的生長。
Caspase家族在細胞凋亡的過程中扮演著非常重要的角色，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在細胞凋亡信號傳導的途徑中發揮著重要的功能[17-19]。
本研究在細胞接受雷公藤紅素處理后，采用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測了Caspase-3活性，結果發現，Caspase-3活性明顯增強，提示細胞接受雷公藤紅素處理后，開始出現凋亡現象，雷公藤紅素可能通過激活Caspase-3來誘導細胞凋亡。
有研究[20-25]發現，NF-κB信號通路在癌細胞的增殖和凋亡過程中發揮著重要的作用，包括骨髓瘤細胞、肝癌細胞等腫瘤細胞。因此，本研究采用Western blot法檢測了SMMC-7721細胞NF-κB蛋白的表達，結果發現，隨著雷公藤紅素處理時間的延長，NF-κB蛋白表達呈現下調趨勢。表明雷公藤紅素可抑制人肝癌SMCC-7721細胞NF-κB蛋白的表達，從而達到抑制細胞增殖，促進細胞凋亡的作用。裸鼠種植瘤實驗顯示，30 mg/kg的雷公藤紅素可以明顯降低裸鼠種植瘤的體積和質量，最終抑制腫瘤的增長。
綜上所述，雷公藤紅素可以抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖并誘導其凋亡，裸鼠成瘤實驗顯示雷公藤紅素可以抑制裸鼠種植瘤的生長。這種作用的發揮可能是通過激活Caspase-3和抑制NF-κB通路誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡來實現的。
肝癌是常見的惡性腫瘤之一，是引起癌癥相關死亡的主要原因，目前對于肝癌并沒有有效的治療方案[1-3]。全世界每年大約有50萬人罹患肝癌，而我國占全世界肝癌發病的50%以上，可見肝癌的高發趨勢已十分嚴峻，應引起足夠的重視[4-5]。
雷公藤紅素是從中藥雷公藤的根皮當中提取出的一種三萜類的天然產物[6-8]。2006年，中美兩國科學家的經體內和體外抗癌機理研究證實，雷公藤紅素是一種有效的抗癌活性成分，從此掀起了雷公藤紅素抗癌研究的熱潮[9-11]。相繼發現雷公藤紅素對前列腺癌、子宮癌、乳腺癌等多種癌癥的癌細胞具有較強的殺傷作用[12-16]。然而，雷公藤紅素對肝癌細胞增殖及凋亡影響的研究較少，因此，本研究以人肝癌SMMC-7721細胞為對象，觀察了雷公藤紅素對人肝癌SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其可能的作用機理，為其臨床應用提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑
雷公藤紅素（純度> 98%）購于中國藥品生物制品檢定所，CCK-8試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI）購自GIBCO公司，Caspase-3活性檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，RPMI 1640培養基購于Hyclone公司，NF-κB p65抗體購于Cell Signaling Technology（Beverly，MA），β-actin（I-19）購于Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA）。
1.2 細胞培養
人肝癌細胞系SMMC-7721購于中國科學院上海細胞庫。將SMMC-7721細胞置于含RPMI 1640培養液（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的培養瓶中，于37°C、5% CO2的恒溫細胞培養箱中進行培養。
1.3 CCK-8實驗
采用RPMI 1 640培養液將SMMC-7721細胞密度調整至5×104個/mL，以100μL每孔將細胞懸液接種于96孔板中間孔，細胞貼壁之后分別向培養液中加入用培養基稀釋的濃度為1、2、及5μmol/L的雷公藤紅素溶液100μL，細胞接受藥物處理24、48及72 h后每孔加入10μL的CCK-8溶液，然后將細胞置于培養箱中繼續培養，4 h后采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度值（A值），計算細胞活力。
1.4 Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測
SMMC-7721細胞接受不同濃度的雷公藤紅素（1、2、5μmol/L）處理24 h之后，采用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀（FACSCalibur，BD公司，San Jose，CA）檢測細胞凋亡情況。
1.5 Caspase-3酶活性測定
SMMC-7721細胞接受2μmol/L的雷公藤紅素處理6、12及24 h之后，采用Caspase-3活性檢測試劑盒按照說明書對Caspase-3活性進行測定。采用空白對照組A值對藥物處理組A值進行歸一化。
1.6 Western blot實驗
SMMC-7721細胞接受2μmol/L的雷公藤紅素處理12、24及36 h之后，700×g離心10 min收集細胞，然后采用RIPA裂解液于4℃裂解15 min重懸細胞。采用BCA試劑盒對蛋白含量進行測定。然后采用Western blot法對NF-κB蛋白表達進行檢測。
1.7 裸鼠成瘤實驗
將24只6周齡裸鼠（由攀枝花學院提供，18～22 g、雌雄各半），于每只裸鼠右側腋腹壁皮下接種SMMC-7721細胞懸液0.2 mL（5×106/100μL）。每日觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤體積，腫瘤體積=（D×d×π）/6（D表示腫瘤的長徑，d表示腫瘤的短徑）。當腫瘤體積約為80 mm3時，采用完全隨機設計的方法的將裸鼠分為3組，每組8只。分別為對照組（含10%胎牛血清的DMEM培養液）、雷公藤紅素低劑量組（15 mg/kg)及雷公藤紅素高劑量組（30 mg/kg）。各組分別于腹腔注射相應的藥物（雷公藤紅素以含10%胎牛血清的DMEM培養液為溶劑），每次注射200μL，隔日注射，連續7次給藥。于給藥后的第16天處死裸鼠，剝離腫瘤，稱取腫瘤質量。計算抑瘤率：抑瘤率=（對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量）/對照組平均瘤質量×100%。
1.8 統計學方法
采用SPSS 20進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（
2 結果
2.1 雷公藤紅素對SMMC-7721細胞增殖的影響
結果見圖 1。由圖 1所示，雷公藤紅素可以抑制SMMC-7721細胞的增殖，并呈現出時間和劑量依賴性。當藥物濃度為2和5μmol/L時，呈現出明顯的抑制作用（P < 0.05）。
圖1
示不同濃度雷公藤紅素對SMMC-7721細胞增殖的影響。同時相與1μL組比較，* P < 0.05；同濃度不同時相間比較，△P < 0.05??圖 2?示不同濃度雷公藤紅素誘導SMMC-7721細胞凋亡結果。2A：對照組；2B：雷公藤紅素1μmol/L組；2C：雷公藤紅素2μmol/L組；2D：雷公藤紅素5μmol/L組??圖 3?示SMMC-7721細胞接受2μmol/L的雷公藤紅素處理6、12及24 h后Caspase-3活性變化。與6 h組比較，* P < 0.05
2.2 雷公藤紅素誘導SMMC-7721細胞凋亡情況
結果見圖 2。由圖 2所示，雷公藤紅素可以誘導SMMC-7721細胞出現凋亡，對照組細胞凋亡率為4.3%，而給藥組（1、2、5μmol/L）的細胞凋亡率分別為7.2%、34.8和37.3%。結果表明雷公藤紅素可以明顯促進SMMC-7721細胞凋亡，當濃度為2和5μmol/L時，SMMC-7721細胞出現明顯的凋亡（P < 0.05）。
圖4
示SMCC-7721細胞接受2μmol/L雷公藤紅素處理12、24及36 h后NF-κB蛋白表達檢測結果
2.3 雷公藤紅素對Caspase-3酶活性的影響
結果見圖 3。由圖 3所示，隨著藥物處理時間的延長，Caspase-3酶活性明顯增強（P < 0.05）。提示Caspase-3在雷公藤紅素誘導的細胞凋亡過程中可能發揮著重要的作用。
2.4 雷公藤紅素對NF-κB蛋白表達的影響
結果見圖 4。由圖 4所示，隨著藥物處理時間的延長，NF-κB蛋白表達呈現下調趨勢。提示雷公藤紅素可能通過抑制人肝癌SMCC-7721細胞中NF-κB蛋白的表達，從而達到抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡的作用。
2.5 雷公藤紅素對裸鼠種植瘤生長的影響
在雷公藤紅素對裸鼠種植瘤生長影響的實驗中發現，高劑量和低劑量的雷公藤紅素均可抑制種植瘤的生長，其中高劑量組與對照組比較差異具有統計學意義（P < 0.05）。該結果表明，雷公藤紅素可以顯著抑制裸鼠種植瘤生長，種植瘤體積和質量較對照組明顯減小，其中低劑量組抑瘤率為26.27%，高劑量組抑瘤率為56.24%，抑瘤效果明顯。見表 1。
表1
3組裸鼠種植瘤生長情況比較
3 討論
本研究發現，雷公藤紅素可以抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖并誘導其凋亡，并呈現一定的時間和劑量依賴性，同時裸鼠種植瘤實驗顯示雷公藤紅素可以明顯抑制裸鼠種植瘤的生長。
Caspase家族在細胞凋亡的過程中扮演著非常重要的角色，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在細胞凋亡信號傳導的途徑中發揮著重要的功能[17-19]。
本研究在細胞接受雷公藤紅素處理后，采用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測了Caspase-3活性，結果發現，Caspase-3活性明顯增強，提示細胞接受雷公藤紅素處理后，開始出現凋亡現象，雷公藤紅素可能通過激活Caspase-3來誘導細胞凋亡。
有研究[20-25]發現，NF-κB信號通路在癌細胞的增殖和凋亡過程中發揮著重要的作用，包括骨髓瘤細胞、肝癌細胞等腫瘤細胞。因此，本研究采用Western blot法檢測了SMMC-7721細胞NF-κB蛋白的表達，結果發現，隨著雷公藤紅素處理時間的延長，NF-κB蛋白表達呈現下調趨勢。表明雷公藤紅素可抑制人肝癌SMCC-7721細胞NF-κB蛋白的表達，從而達到抑制細胞增殖，促進細胞凋亡的作用。裸鼠種植瘤實驗顯示，30 mg/kg的雷公藤紅素可以明顯降低裸鼠種植瘤的體積和質量，最終抑制腫瘤的增長。
綜上所述，雷公藤紅素可以抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖并誘導其凋亡，裸鼠成瘤實驗顯示雷公藤紅素可以抑制裸鼠種植瘤的生長。這種作用的發揮可能是通過激活Caspase-3和抑制NF-κB通路誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡來實現的。
